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白藜芦醇通过促进DJ-1在线粒体的亚定位减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究认领

作者：

任建民

学位授予单位：

南昌大学

摘要：

目的: 从DJ-1与线粒体热休克蛋白70(mtHsp70)相互作用的角度,探讨白藜芦醇(RSV)预处理通过促进DJ-1在线粒体的亚定位,产生减轻大鼠心肌缺血再灌注(I/R)所诱发的氧化应激损伤的保护机制。方法: 1、首先通过在大鼠心肌内注射sh-mtHsp70低表达慢病毒,7天后,大鼠接受RSV灌胃(30 mg/kg)7天,每日一次。通过结扎大鼠冠状动脉左前降支(LAD)使心脏缺血30 min,再解扎行恢复血流灌注2 h的方法,构建大鼠心肌I/R模型。大鼠心脏再灌注结束后,分离心脏组织胞浆与线粒体蛋白或取心肌组织做冰冻切片,通过免疫共沉淀(Co-IP)评估RSV预处理对DJ-1与mtHsp70相互作用的影响,结合Western Blot或免疫荧光(IF)技术检测RSV是否促进DJ-1蛋白在线粒体的转位,同时观察沉默mtHsp70的表达是否会抑制DJ-1在线粒体的转位表达情况。 2、其次大鼠心肌内注射sh-DJ-1低表达慢病毒,7天后,大鼠接受RSV灌胃,采用Co-IP实验观察RSV预处理是否促进DJ-1与线粒体复合体Ⅰ的两个亚基ND1和NDUFA4相互作用的影响,并明确该作用是否被DJ-1下调所取消。 3、大鼠接受RSV灌胃后,结合腹腔注射线粒体复合体Ⅰ抑制剂(IACS-010759)进行干预,通过沉默mtHsp70的表达进而抑制DJ-1在线粒体的转位后,观察是否会影响RSV预处理保护再灌注后心肌组织的线粒体复合体Ⅰ的活性,同时明确沉默mtHsp70的表达是否会进一步影响RSV缓解再灌注后心脏线粒体ROS的生成。 4、通过测定以下指标的变化,观察沉默DJ-1的表达,是否会影响RSV预处理对抗心肌I/R诱导的氧化应激损伤,产生心肌保护作用:DHE染色检测心肌组织总ROS;TTC染色检测心肌梗死面积大小;HE染色观察心肌组织的细胞形态;超声心动图评估左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS);检测血清中LDH、SOD的活性、MDA的含量。结果: 1、Co-IP结果显示,与Sham组相比,I/R组DJ-1与mtHsp70的相互作用增强,RSV预处理进一步增加了I/R心肌中DJ-1与mtHsp70的相互作用。Western Blot与IF检测心肌组织内DJ-1在线粒体的转位结果显示,与I/R组相比,RSV可显著促进DJ-1从胞浆到线粒体的转位,但是心肌内注射sh-mtHsp70慢病毒致下调mtHsp70蛋白表达后,RSV产生的上述效应被抑制。 2、Co-IP结果显示,与I/R组相比,RSV预处理促进DJ-1与线粒体复合体Ⅰ的两个亚基ND1和NDUFA4相互作用,然而,当mtHsp70的表达被沉默进而抑制DJ-1在线粒体亚定位后,RSV促进DJ-1与ND1/NDUFA4的相互作用被取消。类似地,当心肌内DJ-1的表达被sh-DJ-1慢病毒敲低后,会显著取消RSV预处理促进DJ-1与ND1/NDUFA4的相互作用。 3、RSV预处理进一步增加I/R后心脏中DJ-1的表达,同时抑制心肌I/R所导致的线粒体复合体Ⅰ的活性下降、线粒体ROS释放增多,有趣的是,当心肌组织中的DJ-1或mtHsp70的表达被慢病毒所下调后,RSV产生的上述现象被显著抑制,表现为线粒体复合体线粒体复合体Ⅰ的活性抑制增加、ROS进一步增多。有趣的是,线粒体复合体Ⅰ抑制剂(IACS-010759)会直接取消RSV保护线粒体复合体线粒体复合体Ⅰ活性的效应,造成线粒体ROS的大量生成。 4、DHE染色结果显示,RSV可显著抑制心肌I/R导致的ROS产生;TTC结果表明,与I/R组相比,RSV缩小心肌梗死面积;HE染色结果显示,RSV+I/R组相比于I/R组心肌细胞肿胀程度与变形情况明显减轻,炎症细胞浸润现象得到改善;与I/R组相比,超声心动图结果显示,RSV可显著恢复I/R后的心功能,表现为左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)值增加;与I/R组相比,RSV明显下降血清中的LDH活性、MDA含量,升高SOD活性;重要的是,当心肌组织中的DJ-1或mtHsp70的表达被抑制后,RSV产生的上述心肌保护效应全部被逆转。结论: 在伴侣蛋白mtHsp70的协助下,RSV预处理可促DJ-1在线粒体的亚定位,促进DJ-1与线粒体复合体线粒体复合体Ⅰ的两个亚基ND1和NDUFA4相互作用增强,从而保护线粒体复合体Ⅰ的活性,降低线粒体ROS的生成,对抗心肌I/R导致的氧化应激损伤,产生心肌保护作用。

摘要译文

关键词：

白藜芦醇; DJ-1; 氧化应激; 心肌缺血再灌注; 线粒体复合体I

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

药学

导师：

陈和平

中图分类号：

R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27232/d.cnki.gnchu.2024.004077