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胸腺体液因子和血清胸腺因子的合成及活性研究认领

作者：

廖晓全

学位授予单位：

华东理工大学

摘要：

胸腺素类制剂在抗感染、抗肿瘤和自身免疫性疾病中起着重要作用。胸腺因子大多数都作用于T淋巴细胞，促进其分化成熟，但也有各自的特性。胸腺体液因子(ThymicHumoralFactor-γ2，THF-γ2)和血清胸腺因子(Thymulin，FTS)是两种重要的胸腺素。THF-γ2调节CD4+/CD8+T细胞比率，增强脾细胞对有丝分裂原的反应，T细胞对凝集素的增殖反应，T细胞对抗体产生的辅助作用，移植抗宿主反应和细胞毒反应等多种特性。THF-γ2也刺激IL-2和TNFα的产生，以及提高胸腺细胞的抗肿瘤活性。FTS已经被证明影响CD4+/CD8+T细胞比率，增加自然杀伤细胞(NK)的活力，增加抗体的产生，增加白介素-2受体和干扰素-γ受体的表达。本文旨在建立THF-γ2和FTS的合成、纯化和分析方法，研究其生物活性，为应用开发奠定基础。本实验首先建立了氨基酸保护的方法，对所需氨基酸的氨基和活性侧链进行了成功的衍生。合成了Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH。并经薄层层析，紫外扫描，熔点测定和HPLC分析得以确证。同时制备了载量适中的氨基酸与树脂的偶联产物Fmoc-Leu-Wang和Fmoc-Asn(Trt)-Wang树脂。采用Fmoc固相合成法(SPPS)合成了THF-γ2，用中压液相反相柱一步纯化，经HPLC分析纯度，通过质谱、氨基酸组成和序列分析鉴定合成产物。根据THF-γ2促进T细胞产生IL-2的特性检测合成产物的体外活性。结果表明：化学合成胸腺体液因子的产率为95.8％；纯化后其纯度达到95.92％；质谱测定其分子量为918，与理论分子量相符；氨基酸序列测定为NH2/Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu，与设计序列一致；当THF-γ2浓度为300ng/ml时，小鼠脾细胞产生IL-2的浓度最高，为空白对照的1.9倍。采用Fmoc固相合成法合成了FTS，用中压液相阴离子柱一步纯化，经HPLC分析纯度，通过质谱、氨基酸组成和序列分析鉴定合成产物。由FTS恢复胸腺切除小鼠的脾细胞对免疫抑制剂AZ敏感的特性测定合成FTS的活性。结果表明：化学合成血清胸腺因子的产率为94.7％；纯化后其纯度为93.7％；质谱测定其分子量为876.6，与理论分子量相符；氨基酸序列测定为NH2/Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn，与设计序列一致；合成FTS的浓度低至10-14mol/l时尚有部分活力，在10-13mol/l时能够完全恢复胸腺切除小鼠的脾细胞对AZ的敏感性。 THF-γ2和FTS的生物活性有紧密的联系，两者的协同作用可能更好的调节免疫反应。嵌合肽能确保它们在同一时间出现在机体的同一部位。因此我们合成了两者的嵌合肽，经纯化和分析鉴定之后，用绵羊红细胞实验，辐射保护实验和IL-2产生实验检测其活性。发现由Ala-Tyr-Ala连接的嵌合肽FTS-THF-γ2(a)显示了FTS和THF-γ2的生物活性，成为一种新的潜在的免疫调节剂。初步探索了FTS和THF-γ2作为放、化疗辅助用药的可能性。实验显示FTS提高了受辐射小鼠的免疫指标：白细胞总数和吞噬细胞能力都得到提高，胸腺指数也有所升高。FTS也提高了小鼠的存活率和存活时间。而在降低化疗副作用中，FTS和THF-γ2都显示了阳性结果，提高了荷瘤小鼠注射环磷酰胺后的存活率和存活时间。本论文也包括了一种蛇毒抗凝肽(Hannahpep)的合成和体外活性测定，实验表明Hannahpep确有溶纤维蛋白和纤维蛋白原的活性。

摘要译文

关键词：

胸腺体液因子; 血清胸腺因子; 胸腺素; 肽合成; T细胞; 固相合成法

学位年度：

2005

学位类型：

博士

学科专业：

生物化工

导师：

袁勤生

中图分类号：

R979.1[抗肿瘤、抗癌药物];R593[免疫性疾病⑨]

学科分类号：

100603[中西医结合药学];100707[临床药学];100201[内科学]