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葡萄籽原花青素(GSPE)通过PI3K/AKT信号通路缓解小鼠心肌梗死损伤作用机制的研究认领

作者：

阮永雪

学位授予单位：

温州医科大学

摘要：

心肌梗死是世界上最严重的致命性疾病之一，它是由冠状动脉急性闭塞引起的。葡萄籽原花青素提取物（GSPE）是从葡萄籽中提取的具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理作用的活性成分。天然产物价格便宜，易得，用途广泛，并且效果显著。目前它已被用于治疗多种疾病，如癌症、脑损伤和糖尿病并发症。然而，关于其在小鼠心肌梗死中的作用及相关机制的研究还很有限。基于课题组前期研究，本实验通过体内实验建立小鼠急性心肌梗死模型和体外试验建立细胞糖氧剥夺模型，研究葡萄籽原花青素产生的影响以及可能的信号通路的变化。为心肌梗死的治疗提供可循的依据，也为天然产物的深入研究发展奠定一定的实验基础。　　研究目的　　经过本课题组大量的文献调研综述出葡萄籽原花青素具有减轻缺血再灌注损伤、调节机体代谢、抗氧化损伤、降低炎症因子等多种功效。基于课题组前期研究，本实验通过结扎小鼠心脏冠状动脉建立急性心肌梗死的小动物模型模型，探讨PI3K/AKT相关通路与急性心肌梗死之间的关系，并研究葡萄籽原花青素对心肌梗死小鼠心脏功能和心脏病理变化产生的影响。除此之外，本实验还使用H9C2细胞建立糖氧剥夺模型，探讨葡萄籽原花青素对心肌细胞凋亡产生的影响以及PI3K/AKT相关通路与H9C2细胞凋亡之间的关系。通过我们的研究，希望能够为人类心肌梗死后心脏病理性改变提供新的治疗靶点，并且有可能为葡萄籽原花青素针对心肌梗死慢性损伤的临床治疗提供实验依据。　　研究方法　　第一部分葡萄籽原花青素对急性心肌梗死引起的心功能损伤的影响及机制研究　　12只雄性C57BL/6J小鼠，根据体重随机选择6只作为正常组。其余6只小鼠经心脏左边冠状动脉结扎，建立急性心肌梗死模型。在将正常组和模型组各分为两组，一组采用GSPE灌胃喂养14天，一组采用等量生理盐水灌胃喂养14天。7d时测量一次体重，14d时测量体重，及使用多普勒超声仪器测量各项心功能指标。灌胃结束后，对小鼠实施安乐死。取腹主动脉血、心脏组织，检测各组小鼠血清中超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量;TTC染色观察心脏梗死面积;HE染色和Masson染色观察心脏组织形态变化;HE染色主要显示细胞心肌组织细胞炎症情况，Masson染色主要展示心肌组织细胞纤维化情况。WesternBlot检测Bcl-2和Bax蛋白含量，以及Col-1,Col-3和a-SMA的蛋白含量。免疫荧光染色检测a-SMA含量。按照以上分组，检测不同组PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。　　第二部分阐述葡萄籽原花青素是通过PI3K/AKT信号通路缓解急性心肌梗死引起的心功能损伤　　再重新分组，分为：正常组，模型组，MI+GSPE组，MI+GSPE+LY294002组。7d时测量一次体重，14d时测量体重，及使用多普勒超声仪器测量各项心功能指标。灌胃结束后，对小鼠实施安乐死。灌胃结束后，对小鼠实施安乐死。取心脏组织，HE染色和Masson染色观察心脏组织形态变化;HE染色主要显示心肌组织细胞炎症情况，Masson染色主要展示心肌组织细胞纤维化情况。WesternBlot检测Bcl-2和Bax蛋白含量，以及Col-1,Col-3和a-SMA的蛋白含量。免疫荧光染色检测a-SMA含量。同时检测不同组PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。　　第三部分阐述体外葡萄籽原花青素通过PI3K/AKT信号通路减弱糖氧剥夺条件下的心肌细胞凋亡　　H9C2细胞在缺氧环境（95%N2，5%CO2）下培养于无葡萄糖和无血清DMEM中。CCK8筛选最佳造模作用时间，建立稳定的H9C2细胞糖氧剥夺模型。CCK8检测葡萄籽原花青素对H9C2细胞增殖情况，确定给药浓度及时间。流式细胞术检测GSPE对细胞凋亡情况的影响。WesternBlot检测葡萄籽原花青素对凋亡的影响以及各组细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达。　　