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单环刺螠ACE抑制肽的制备及其作用机制研究认领

被引量： 5

作者：

初雪梅

学位授予单位：

浙江海洋大学

摘要：

本课题以单环刺螠（Urechis unicinctus）为原料,运用可控酶解技术,以血管紧张素转化酶（ACE）的抑制率为筛选指标,制备具有降压活性的生物活性肽。样品原料经过脱脂,烘干,酶解,超滤、Sephadex G-15凝胶柱层析、反相高效液相色谱（RP-HPLC）及质谱测序等一系列分离纯化和鉴定技术得到7条具有ACE抑制活性的寡肽,并在化学水平与细胞水平上研究其降压活性及其与之相关的氧化应激保护活性。通过酶动力学与计算机模拟分子对接技术,探讨活性多肽与ACE之间的作用方式。主要研究内容与结果如下:（1）ACE抑制肽的制备:以ACE抑制率为指标,对蛋白酶及酶解条件进行筛选。首先,将脱脂之后的单环刺螠粉末分别在胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的最适条件下进行酶解,得到的中性蛋白酶酶解液有较高的ACE抑制率;通过单因素实验进一步优化酶解条件,最终确定最佳酶解条件为:中性蛋白酶,45℃、pH 7.0、加酶量4%、料液比1:30、酶解时间4 h。在最佳酶解条件下进行酶解,并进行超滤分段,活性评价结果显示<1 kDa的酶解液组分的ACE抑制率最佳,对该组份依次通过Sephadex G-15凝胶层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行分离纯化,得到7条寡肽（F1-F7）。经质谱和氨基酸序列分析确定其序列为:Gln-Pro-Met-Thr-Phe（F1）、Ile-Val-Lys-His-Phe（F2）、Phe-Pro-Tyr-Lys-His（F3）、Trp-Pro-Gly-Lys-Ala（F4）、Gly-Leu-Thr-Lys-Pro（F5）、Met-Pro-Gln-Gly-Ile-Val-Val（F6）、Ile-Val-Met-Arg-Ile（F7）。（2）单环刺螠多肽对ACE的抑制活性:对寡肽F1-F7进行ACE抑制率筛选,结果表明F2、F3、F4、F5以及F7具有较好的ACE抑制活性且明显高于其余多肽,其IC50值分别为0.47 mg/mL、0.71 mg/mL、0.32 mg/mL、0.29 mg/mL和0.38 mg/mL,并对其进行了构效关系分析。通过酶动力学与计算机模拟分子对接技术发现,多肽F2、F4、F5、F7与ACE是竞争性抑制,而F3则是非竞争性抑制。（3）单环刺螠ACE抑制肽对血管内皮细胞中血压调控因子的影响:选择ACE抑制活性较好的F2、F3、F4、F5和F7作用于HUVEC细胞,实验结果表明:F2、F3、F4、F5和F7在一定浓度范围内（50-200μM）对HUVEC细胞无毒副作用;此5条寡肽,不仅能够抑制内源性收缩因子内皮素（ET-1）的生成,促进舒张因子一氧化氮（NO）的释放,还可以一定程度的激活内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）,抑制诱导型一氧化氮合酶（induced nitrogen monoxide synthase,iNOS）的活性,从而释放更多的NO,改善由去甲肾上腺素引起的内皮细胞功能障碍。（4）单环刺螠ACE抑制肽对氧化损伤的HUVEC细胞的保护作用:以超氧阴离子（O2.-）清除率为指标,筛选出清除活性较好的F4和F5进行后续实验。采用H2O2诱导HUVEC建立氧化损伤模型,结果表明:双氧水浓度为700μM,损伤4 h时建模成功;两种肽均能促进细胞NO的释放,提高细胞内SOD和CAT活力,并降低MDA与细胞外培养液中LDH的含量。通过DCFH-DA染色观察显示单环刺螠多肽（F4和F5）能减少H2O2诱导的HUVEC细胞活性氧的增加,且活性呈浓度依赖性。因此,F4与F5对双氧水诱导的HUVEC细胞氧化损伤具有一定程度的保护作用。综上,中性蛋白酶酶解的单环刺螠多肽经超滤、凝胶色谱和高效液相色谱纯化后,通过ESI-MS鉴定出7条肽,通过细胞实验发现肽F2、F3、F4、F5和F7具有较好的ACE抑制作用,并且肽F4和F5具有保护氧化损伤的HUVEC细胞的作用。

摘要译文

关键词：

单环刺螠; 寡肽; ACE抑制; 酶动力学; 分子对接; 氧化应激

学位年度：

2020

学位类型：

硕士

学科专业：

海洋科学

中图分类号：

Q516[蛋白质的一级结构⑨]

学科分类号：

070306[化学生物学];071005[生物化学与分子生物学];100107[医学生物化学与分子生物学]

D O I：

10.27747/d.cnki.gzjhy.2020.000226