摘 要:
目的：构建含人釉原蛋白（human Amelogenin，hAm）成熟肽编码区基因的慢病毒载体FUAmW，并观察在重组慢病毒感染的293T细胞中釉原蛋白的表达。方法：以构建好的重组质粒PQE30-Am为模板，采用PCR技术体外扩增hAm成熟肽编码区。将扩增产物与慢病毒载体转移质粒FUGW分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接，构建重组慢病毒载体，转移质粒FUAmW，并进行酶切及测序鉴定。通过聚乙烯亚胺（polytheylenimine，PEI）法将三质粒共转染293T细胞，包装得到重组慢病毒FUGW和FUAmW，然后分别离体感染293T细胞，培养72h后，经荧光显微镜下观察和流式细胞计数检测感染效率，采用RT—RCR及Western印迹法检测釉原蛋白基因的表达。结果：重组质粒经测序证实，插入片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全一致。流式细胞仪测得重组病毒感染293T细胞绿色荧光蛋白（green fluoresence protein，GFP）的阳性率为67.38％。RT—RCR和Western印迹均证实，重组慢病毒FUAmW感染的293T细胞能够表达人釉原蛋白。结论：成功构建携带人釉原蛋白成熟肽基因的重组慢病毒载体质粒，以293T细胞包装得到的重组人釉原蛋白病毒能感染真核细胞并获得表达。 (共6页)
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