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非编码小RNA RyhB调控APEC抵抗血清杀菌相关靶基因的筛选、鉴定和致病性研究认领

作者：

石玉省

学位授予单位：

扬州大学

摘要：

禽致病性大肠杆菌(Avain pathogenic Escherichia coli,APEC)是肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)的重要成员,可引起禽类的心包炎、肝周炎、脑膜炎、败血症等,对养禽业危害巨大,APEC还是潜在的人畜共患病原体,对公共卫生构成潜在威胁。RyhB是一种大小为90 bp的非编码小RNA(sRNA),主要参与调控铁稳态,还可调控三羧酸循环、氧化应激、能量代谢、耐酸性和毒力基因表达等,前期研究发现RyhB有助于APEC致小鼠脑膜炎的发生,而病原菌抵抗血清杀菌,在血液中存活并引起菌血症是导致脑膜炎发生的前提。为探究RyhB是否在APEC抵抗血清杀伤过程中发挥调控作用及其调控机制,本研究分析了RyhB对APEC抵抗血清杀菌作用的影响,筛选出该过程中RyhB调控的靶基因并研究其调控机制,进一步研究了 RyhB是否通过调控血清抵抗相关基因调节APEC致病性,为APEC的致病机制研究和防控提供了理论基础。首先利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定APEC XM在LB中振荡培养和鸭血清低氧(氧浓度2.5%)条件处理下ryhB的转录水平,结果发现ryhB在鸭血清中的转录水平显著高于LB培养基,表明血清诱导了 RyhB的表达。ryhB缺失不影响APEC XM在LB培养基中的生长,但能显著降低APEC XM在鸭血清中的存活,表明RyhB可响应血清和低氧的压力环境并大量表达,调控APEC XM抵抗血清杀伤作用,有助于APEC在此环境下存活。为进一步探究RyhB调控APEC抵抗血清杀伤的机制以及筛选RyhB调控的靶标基因,我们对血清处理的APEC XM和ryhB缺失株进行转录组测序,分析ryhB缺失对APEC基因转录水平的影响,结果发现:ryhB缺失后,共有283个差异表达基因(Different Expression Genes,DEGs),其中147个上调基因,136个下调基因;差异表达基因GO富集分析结果显示,主要富集到细胞黏附、多糖运输、亮氨酸生物合成和铁离子稳态等生物过程;富集到4铁4硫簇结合、铁离子结合和电子转移活性等分子功能;细胞组成主要富集到菌毛。KEGG通路富集分析结果显示,主要与代谢和分子运输相关,包括双组分系统、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、ABC转运系统等通路。挑选10个差异表达基因进行qRT-PCR,结果发现转录组数据与qRT-PCR结果一致,证明转录组测序可信度较高,可做下一步分析。对差异表达基因分析发现ryhB缺失导致荚膜基因簇的14个基因表达量显著下降,最高降低200多倍,说明RyhB对荚膜基因有正调控作用,可能通过某种调控机制直接调控荚膜的合成。利用双质粒荧光系统研究RyhB对荚膜基因的调控机制,结果发现ryhB可与荚膜基因簇kpsF5’UTR区碱基互补配对,从而激活促进荚膜基因翻译,促进荚膜合成,表明RyhB可直接调控荚膜基因合成。利用λ-Red重组技术成功构建了荚膜基因APEC XM Δneu单缺失株、APEC XM Δ ryhB Δneu双缺失株以及相应回补株,测定了ryhB和neu单、双缺失对APEC XM荚膜合成和抗吞噬能力的影响,结果显示,ryhB和neu的缺失均降低了 APEC XM抗吞噬的能力,双缺失株则更为显著;ryhB单缺失株的抗吞噬性略高于neu单缺失株,表明ryhB可调控荚膜的合成抵抗巨噬细胞吞噬;ryhB的缺失显著降低荚膜生成量、减弱了抵抗巨噬细胞吞噬功能。雏鸭感染试验发现,与野生株相比,ryhB和neu缺失株均降低了对雏鸭的致病性;ryhB、neu基因双缺失株对雏鸭毒力下降更为显著;与neu单缺失株相比,ryhB单缺失株对雏鸭致病力更弱,具体表现在对雏鸭的临床症状和脏器病变程度减轻,血液和脏器载菌量下降。推测RyhB除了调控荚膜基因的表达,还可调控其他相关毒力基因的表达。基于ryhB和neu的缺失对APEC XM毒力的减弱效果,可为APEC减毒活疫苗的开发提供材料和基础。

摘要译文

关键词：

禽致病性大肠杆菌; RyhB; RNA-seq; 荚膜; 调控机制; 致病性

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

兽医硕士（专业学位）

导师：

朱春红

中图分类号：

S852.61[病原细菌]

学科分类号：

090601[基础兽医学];090608[兽医生物工程学];090609[兽医生物信息学]

D O I：

10.27441/d.cnki.gyzdu.2024.003295