重新分组，分为：正常组，模型组，OGD+GSPE组，OGD+GSPE+LY294002组。流式细胞术检测GSPE对细胞凋亡情况的影响。WesternBlot检测葡萄籽原花青素对凋亡的影响以及各组细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达。　　研究结果　　第一部分　　1.心功能情况：与模型组相比，葡萄籽原花青素治疗组的心脏重量/体重比显著降低，LVEF和FS显著增加，而LVIDd和LVIDs显著降低（P＜0.05）。　　2.心肌梗死面积：TTC结果显示，与模型组相比，葡萄籽原花青素治疗组的梗死面积明显小于MI组（P＜0.05）。　　3.血清SOD、MDA情况：与正常对照组比较，模型对照组SOD水平明显降低（P＜0.05）、MDA水平明显升高（P＜0.05）;与模型对照组比较，葡萄籽原花青素治疗组SOD水平显著升高（P＜0.05），MDA水平显著降低（P＜0.05）。　　4.心脏HE染色及Masson染色结果显示：葡萄籽原花青素一定程度上能改善心肌梗死小鼠的心脏病理改变。　　5.WesternBlot结果及免疫荧光结果显示：葡萄籽原花青素显著增加心肌梗死后心肌组织中Bcl-2的表达，降低Bax的表达（P＜0.05）。此外，降低了Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和a-SMA的表达（P＜0.05）。免疫荧光也显示葡萄籽原花青素治疗组的a-SMA积分光密度显著低于MI组。WesternBlot结果显示：GSPE处理增强了PI3K/AKT信号通路。心肌梗死组p-PI3K和p-AKT表达增加，GSPE处理增强了这种激活。　　第二部分：　　1.与MI+GSPE组相比，LY294002治疗组的LVEF和FS显著降低（P＜0.05），而LVIDd和LVIDs显著增加（P＜0.05）。　　2.心脏HE染色及Masson染色结果显示：Masson三色染色也显示MI+GSPE+LY294002组心肌纤维化胶原沉积面积明显高于MI+GSPE组（P＜0.05）。Hamp;E染色显示，与MI+GSPE组相比，MI+GSPE+LY294002组心肌坏死、炎性浸润和间质水肿增加（P＜0.05）。　　3.WesternBlot结果及免疫荧光结果显示：施用PI3K抑制剂LY294002后，在MI造模后，LY294002治疗组的p-PI3K和p-AKT水平低于GSPE组。与GSPE组相比，LY294002升高了Bax蛋白水平，降低了Bcl-2水平，增加Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA水平。换言之，与MI+GSPE组相比，LY294002显著增加了细胞凋亡和纤维化。此外，免疫荧光显示，LY294002治疗组α-SMA的积分光密度高于MI+GSPE组。　　第三部分：　　1.最适宜的糖氧剥夺时间约为24小时，建立糖氧糖氧剥夺模型成功。　　2.流式细胞术显示，在40μg/ml的葡萄籽原花青素可以显著减少H9C2细胞的凋亡（P＜0.05）。　　3.WesternBlot结果显示，葡萄籽原花青素可以减弱凋亡，增加Bcl-2表达（P＜0.05），降低Bax表达（P＜0.05）。同时可以显著激活PI3K/AKT通路。　　4.流式细胞术显示，PI3K/AKT抑制剂可以逆转葡萄籽原花青素的抗细胞凋亡作用（P＜0.05）。　　5.WesternBlot结果显示，PI3K/AKT抑制剂能够抑制PI3K/AKT通路。逆转葡萄籽原花青素的抗凋亡作用，减少Bcl-2表达（P＜0.05），增加Bax表达（P＜0.05）。　　研究结论　　体内，体外实验均结果表明，葡萄籽原花青素可通过激活PI3K/AKT信号通路来减轻心肌细胞凋亡及纤维化改变，改善心脏功能及减缓心脏病理性进展。因此，葡萄籽原花青素可能是一种治疗心肌梗死的有前景的天然制剂。这个研究发现还有待临床试验来进一步验证。

摘要译文

关键词：

心肌梗死; 葡萄籽原花青素; 分子机制; PI3K/AKT信号通路

学位年度：

2021

学位类型：

硕士

学科专业：

生物学(心血管疾病)

导师：

李磊

中图分类号：

R542.22;R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]