氨其酰化酶固定化细胞制备及应用研究-文献详情-维普官网

文献检索

任意字段

文献信息

任意字段
主题词
篇关摘
篇名
关键词
摘要
作者
第一作者
作者单位
刊名
中图分类号
学科分类号
DOI
基金

智能检索

高级检索

检索历史

氨其酰化酶固定化细胞制备及应用研究认领

作者：

刘鹏刚

学位授予单位：

南京大学

摘要：

D-氨基酸作为医药及食品领域的重要原材料，被广泛用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊酯、杀虫剂、甜味剂等生产。非天然D-氨基酸常用生物法或生物-化学法生产。化学合成法结合手性拆分的方法，具有低成本、适于大规模生产等优点。而高效、绿色、安全的氨基酰化酶法拆分，是拆分氨基酸的最佳方法之一。　　本文对具有氨基酰化酶基因的大肠杆菌工程菌DM202[pET32a-argE/BL21(DE3)]进行固定化，研究了固定化前后菌体的酶学性质，并成功利用该固定化细胞由L-氨基酸转化合成了相应的D-氨基酸。　　 1、海藻酸钙法固定氨基酰化酶基因工程菌的最佳工艺条件为：海藻酸钠溶液浓度3％，菌体细胞包埋浓度为6％，二者在pH为7.0的缓冲溶液下混合注入3％CaCl2溶液成型，然后用1％的戊二醛溶液交联。　　 2、固定化细胞与固定之前的游离菌体相比，对温度和pH的稳定性有所加强，最佳拆分温度由45℃变为50℃;最佳拆分pH由7.0变为7.5。该固定化细胞酶活半衰期达到50天，操作稳定性优异，满足工业生产要求。　　 3、固定化细胞在拆分N-乙酰-DL-丙氨酸过程中，当底物浓度[S0]<300mol/L时，固定化细胞的酶促拆分反应符合米氏方程;在底物浓度[S0]>300mol/L，存在着底物抑制现象。进一步研究证明，拆分反应同时还受到反应体系中共存的其他两种产物的抑制作用，其中，产物乙酸是非竞争性抑制物，产物L-丙氨酸是竞争性抑制物。二者在50℃、pH7.5条件下抑制常数Ki，Ac、Ki，Ala分别为8.40mmol/L、5.51mmol/L。　　 4、氨基酰化酶固定化细胞催化N-乙酰-DL-氨基酸乙酰基水解的最佳温度是50～55℃，最佳pH为7.5～8.0。金属离子对拆分反应具有促进或抑制作用。低浓度的钴离子对固定化细胞有明显的激活作用，而高浓度则抑制酶活，5×10-4的钴离子对固定化细胞酶活活性提高约20％。该固定化细胞对N-乙酰-DL-丙氨酸、N-乙酰-DL-缬氨酸的催化活性较高，酶活分别达到1756U和1255U，而对N-乙酰-DL-亮氨酸的催化活性稍低，酶活为702U，催化水解需要的时间较长。由三种L-氨基酸经过消旋、乙酰化、酶水解、产物分离、脱乙酰基五步操作后制得D-氨基酸的总摩尔收率分别为：D-丙氨酸75.4％，D-亮氨酸70.1％，D-缬氨酸73.2％。;比旋光分别为：D-丙氨酸[α]D25=-14.3°(10％，6MHCl)，D-亮氨酸[α]D25=-14.1°(4％，6MHCl)，D-缬氨酸[α]D25=-28.3°(8％，6MHCl)，光学纯度符合要求。

摘要译文

关键词：

氨基酰化酶; 基因工程菌; D-氨基酸; 固定化细胞

学位年度：

2009

学位类型：

硕士

学科专业：

植物学

导师：

焦庆才

中图分类号：

O629.711;Q814.2[固定化酶和固定化细胞技术]

学科分类号：

0710[生物学];083602[酶（蛋白质）工程];083604[生物过程工程]