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基于磁性蛋白MagR的群感信号分子水解酶AiiA的固定化研究认领

作者：

王琳

学位授予单位：

武汉理工大学

摘要：

群感效应(Quorum sensing,QS)是细菌根据密度大小进行的细胞内或细胞间的信息交流(Cell-cell communication),协调群体行为和调控基因表达的一种重要的行为方式。N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHL)作为群感效应系统的信号分子,在其中起到重要作用。当环境中的AHLs的浓度达到一定阈值时,QS系统的相关基因的启动子才会被激活,进而调控其表达。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都受群体感应系统的调控。QS系统参与调控了许多重要的生物学功能:如参与抗生素合成、生物膜的形成、生物发光、生物群游现象和质粒结合转移等。在生活中,革兰氏阴性细菌是主要的致病菌,其致病因子就是通过细菌的群体感应系统来进行调控。铜绿假单胞菌(革兰氏阴性细菌)生成的生物膜也是受群体感应系统调控。其生物膜的生成与铜绿假单胞菌在机体内产生耐药性有很大的关系。在医疗实践上,当植入体进入人体之后会发生细菌感染的问题,其中一个主要原因是由于植入体表面形成了生物膜,阻止抗生素和杀菌药物的渗透以及免疫细胞对细菌的吞噬,从而导致植入体表面抗生素和机体免疫机制的失灵。因此在医疗植入物的特定表面抑制QS,有利于阻止生物膜形成,提高抗生素和机体对于黏附细菌的清除。AiiA基因是细菌群感效应的猝灭基因。苏云金芽孢杆菌中的AiiA基因表达产物为N-酰基高丝氨酸内酯酶(AHL-Lactonase),是一种具有降解AHLs分子能力的水解酶,能够降低相对封闭环境中的AHLs的量,导致革兰氏阴性细菌的群体感应系统被阻滞甚至破坏,从而极大地减弱致病菌的危害能力。这种方法有望成为生物防治革兰氏阴性病原菌的新手段。为了解决植入体表面细菌感染的问题,可以通过固定的N-酰基高丝氨酸内酯酶来降解或修改植入体特定区域的QS信号来实现。但进入人体游离的N-酰基高丝氨酸内酯酶会向不同周围环境扩散,从而影响其效果。通常,酶可以通过化学或物理手段固定化,通过修饰酶或支持物/载体来使彼此之间产生特定的相互作用,保持其浓度,例如亲和标签结合,载体上的吸附,包埋,交联,共价键。然而,常规融合标签之间的相互作用依赖于环境的pH,盐度和离子强度,这可能不适合标记酶的活性。本论文希望基于磁性蛋白MagR介导的AiiA酶的固定化,从而创立一种新的酶固定化方法,以克服蛋白质传统固定方法的缺点,从而用于预防和清除医疗植入体表面的细菌黏附。本文的研究结果如下:(1)AiiA-MagR重组蛋白的表达构建。将人工合成的AiiA基因与MagR基因的pET28a质粒进行酶切、连接、纯化等分子生物学操作,得到重组表达质粒pET28a[AiiA-MagR],并用菌落PCR、测序进行验证。对构建正确的重组质粒进行目标蛋白的诱导表达研究,并对表达条件进行优化(培养基、温度、时间、IPTG浓度),获得目标蛋白。(2)AiiA-MagR重组蛋白固定化研究及相关表征。优化表达后的融合蛋白与磁珠在室温下相互作用,得到IB@[AiiA-MagR]。SDS-PAGE电泳和BCA蛋白浓度法均证实蛋白确实结合在磁珠上。Zeta电势,FTIR光谱和SEM电镜结果也一致证实融合蛋白AiiA-MagR确实固定在磁性纳米颗粒(IB)上了。(3)IB@[AiiA-MagR]的酶活性和抑制生物膜功能的研究。通过定性和定量的CV026简单生物测定实验,证实IB@[AiiA-MagR]具有酶活性。在铜绿假单胞菌生物膜的实验中,证实了IB@[AiiA-MagR]存在抑制生物膜的功能,保留有AiiA蛋白的生物学活性。

摘要译文

关键词：

群体感应信号; 水解酶; AiiA; MagR; 磁固定

学位年度：

2019

学位类型：

硕士

学科专业：

药学

导师：

徐海星

中图分类号：

R943[制剂学]

学科分类号：

083611[医药生物工程];100603[中西医结合药学];100702[药剂学]

D O I：

10.27381/d.cnki.gwlgu.2019.000759