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石斛内生放线菌产物挖掘及生物活性评价认领

作者：

丁晓倩

学位授予单位：

南京中医药大学

摘要：

中药石斛始载于《神农本草经》,位于“九大仙草”之首,具有滋阴清热、润肺止咳、生津益胃等功效。中医用石斛讲究“鲜品为上”,现代研究表明,石斛等兰科植物具有与菌物形成典型共生关系的微生态系统特征,如石斛种子在自然条件下萌发必须依靠共生真菌,内生菌对石斛具有促进其植物生长、增强抗性、诱导次生代谢产物合成等功能;并且研究发现许多石斛属内生菌具有丰富的菌群多样性,但目前对其内生放线菌尤其是其次生代谢产物的研究少见报道。本论文针对研究较少的玫瑰石斛及其近似种,开展内生放线菌的系统研究,通过HPLC-DAD-MS分析寻找新型次生代谢产物,指导目标菌株的培养基配方优化,结合基因挖掘技术和活性评价手段,发现活性次生代谢产物。主要研究结果如下:(1)本论文采用组织切块法和平板划线法分离和培养了菌株,从石斛的根、茎、叶、花和土中分离纯化得到77株内生菌株,采用16S rRNA基因分析技术对内生放线菌进行种属鉴定;对菌株发酵粗提物进行生物活性评估和HPLC-DAD-MS化学成分分析,最终筛选出玫瑰石斛(Dendrobium crepidatum Lindl.et Paxt)内生链霉菌(MG-F-1)和束花石斛(Dendrobium chrysanthum Lindl)内生链霉菌(SH-R-1)开展进一步研究。(2)根据MG-F-1全基因组的次级代谢产物基因簇分析,并结合OSMAC策略对MG-F-1发酵条件进行优化,选择MG-F-1和Bacillus cereus MG-1在种子培养基中混合共培养7d,在放大发酵、提取粗提物后,经正相硅胶、反相硅胶(ODS)、凝胶色谱柱和制备液相等方法进行分离、纯化,从MG-F-1和MG-1的粗提物中分离鉴定了 15个化合物,其中5个为含硫吡喃萘醌类新化合物。体外细胞毒性和抑菌活性测定显示:化合物frenolicin H～L(1～5)、UCF76-A(6)、frenolicinB(7)、frenolicinG(11)和 K1115A(12)对 MV4-11显示较强的细胞毒性,IC50值为0.09～25.3 μM;化合物UCF76-A(6)和frenolicin B(7)对B.subtilis和S.aureus均有较强的抑制活性,MIC为2～8μM。此外在抗病活性测定中,frenolicin B对小麦赤霉病菌显示强烈的抑制活性(10 μg/mL的剂量下抑制率为76.21%),有望成为一种新型抗赤霉病农药。(3)基于OSMAC策略优化发酵条件,SH-R-1在MA培养基中培养7 d,在放大发酵、提取粗提物后,经正相硅胶、反相硅胶(ODS)、凝胶色谱柱和制备液相等方法进行分离、纯化,从SH-R-1的粗提物中获得11个化合物,其中2个为新的hygromycin A类似物(16,17),鉴于碳谱信号的缺失,利用化学沟通方法,通过乙酰化反应确证了化合物的平面结构。同时天然hygromycinA糖苷配基(18)的分离,为hygromycinA生源合成途径的完善提供依据。活性测试结果显示对B.subtilis和S.aureus有一定的抑制作用。

摘要译文

关键词：

石斛; 内生菌; OSMAC; 次生代谢产物; 生物活性

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

中药学（专业学位）

导师：

胡杨

中图分类号：

R284.1[化学分析与鉴定]

学科分类号：

1005[中医学];100803[中药鉴定学];100804[中药化学];100805[中药分析学]

D O I：

10.27253/d.cnki.gnjzu.2022.000563