高产GABA乳酸菌的筛选鉴定、发酵优化及谷氨酸脱羧酶基因的分子改造-文献详情-维普官网

文献检索

任意字段

文献信息

任意字段
主题词
篇关摘
篇名
关键词
摘要
作者
第一作者
作者单位
刊名
中图分类号
学科分类号
DOI
基金

智能检索

高级检索

检索历史

高产GABA乳酸菌的筛选鉴定、发酵优化及谷氨酸脱羧酶基因的分子改造认领

被引量： 10

作者：

陈静

学位授予单位：

四川轻化工大学

摘要：

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),是能够将谷氨酸(Glutamate,L-glu)转化成 γ-氨基丁酸的唯一酶。γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA),是生物体内广泛存在的一种非蛋白氨基酸,具有许多重要的生理功能,如降低血压、镇静和预防老年痴呆等,因此,GABA在制药、食品、保健等行业存在巨大的应用潜能。目前,国内产GABA野生菌株能力较低,同时,在发酵生产过程中,GAD的最适pH偏低,普遍在4.0-5.0之间,当pH达到6.0时,酶就因解聚而失活,不利于工业应用。因此,为了得到能够高产GABA的菌株和拓宽GAD的pH适应范围,本研究从泡菜样品中筛选高产GABA的菌株,优化其发酵条件,同时在体外对GAD分子进行改造。主要研究内容和结果如下:1.高产GABA菌株的筛选鉴定。本研究以自贡地区的酸菜为样品,以乳酸菌产酸分解含有碳酸钙的MRS培养基形成溶钙圈为依据,初步筛选出乳酸菌,再通过TLC和HPLC法筛选出4株能够产GABA的菌株,对4株产GABA的菌株分别进行发酵培养,以产GABA的标准菌株CICC22144为对照,检测到其GABA的产量分别为 0.736g/L,0.691g/L,1.11g/L 和 1.92 g/L。对产量最高的 Liulab84菌株进行形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学鉴定,结果表明其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),命名为 Lactobacillus plantarum LC84。2.菌株产GABA发酵条件优化。通过单因素和正交试验,进行发酵条件优化后,结果表明A3B2C1D3为最优组合,即L.plantarum LC84的最优发酵条件确定为:发酵温度39℃,pH6.0,接种量4%,发酵时间60h,测得GABA的含量为3.83 g/L,。3.谷氨酸脱羧酶基因的克隆表达。利用分离得到的L.plantarum LC84作为出发菌株,得到其中的GAD基因亚克隆,与pET28a(+)质粒连接,构建重组质粒pET28a-gad在E.coli BL21(DE3)中进行表达,分离纯化,检测其酶学性质。结果表明,来自不同物种的谷氨酸脱羧酶,在碱基序列上也存在较大的差异。SDS-PAGE电泳分析检测表达了一个约53KDa的可溶性蛋白。对得到的蛋白进行纯化,检测其酶活和基本的酶学性质,谷氨酸脱羧酶的酶活最适pH为4.8,最适温度在45-50℃之间,最适辅酶磷酸哔多醛(PLP)的添加量为50μm/L,研究中添加的金属离子对酶活都没有明显的促进作用,相反,Cu2+和Ag+对酶活具有强烈的抑制作用,Ag+几乎使GAD酶失活。4.谷氨酸脱羧酶的分子改造。为拓宽GAD的pH适应性,利用同源建模的方法对其进行分子改造。采用DPn1的方法,对野生谷氨酸脱羧酶成功进行了定点突变,成功将294位点的天冬氨酸(ASP)突变为甘氨酸(Gly),307位点的丝氨酸(Ser)突变为天冬酰胺(Asn),312的位点谷氨酸(Glu)突变为丝氨酸(Ser),346的位点谷氨酰胺(Gln)突变为组氨酸(His),进过突变之后,E312S突变体,在pH4.8条件下,酶活为野生型的1.6倍左右,在pH6.2时,突变体酶活相比于野生型提高了 5倍左右,在4.8-5.8范围内,酸性稳定性保持60%以上。Q346H突变体,在pH4.8条件下,酶活稍高于野生型,在pH6.2处,其酶活提高了 2倍左右,在4.8-5.8范围内,Q346H突变体,保持40%以上酶活性。综上,从酸菜中获得了野生产GABA的植物乳杆菌,通过对其发酵条件进行优化,最大限度地发挥菌种生产GABA的性能,同时对植物乳杆菌中的GAD,利用基因工程手段进行外源表达,在此基础上,进行定点突变,拓宽了该酶的反应pH,为GAD酶学性质的改造提供依据,同时为生产GABA的工业应用中降低生产和设备损耗成本奠定基础。

摘要译文

关键词：

植物乳杆菌; 谷氨酸脱羧酶; γ-氨基丁酸; 基因克隆与表达

学位年度：

2019

学位类型：

硕士

学科专业：

食品工程（专业学位）

导师：

余志刚

中图分类号：

TQ922[发酵法制氨基酸]

学科分类号：

081703[生物化工];082202[发酵工程];083604[生物过程工程];083606[微生物发酵工程]

D O I：

10.27703/d.cnki.gsclg.2019.000051