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人T-bet基因的体外扩增及克隆和鉴定

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郝颖[1,2] 刘晓平[1] 徐勤[2] 魏小勇[2] 李宝金[1] 伊远学[1] 陶剑平[3] 张超[1] 张立兵[1]

[1]北京大学深圳医院肝胆腔镜外科,广东省深圳市518036 [2]广州中医药大学基础医学院,广东省广州市510405 [3]中山大学中山医学院,广东省广州市510089

《中国组织工程研究与临床康复》

2007年第11卷第23期

摘　　要:

目的：克隆人T-bet基因,构建其真核表达载体pEGFP-C1-T-bet。方法：实验于2005-07/2006-07在北京大学深圳医院中心实验室完成。①根据Genebank的人T-bet基因的全长cDNA序列,设计合成一对附加BglⅡ和SalⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②分离人外周血单个核细胞,提取RNA,用反转录-聚合酶链反应方法将T-bet的编码序列cDNA扩增,装入pMD18-T载体并送去测序。③BglⅡ＋SalⅠ双酶切质粒pMD18-T-bet,经琼脂糖电泳切胶回收T-bet片段,将T-bet插入载体pEGFP-C1构建成重组真核表达载体pEGFP-C1-T-bet。④用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果：①反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为1608bp的特异性扩增带。②测序结果证实,T-bet的编码序列和Genbank中T-bet mRNA序列相同。③双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论：实验成功扩增出人T-bet基因,构建了基因重组真核表达载体pEGFP-C1-T-bet,为探索T-bet基因对免疫细胞的调节作用和肿瘤基因治疗奠定了基础。