摘 要:
目的研究单纯疱疹病毒胸腺激酶（HSV—tk）基因系统对人眼球筋膜囊成纤维细胞（HTFs）增殖的抑制作用及其作用机制。方法构建含HSV—tk基因的逆转录病毒载体pL（tk）sN并转人包装细胞系PT67进行病毒包装，G418筛选抗性克隆并扩大培养收集病毒上清，测定病毒滴度。透射电镜观察鉴定病毒颗粒；聚合酶链反应（PCR）技术鉴定tk基因在病毒基因组中的整合。用病毒感染HTF8细胞，G418筛选并扩大培养，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术和免疫印迹法检测tk基因的表达；加不同浓度前药更昔洛韦（GCV）后，以MTY法检测tk基因对HTFs细胞增殖的抑制作用；采用Hoechst 33258染色及流式细胞仪检测凋亡细胞；电镜观察细胞形态学改变。结果酶切鉴定结果显示成功构建了逆转录病毒载体pL（tk）SN，电镜下包装细胞产生的病毒颗粒呈椭圆形。直径约100nm；病毒基因组中，PCR扩增出了tk基因；测得病毒滴度为4×10^7 cfu／ml；被转染的HTFs细胞，用RT—PCR及免疫印迹法检测到tk基因在mRNA与蛋白水平均有表达；HSV-tk—GCV系统对HTF8细胞增殖的抑制作用表现为剂量依赖性，5×10^-3g／L的GCV作用5d可将细胞全部杀死，IC50为6×10^-4g／L，HSV—tk—GCV系统对HTFs细胞的杀伤机制表现为坏死与凋亡，凋亡率随GCV浓度的升高而增加。结论HSV—tk基因系统能有效抑制人眼球筋膜囊成纤维细胞的增殖，作用机制表现为细胞的坏死与凋亡。
