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面包乳杆菌ZHG 2-1对铜绿假单胞菌群体感应淬灭作用研究认领

被引量： 1

作者：

崔天琦

学位授予单位：

渤海大学

摘要：

水产品是人类赖以生存的重要食物来源之一。随着水产养殖业的迅猛发展,微生物引起水产养殖病害日益突出,铜绿假单胞菌是一种重要的食源性病原菌以及水产品常见的腐败菌,除了健康后果之外,由铜绿假单胞菌引起的食物腐败可能给消费者和生产者带来巨大的经济损失。铜绿假单胞菌的致病作用与群体感应（quorum sensing,QS）密切相关。因此,从干扰细菌QS角度出发,寻找群体感应淬灭剂来干预细菌QS所参与或调控的生理活动,是控制微生物致病性的一条新途径。乳酸菌是一种安全有效的生物防腐剂,其作为群体感应淬灭（quorum quenching,QQ）菌的研究在国内外还十分鲜见。本文从自然环境中筛选具有N-酰基高丝氨酸内酯类（N-acylated homoserine lactones,AHLs）降解活性的乳酸菌,并对其进行生理生化反应和16S r DNA测序鉴定。利用气相色谱-质谱（GC-MS）分析活性乳酸菌对几种革兰氏阴性菌常见的AHLs信号分子的降解作用。此外研究ZHG 2-1粗提物（CE）处理对QS调控的胞外多糖、绿脓菌素、几丁质酶等毒力因子以及细菌运动的影响;定量实时聚合酶链反应（q RT-PCR）分析了ZHG 2-1 CE处理后对QS相关基因las I/R,rhl I/R表达的影响,流式细胞仪分析了ZHG 2-1 CE对铜绿假单胞菌感染后小鼠巨噬细胞毒力的影响。最后,通过96孔板法结合扫描电子显微镜（SEM）分析ZHG 2-1粗提物、阿奇霉素以及二者组合使用时对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用和预先形成的生物膜的清除作用。主要结果如下:1.应用96孔板法、琼脂扩散法从传统发酵食品、鱼类肠道及植物根部等生态环境分离的156株乳酸菌中筛选对铜绿假单胞菌群体感应AHLs信号分子具有较强降解活性的菌株。结果表明来源于阜新彰武酸黄瓜的菌株ZHG 2-1,降解活性最强接近100%,经生理生化反应和16S r DNA测序鉴定菌株ZHG2-1为面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum）。GC-MS分析结果表明,菌株ZHG 2-1 CE可以显著降解铜绿假单胞菌中两种常见的信号分子C4-HSL和3-oxo-C12-HSL,此外,对革兰氏阴性菌常见的几种AHLs信号分子如:C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL以及C14-HSL均具有较强的降解作用,对长链信号分子的降解活性强于短链信号分子。菌株ZHG 2-1 CE对铜绿假单胞菌的最小抑制浓度（MIC）为4.0 mg/m L,三个亚抑制浓度（sub-MIC）即1.0、2.0和3.0 mg/m L的ZHG 2-1 CE不影响铜绿假单胞菌的生长,并且对紫色杆菌产生的紫色菌素具有降解作用。2.评估菌株ZHG 2-1 CE在sub-MIC对铜绿假单胞菌的群体感应毒力因子以及运动性的影响。结果表明:质量浓度1.0、2.0和3.0 mg/m L的ZHG 2-1 CE对铜绿假单胞菌蛋白酶,几丁质酶,绿脓菌素,鼠李糖脂,海藻酸盐和胞外多糖的抑制率分别为28.37%-70.26%,29.63%-63.34%,42.16%-71.84%,25.36%-59.47%,24.25%-59.47,39.83%-79.54%。q RT-PCR反应分析表明,3.0mg/m L的ZHG 2-1 CE处理后,调控群体感应的基因las I/R和rhl I/R的表达下调,下调接近70%,其中rhl I的下调最为显著,接近80%。ZHG 2-1 CE对鞭毛介导的群集运动以及菌毛介导的泳动运动具有较强的抑制作用。以上所有效果均显示出剂量依赖性。此外,流式细胞仪分析结果表明,3.0 mg/m L菌株ZHG 2-1 CE可降低铜绿假单胞菌对小鼠巨噬细胞Ana-1细胞的毒力作用。3.通过96孔板法测定单独使用ZHG 2-1粗提物、阿奇霉素以及二者组合使用时对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用和预先形成的生物膜的清除作用。结果表明,阿奇霉素单独使用时,作用效果并不显著,ZHG 2-1单独使用具有一定的生物膜抑制作用,但是当二者组合使用时,ZHG 2-1粗提物可以显著提高阿奇霉素对生物膜的敏感性,sub-MIC处理的抑制率为58.4-90.3%。SEM图片结果表明,ZHG 2-1粗提物与阿奇霉素的组合可破坏生物膜的结构,并且减少预先形成的成熟生物膜的厚度,经过葡聚糖酶处理过的生物膜的细胞存活率进一步证实了上述结果。此外,ZHG 2-1粗提物与阿奇霉素单独使用以及组合使用时,对浮游细胞的存活没有影响。表明ZHG 2-1可以作为有潜力的抗生物膜制剂以及抗生素促进剂。

摘要译文

关键词：

面包乳杆菌ZHG2-1; 铜绿假单胞菌; 群体感应淬灭; 毒力因子; 生物膜

学位年度：

2020

学位类型：

硕士

学科专业：

食品科学

导师：

白凤翎

中图分类号：

TS201.3[食品微生物学]

学科分类号：

082202[发酵工程];083201[食品科学];083606[微生物发酵工程]

D O I：

10.27190/d.cnki.gjzsc.2020.000755