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3D生物活性玻璃复合PTH相关肽用于大鼠脊柱融合的实验研究认领

作者：

梁博

学位授予单位：

上海交通大学

摘要：

目的能够替代自体髂骨促进成功脊柱融合的骨组织工程材料是目前脊柱外科领及组织工程域研究的热点。甲状旁腺素(PTH)是人体钙磷平衡及骨代谢过程中扮演重要作用的分子,该分子在对于骨代谢的作用中表现出两面性,既可促进成骨活动又可促进破骨活动。其相关活性肽段PTH(1-34)是已被FDA批准的治疗骨质疏松的合成代谢药物,目前以全身用药方式为主。利用骨组织工程支架材料作为载体将PTH(1-34)进行局部应用有希望成为具有高效成骨效果的骨组织工程材料。本次研究我们利用3D介孔生物活性玻璃(MBG)作为支架,复合PTH(1-34)制成骨组织工程材料,对其诱导成骨的能力及相关作用机理进行探索。并观察该复合支架材料植入大鼠体内后促进脊柱融合的情况,为其进一步临床应用的研究提供相关理论依据。研究内容(1)3D生物活性玻璃(MBG)支架的制备、PTH相关肽的复合及材料的表征测定。通过使用改良溶胶-凝胶聚氨酯泡沫法制备与人体松质骨具有相似空间结构、孔隙率和孔径的3D MBG支架材料;用浸润冻干法将PTH(1-34)复合于支架中。利用透射电镜观察制备成的支架材料;使用BET和BJH法对材料的比表面积,孔容及孔径分布情况进行测定;使用压力测试器测定其抗压强度;根据阿基米德定律测定材料的孔隙率。测定PTH(1-34)/3D MBG支架材料在PBS液中PTH(1-34)的释放速率。(2)观察不同浓度PTH(1-34)/3D MBG支架对BMSCs增殖、黏附及分化的影响。将BMSCs分别与含有高浓度和低浓度PTH(1-34)的3D MBG支架材料以及不含PTH(1-34)的MBG支架材料共同培养后通过激光共聚焦显微镜(CLSM)及扫描电镜(SEM)观察BMSCs在其表面的形态及黏附情况;通过使用CCK-8试剂盒检测BMSCs的增殖情况;利用ALP试剂盒测定其ALP生成情况;通过使用q RT-PCR检测成骨相关基因ALP、BMP-2、BMP-4、COL-1、Runx-2及OCN,成血管相关基因VEGFa的表达情况。利用western blot检测经典(smad依赖)和非经典(非smad依赖)BMP通路相关基因的表达情况,以及wnt通路相关基因的表达情况,以阐明其促进成骨生物活性的内在分子机制。(3)观察将PTH(1-34)/3D MBG作为骨移植替代材料促进SD大鼠脊柱融合的作用。将含有高浓度和低浓度PTH(1-34)的3D MBG支架材料以及不含PTH(1-34)的MBG支架材料分别植入SD大鼠的L4-5横突之间,利用荧光标记物在术后观察术后各时间段新骨生成的情况。利用Micro CT检查、手触动检查以及组织学观察检测其促进脊柱融合的能力。通过动物实验研究检验其作为具有促进骨生成作用的骨移植替代物应用于生物体内时的实际效果,为其进一步的实际临床应用奠定实验基础。结果(1)改良溶胶-凝胶聚氨酯泡沫法可成功制备出具有分层介孔结构的3D MBG。通过透射电镜对其观察可见高度有序的孔道结构。通过对其比表面积、孔径、孔容以及孔隙率和抗压强度等表征的测定发现其具有与人体松质骨相似的物理特性和空间结构,且PTH(1-34)的复合对其物理特性和空间结构无明显影响。3D MBG可作为有效的药物载体对其搭载的PTH(1-34)进行释放,并在48小时内达到最大释放量,高浓度PTH(1-34)的支架较低浓度能释放出更高比率的药物。(2)含PTH(1-34)的材料组的细胞黏附情况均优于不含PTH(1-34)的MBG材料组,且高浓度PTH(1-34)组优于低浓度组,在高浓度组中的细胞相较于其他组,材料表面细胞数量明显更多,胞质伸展的更为明显,细胞中心扁平化及细胞质网状舒展也更为明显。