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大规模固相多肽合成中若干关键技术的研究认领

被引量： 2

作者：

王卫国

学位授予单位：

南京工业大学

摘要：

多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性分子，几乎所有细胞都受多肽调节，它涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个方面。目前多肽的制备主要采用固相合成方法。虽然固相多肽合成技术已经有40多年的发展历史，但是其中一些关键技术问题仍然没有得到很好解决，诸如反应介质的选择，困难氨基酸序列的缩合，氨基酸与树脂的有效连接，大规模合成技术及其反应器放大，合成策略的优化组合等。本论文通过对这些关键技术问题进行具体攻关和深入研究，旨在开发高效、经济的固相多肽大规模合成工艺及设备。本论文研究结果如下：　　 1.以羟基wang树脂为固相载体，研究了反应介质对氨基酸与羟基树脂连接反应的影响，探索了一条经济、高效的氨基酸与羟基树脂的连接工艺。采用HPLC检测了反应中间产物，分析了介质溶剂偶极矩对氨基酸与树脂间连接效率的影响，并深入研究了介质溶剂物性与连接率之间的关系，揭示了介质溶剂的X(X=偶极矩/密度)与连接率之间的定量关系符合方程Y=-6.1*X+121.96。据此选择了新的弱极性溶剂或混合溶剂，优化了反应物比例，结果氨基酸的用量从树脂的4倍降低为3倍，反应时间从20h缩短为少于5h，连接效率从30％～80％提高到80％～100％，提供了一条高效、经济的氨基酸与羟基树脂连接的工艺。　　 2.困难多肽合成新技术的研究。(1)采用微波辐射辅助合成技术，提高了C-端含Arg-Pro困难序列多肽(AP-9和亮丙瑞林)的合成速率与产率，并首次报道了一条方便的C-端烷基化多肽的合成工艺。以V(THF)：V(NMP)=1:1为新的介质体系，在微波辐射30℃下反应仅6min，Arg-Pro困难序列的产率就达到80.2％。与传统方法相比，反应时间缩短20倍，产率提高10％。在此基础上，合成了两条C-端含Arg-Pro困难序列的多肽--AP-9和亮丙瑞林。AP-9得率73％，经制备型RP-HPLC纯化后，纯度大于98％。以亮丙瑞林为模型肽，首次报道了一条方便的C-端N-烷基化多肽的合成工艺。该新工艺实现了多肽乙胺化与切割步骤的连续耦合进行，简化了操作步骤，缩短了制备时间，充分保持了固相肽合成高效的优势。(2)采用Fmoc/Boc组合策略，研究了N端含有困难氨基酸残基的多肽的合成技术。以Val-Tyr为模型肽，用Boc-Val-OH取代了Fmoc-Val-OH，与Tyr-wangresin缩合，反应时间从90min缩短为40min，产率从67.2％提高到74.4％。采用此新方法，合成了N端含有困难Val的多肽Enterostatin。以Boc-Val-OH替代Fmoc-Val-OH，缩合反应时间从1h降低为0.5h，Enterostatin纯度从73.5％提高到77.4％，产率从70.5％提高到75.4％;并减少了一步脱保护反应和一步洗涤操作，简化了合成工艺。　　 3.研究了微波用于固相多肽合成中缩合、切割反应的技术及其动力学。以Fmoc-Val-OH与NH2-Tyr-(tBu)-Wang树脂的缩合反应为对象，首次研究了微波辅助下的固相缩合反应动力学。分析结果表明，微波辐射下的表观反应级数为2.3，表观活化能为104.7kJ/mol：而传统方法下表观反应级数为2.9，活化能为142.4kJ/mol。微波辐射的效果使缩合产率从68％提高到95％，而反应时间却缩短为传统方法的1/14。本论文将微波应用于TP5的合成。与常规方法相比，20℃下微波辐射4min，提高反应速率15倍，降低氨基酸的用量50％，TP5产率最高达88.7％，优于常规固相合成TP5的结果，并降低合成成本约40％。在微波辐射下切割胸腺五肽树脂，以V(TFA)：V(TIS)：V(H2O)=95:2.5:2.5为切割试剂，50℃下反应5min。与常规切割方法相比，反应速率和TP5产率分别提高了24倍和21.8％，降低了制备成本。　　 4.自制新型大规模固相多肽合成反应器，研究了百克级规模多肽固相合成的放大技术，克服了市售多肽合成仪存在的问题，如价格昂贵，合成规模小，传质效果差等。本论文自行设计了10g～100g级新型大规模固相多肽合成反应器，集成反应、搅拌、控温、鼓泡、氮气保护和过滤六重功能，提高传质、传热效率，减少了副反应的发生。以DIC/HOBt为缩合试剂，以V(DMF)：V(THF)=9:11作为新的反应溶剂体系，V(TFA)：V(TIS)：V(H2O)=95:2.5:2.5为切割试剂，建立了TP5的高效小试合成工艺;在DCM中，40℃下反应仅2h，即可将Fmoc-Thr(tBu)-Ol与CTC树脂的连接率从文献报道的0.287mmol/g(反应21h)提高到0.503mmol/g，降低了奥曲肽小试的合成成本。在此基础上，在新型反应器中进行了TP5和奥曲肽放大合成。100克级TP5的合成成本为97.8元/克(市场价500元/克)，降低成本33％;10克级奥曲肽的合成产率达到50％左右，较文献报道提高了20％，并降低合成成本76％，为359元/克(市场价4000元/克)。这显示自制新型大规模固相多肽合成反应器具有良好的应用前景。

摘要译文

关键词：

多肽固相合成; 微波辐射; 反应器; 大规模合成工艺; 困难序列; 优化组合

学位年度：

2007

学位类型：

博士

学科专业：

生物化工

导师：

欧阳平凯沈树宝

中图分类号：

O629.72[肽类];O643.133

学科分类号：

070303[有机化学];070306[化学生物学];081704[应用化学]

D O I：

10.7666/d.y2084048