木聚糖酶的基因资源发掘、分子改造及嗜碱机制研究-文献详情-维普官网

文献检索

任意字段

文献信息

任意字段
主题词
篇关摘
篇名
关键词
摘要
作者
第一作者
作者单位
刊名
中图分类号
学科分类号
DOI
基金

智能检索

高级检索

检索历史

木聚糖酶的基因资源发掘、分子改造及嗜碱机制研究认领

作者：

柏文琴

学位授予单位：

中国科学院大学

摘要：

本文从内蒙碱湖和温泉样品中克隆了5个全长木聚糖酶基因，对来源于嗜碱Bacillussp.SN5的两个木聚糖酶基因Xyn10A和Xyn11A进行了异源表达、纯化及性质分析。对Xyn11A的催化结构域Xyn11A-LC进行了结构解析和分子改造。系统研究了11家族木聚糖酶的嗜碱机制。论文取得的主要结果有:　　1.从内蒙古碱湖和温泉中分离筛选了54株产木聚糖酶的菌株，通过测定粗酶液的性质，选定4株菌Anoxybacillussp.R3、BacillusagaradhaerensDLTS1、Bacillussp.SN5和Bacillussp.CN4作为目标菌株，从中克隆了5个全长木聚糖酶基因。　　2.对两个来源于Bacillussp.SN5的木聚糖酶基因Xyn10A和Xyn11A进行了表征。　　Xyn10A编码348个氨基酸的多肽，分子量约40kDa。序列分析表明Xyn10A属于糖苷水解酶10家族，其氨基酸序列与来源于Paenibacilluslactis154的内切木聚糖酶相似性最高，达68％。Xyn10A在E.coliBL21(DE3)中表达，纯化后测定重组酶的性质。结果表明:Xyn10A在最适条件下(40℃，pH7.0)对beechwoodxylan的比活力为104.7U/mg;Xyn10A在25℃时具有80％的酶活，5℃时仍具有29％活性，属于低温酶;Xyn10A在含0.5MNaCl（海水的盐度）的底物中活性最高(134.5％);Xyn10A在2MNaCl中24h温育后仍具有87.4％的残余酶活。结构分析表明:Xyn10A的表面含有大量的带电荷氨基酸，尤其是负电荷氨基酸，这符合嗜盐蛋白的结构特征。冷活性和耐盐的特性使得Xyn10A在食品工业，尤其是海产品的加工中具有应用潜力。　　Xyn11A基因编码366个氨基酸的多肽，包括四个部分:N-端27个氨基酸的信号肽、糖苷水解酶11家族的催化结构域、富含Gly/Pro的链接区及家族36的碳水化合物结合区(Carbohydrate-BindingModule，CBM)。完整的木聚糖酶Xyn11A和催化结构域Xyn11A-LC分别异源表达、纯化及性质比较。二者的最适温度均为55℃;Xyn11A最适pH为7.5;而Xyn11A-LC的最适pH为5.5和7.5-8.0，具有较宽的pH活性范围（在pH5.5-8.5保持80％以上的活性）。Xyn11A和Xyn11A-LC均有强的耐碱性，在pH8.5-11.0的缓冲液中37℃温浴1h后残留酶活达80％以上。与Xyn11A相比，Xyn11A-LC具有更高的热稳定性、更宽的pH活性范围以及更高的催化活性（对beechwoodxylan的比活力为4511.9U/mg）。CBM的存在影响了酶的酶学性质，提高了酶对不溶木聚糖的结合，有助于催化结构域对不溶木聚糖的降解。与其他碱性木聚糖酶相比，Xyn11A-LC具有更高的碱稳定性和更高的催化活性，但是Xyn11A-LC的最适pH和最适温度低于其他碱性木聚糖酶。　　3.采用坐滴扩散法，成功获得Xyn11A-LC的高质量晶体。X-ray衍射分辨率达1.49(A)，空间群为P43，晶胞参数为a=59.4(A)，b=59.4(A)，c=153.7(A)。采用分子置换的方法，以来自嗜碱菌Bacillussp.41M-1的木聚糖酶XynJ的晶体结构(PDBcode:2DCK)为模板，解析获得Xyn11A-LC的三维结构。结构精修后的Rwork为0.196，Rfree为0.221。原子坐标和结构参数提交至蛋白质结构数据库，PDB号为4IXL。　　4.通过N端引入芳香族氨基酸（T9Y和D14F），获得突变体AI2，与野生型相比，突变体的最适温度提高了5℃。在Ser/Thr表面引入5个Arg，代替对碱敏感的Ser、Thr、Asn及Gln，获得突变体ST5。与野生型相比，ST5的最适pH及温度没有明显的改变。通过定点突变Q51R、T55R和K111R，引入了Arg及离子键(D14-R51、R55-D89、R111-E125)，获得突变体SB3。突变体在碱性(pH8.0-10.0)条件下活性比野生型有一定程度的提高，在pH8.5时活性比野生型提高了18.3％。AI2和SB3的热稳定性也获得了提高，而ST5的热稳定性下降。野生型在65℃pH8.0Tris-HCl缓冲液中的半衰期为22min，AI2和SB3在此条件下的半衰期分别为106min和68min，而ST5的半衰期不到5min。　　5.通过碱性、中性和酸性11家族木聚糖酶的结构比较，系统研究了11家族木聚糖酶pH相关的分子特征。　　(1)、通过氨基酸组成统计分析，碱性木聚糖酶可能通过增加带电荷的氨基酸含量，降低负电荷/正电荷比值，增加疏水氨基酸亮氨酸和异亮氨酸含量，降低极性氨基酸丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸含量，实现在较高pH条件下的催化特性;酸性木聚糖酶通过降低碱性氨基酸（Arg和Lys）的含量，增加负电荷/正电荷比值，增加非极性氨基酸（Ala、Phe、Trp和Val）和极性氨基酸（Cys、Gln和Ser）含量，实现在较低pH条件下的催化特性。　　(2)、碱性木聚糖酶在β6与β7之间增加一段α-螺旋替代非碱性酶中的无规则卷曲或转角，增加了局部位置的氢键数目，增加了酶的稳定性，从而有利于酶在碱性条件下发挥活性。　　(3)、碱性木聚糖酶的表面氨基酸中，易降解的丝氨酸含量较少，碱性氨基酸含量高;而在酸性木聚糖酶中，表面氨基酸几乎不含碱性氨基酸，疏水性氨基酸含量较低，极性不带电荷的氨基酸和酸性氨基酸含量高。　　(4)、氢键含量不影响11家族木聚糖酶的最适pH;而离子键的数量有利于11家族木聚糖酶的嗜碱性。　　(5)、通过结构比较、序列比对和突变实验验证，发现了5个可能对11家族木聚糖酶在较高pH条件下发挥活性起重要作用的位点:E16、W18、N44、L46和R48（按照木聚糖酶Xyn11A-LC的氨基酸位置）。

摘要译文

关键词：

木聚糖酶; 基因资源; 分子改造; 嗜碱机制; 催化结构域; 坐滴扩散法

学位年度：

2013

学位类型：

博士

学科专业：

微生物学

导师：

马延和

中图分类号：

Q814[酶工程]

学科分类号：

0710[生物学];083602[酶（蛋白质）工程];083604[生物过程工程]