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双萤光素酶共表达载体构建及特性研究

《病毒学报》2010年 第4期 | 付昕阳 王刚 田文洪 陈素云 董小岩 吴小兵 谭万龙   南方医科大学南方医院泌尿外科 广州510515 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室 北京100052 北京五加和分子医学研究所有限责任公司 北京100176 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室 温州325035
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摘 要:利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。将重组质粒瞬时转染BHK-21细胞,24h后在细胞上清液和细胞裂解液中均能检测到Gluc和Fluc的表达,其中Gluc98%以上分布在上清液中,而Fluc98%以上存在于细胞中,随时间延长Gluc活性在上清液中逐步增加,而细胞内Fluc活性则保持相对平稳。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒DNA,通过尾静脉微量采血(2.5μl/次)即可实时地监测体内Gluc的表达情况。活体成像结果显示,注射Gluc的底物腔肠素时小鼠明显表现为全身显像,显像在10min内迅速衰减;而注射Fluc的底物D-Luciferin时显像主要集中在肝脏,显像在30min内都比较稳定。本研究设计和构建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒实现了分泌型和非分泌型萤光素酶的共表达,既可以在不裂解细胞或处死动物的情况下直接在细胞培养上清或血液中动态检测Gluc的活性,又可以利用活体成像技术准确定位Fluc表达部位,比单一的萤光素酶报告载体在细胞标记和体内示踪研究方面更具优越性。
【分 类】【生物科学】 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
【关键词】 Gaussia萤光素酶 萤火虫萤光素酶 TaV2A 水动力注射 共表达
【出 处】 《病毒学报》2010年 第4期 276-282页 共7页
【收 录】 中文科技期刊数据库