重组人瑞替普酶基因在山羊胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因座的定点整合

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王宏[2] 沈子龙[1] 奚涛[1] 李治国[2] 刘红如[2] 赵周英[2] 吴国祥[2] 成国祥[2]

[1]中国药科大学生命与科学技术学院,南京210009 [2]上海市转基因研究中心,上海201203

国际标准刊号：ISSN 1000-5048

国内统一刊号：CN 32-1157

摘　　要:

目的：利用体细胞基因打靶技术来获得定点整合有重组人瑞替普酶(rPA)的山羊胎儿成纤维细胞株。方法：构建了针对山羊β-酪蛋白基因座的定点打靶裁体，其上游同源臂为β-酪蛋白启动子端同时包含其信号肽编码区长约6．1kb的基因组片段，下游同源臂为3．3kb从β-酪蛋白外显子6至外显子9的基因组片段。rPA小基因起始密码子位于β酪蛋白信号肽编码区下游。将载体瞬时转染C127小鼠乳腺癌细胞，并通过激素进行诱导，酶联免疫吸附分析(EusA)检测细胞培养上清中的rPA表达量来验证裁体表达功能。将裁体通过电穿孔的方法转染同基因型的山羊胎儿成纤维细胞。利用G418和GANC进行药物筛选，并通过PCR和Southem杂交的方法进行基因组DNA检测。结果：获得了一株定点整合的细胞克隆，绝对基因打靶效率为2×10^7。结论：本实验结果为后续利用核移植技术制备乳腺生物反应器提供了坚实的实验基础。