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利用CRISPR/Cas9技术构建KMT2D基因敲除的人胚胎干细胞系

《生物技术》2020年 第3期 | 郭宁 吴方 汪捷 陈捷凯   中国科学院广州生物医药与健康研究院 广东广州510530 广州医科大学-中国科学院广州生物医药与健康研究院联合生命科学学院 广东广州511436
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摘 要:[目的]通过CRISPR/Cas9技术构建KMT2D SET结构域双等位基因敲除的人胚胎干细胞HN4细胞系。[方法]通过CRISPR在线设计工具在SET结构域两侧各设计多条sgRNA,利用T7EI选出效率最高的sgRNA,构建到pX330载体中,特异性扩增同源臂,分别构建到双抗性载体中作为Donor。将sgRNA与Donor共同电转至HN4细胞中,经过Puro和Hygro抗性筛选后,挑取单克隆,利用PCR,测序以及q-PCR鉴定等方法鉴定细胞的基因型。[结果]成功构建了靶向KMT2D SET Domain两端的sgRNA的表达质粒,并选择出切割效率最高的sgRNA。PCR鉴定结果显示,有8株细胞可同时扩增出Puro和Hygro两个目的片段,且无野生型条带。通过测序和序列比对确认KMT2D SET已被敲除,双等位基因分别被Puro和Hygro替换。q-PCR结果显示,mRNA层面上,SET Domain已经不表达,而其他位点则不受影响。[结论]成功构建pX330-sgRNA质粒,并验证其具有活性。成功构建了靶向KMT2D SET Domain的分别含有Puro和Hygro不同抗性的Donor。成功建立了稳定的KMT2D基因敲除的人胚胎干细胞系。
【分 类】【生物科学】 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程) > 基因工程的应用
【关键词】 CRISPR/Cas9 KMT2D 基因敲除 人胚胎干细胞 歌舞伎综合征
【出 处】 《生物技术》2020年 第3期 230-242页 共13页
【收 录】 中文科技期刊数据库