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酪丁酸梭菌生物催化合成γ-氨基丁酸的研究认领

作者：

刘子尧

学位授予单位：

华南理工大学

摘要：

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是哺乳动物中一种重要的抑制性神经递质,具有多种生理功能,广泛应用于食品、药品、保健品、饲料、农业等领域。GABA在市场上日益增长的需求对目前的工业生产技术提出了新的挑战。生物发酵法合成GABA由于其高效、环境友好的特性而备受青睐,目前传统的微生物发酵生产GABA方法多为好氧发酵,为了在厌氧发酵平台中实现GABA的高效生产,本研究利用工程改造的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）建立了全新的厌氧GABA生产平台,并展现出较高水平的GABA合成能力。谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,GAD）是GABA合成中的关键酶,能催化一分子L-Glu脱羧形成一分子GABA和CO2。为了在C.tyrobutyricum中实现GABA的从头合成,首先验证了GABA代谢途径中关键酶基因的表达以确认代谢路径设计的合理性,并过表达大肠杆菌（Escherichia coli）来源的GAD构建了工程菌Ct-p MA01,在以24 g/L葡萄糖为底物的摇瓶发酵中GABA产量仅为0.11 g/L。随后过表达柠檬酸合成酶（Citrate synthase）来强化TCA循环的代谢通量,GABA产量为0.16 g/L。为提高GABA产量,通过进一步对来自于乳酸乳球菌和植物乳杆菌的GAD进行转化效率的筛选来提高工程菌的GABA产量,其中工程菌Ct-p MA02（过表达来自于乳酸乳球菌的GAD）具有最高的转化效率,在添加10 g/L谷氨酸钠（Monosodium glutamate,MSG）为前体物质的摇瓶发酵中GABA产量达到6.05 g/L。通过添加前体物质MSG进行GABA的合成会使细菌在发酵过程中受到MSG引起的一系列抑制作用,细菌的生长可能因此受到抑制进而影响产物合成。热激蛋白对细菌胞外环境变化具有多种响应机制,为提高C.tyrobutyricum对底物MSG的耐受性以进一步提高GABA的产量,考察了Class I型热激蛋白基因在MSG胁迫下的转录表达变化。结果显示,MSG胁迫下gro ES和gro EL的m RNA表达水平提升尤为显著,因此在Ct-p MA02的基础上过表达gro ES和gro EL构建工程菌Ct-p MAG,其MSG耐受性和GABA产量均有显著提高,在添加40 g/L MSG的摇瓶发酵中GABA产量达到14.26 g/L,比Ct-p MA02提高34.53%。随后在5 L发酵罐中使用工程菌Ct-p MAG进行补料分批发酵实验,通过补充MSG,GABA终浓度在p H-free模式和p H-control模式下分别达到35.57g/L和122.34 g/L。最后,使用谷氨酸（L-glutamate,L-Glu）作为底物并应用两阶段发酵策略,GABA终浓度达到400.32 g/L,生产强度达到36.39 g/L/h,转化率为97.07%,产量和生产强度为已报道的领先水平。 C.tyrobutyricum发酵过程中同步合成的丁酸为GABA合成提供了必要的酸性环境,使丁酸偶联GABA发酵成为可能。GABA的合成受底物MSG转运的影响,为进一步提高MSG向细胞内的转运速率,研究了四种氨基酸转运蛋白基因在MSG胁迫下的转录表达变化,其中glt ABCtp的m RNA表达变化最为显著。随后在Ct-p MA02的基础上过表达氨基酸转运蛋白基因glt ABCtp,得到工程菌Ct-p MA02ABCTP,该工程菌在添加24g/L葡萄糖和30 g/L MSG的摇瓶发酵中丁酸和GABA产量分别达到7.56 g/L和13.70g/L,GABA产量提高29.25%。之后在5 L发酵罐中对发酵条件进行优化,通过流加MSG母液控制p H为5,并在添加90 g/L葡萄糖的情况下最终丁酸和GABA的产量分别达到23.65 g/L和32.17 g/L,展现出了出色的丁酸和GABA联产能力。综上所述,本文通过筛选和过表达GAD获得了能够高效合成GABA的C.tyrobutyricum工程菌（Ct-p MA02）,随后通过提升菌株对MSG的耐受性,以及强化MSG转运进一步增强了工程菌合成GABA的能力,并初步探究了丁酸和GABA联产的方法。本文利用工程改造的C.tyrobutyricum建立了一个全新的GABA厌氧生产平台,为微生物发酵合成GABA的发展提供了新思路。

摘要译文

关键词：

酪丁酸梭菌; GABA; 谷氨酸脱羧酶; 热激蛋白; 丁酸和GABA联产

学位年度：

2023

学位类型：

硕士

学科专业：

发酵工程

导师：

王菊芳

中图分类号：

TQ922[发酵法制氨基酸]

学科分类号：

081703[生物化工];082202[发酵工程];083604[生物过程工程];083606[微生物发酵工程]

D O I：

10.27151/d.cnki.ghnlu.2023.000557