CCK-8结果显示PTH(1-34)/3D MBG组比不含肽的3D MBG组可显著促进BMSCs的增殖,且高浓度组优于低浓度组。在未复合PTH(1-34)的3D MBG材料组,BMSCs几乎无成骨分化,而在PTH(1-34)/3D MBG材料组ALP生成及成骨相关基因ALP、BMP-2、BMP-4、COL-1、Runx-2和OCN等均显著升高,且高浓度组优于低浓度组。BMSCs在与PTH(1-34)/3D MBG材料共同培养后,多条成骨相关信号通路均明显激活,包括经典与非经典的BMP通路和wnt通路,P-smad 1/5/8,P-smad 2/3,P-GSK3β,P38以及β-catenin均高表达于两组PTH(1-34)/3D MBG组,且高浓度组较低浓度组更为显著。在不含PTH(1-34)的3D MBG材料组,各基因皆未出现表达量的明显提高。(3)将PTH(1-34)/3D MBG材料与不含PTH(1-34)的3D MBG材料植入SD大鼠L4-5横突后,利用荧光显微镜对术后2、4、6周新骨生成情况的观察结果显示含有PTH(1-34)的材料组可显著提高新生骨组织的数量并加快新骨生成的速度。术后12周时,Micro CT结果显示不含PTH(1-34)的3D MBG材料组未能获得成功的融合,两组PTH(1-34)/3D MBG材料组皆获得了成功的融合,且高浓度组在融合部位显示出形成了更大的骨块且骨密度更高。组织学检查显示高浓度组有更大融合面。手动触摸检查所有高浓度皆获得了牢固的融合,低浓度组获得了83.3%(5/6)的牢固融合,未复合PTH(1-34)的3D MBG材料组中皆无牢固融合。结论使用改良溶胶-凝胶聚氨酯泡沫法可成功制备具有分层介孔结构的3D MBG支架材料,其具较大的比表面积和与正常人体松质骨相似的孔隙率、孔径、空间结构及抗压强度。用浸润冻干法复合PTH(1-34)后其相关物理特性无明显变化。PTH(1-34)/3D MBG支架材料作物骨移植替代物,既可在局部提供足够的物理支撑能力,其在局部释放出的PTH相关肽又能促进局部新骨生成的生物学活动。在将材料与BMSCs共同培养后,相比于不含PTH(1-34)的3D MBG材料,PTH(1-34)/3D MBG材料能显促进BMSCs黏附、增殖及向成骨方向分化的能力,其中含有高浓度PTH(1-34)的材料对BMSCs的相关生物学活性的影响最为积极。通过对成骨相关基因及信号通路的表达与激活情况的检测发现,经典与非经典的BMP通路及wnt通路在BMSCs成骨分化的过程中皆被激活,说明复合于材料中的PTH(1-34)是一个强大的具有刺激骨生长能力的生长因子,可通过多条成骨信号通路激活BMSCs的成骨分化作用。将材料植入SD大鼠L4-5横突之间3个月后,高浓度PTH(1-34)组几乎全部获得了牢固融合,而不含PTH(1-34)的材料组几乎未获得融合。因此PTH(1-34)/3D MBG支架材料拥有良好的生物相容性和成骨的生物学活性,其能明显促进BMSCs的黏附、增殖及成骨方向分化。其提供的局部物理支撑配合PTH(1-34)带来的成骨生物活性,可为能够成功促进脊柱融合的骨移植替代物的研究带来新的希望。

摘要译文

关键词：

骨组织工程; 脊柱融合; 骨髓间充质干细胞; 甲状旁腺激素; 支架材料

学位年度：

2018

学位类型：

硕士

学科专业：

外科学（骨科学）

导师：

徐建广

中图分类号：

R318.08[生物材料学];R687.3[骨骼手术⑨]

学科分类号：

080501[材料学];080504[高分子材料];083104[生物材料与组织工程];083608[材料生物工程];100202[普通外科学];100203[骨科学]

D O I：

10.27307/d.cnki.gsjtu.2018.005143