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H2O2、MAPKs蛋白激酶对白木香愈伤中2-苯乙基色酮含成的影响认领

被引量： 1

作者：

董先娟

学位授予单位：

北京中医药大学

摘要：

白木香（Aquilariasinensis）为瑞香科沉香属植物,白木香树在受到外界损伤刺激后能于伤口附近逐渐形成含有特殊香味的树脂,称之为沉香。沉香是传统名贵中药,具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效,同时沉香也是名贵的香料。目前,关于白木香受刺激后形成沉香（结香）的分子机制亟待阐明,进而为建立针对性的结香方法,人为调控结香的进程及质量提供理论指导。2-苯乙基色酮类化合物是沉香的主要化学成分和特征性成分,也是参与白木香防御反应的重要物质,H2O2、产生H2O2的关键酶-NADPH氧化酶、MAPKs蛋白激酶在植物响应生物与非生物胁迫中发挥着重要作用,但其是否能够影响白木香愈伤组织中2-苯乙基色酮的生物合成目前尚无明确报道。因此本课题旨在研究盐胁迫下白木香愈伤组织中H2O2、NADPH氧化酶、MAPKs蛋白激酶与2-苯乙基色酮生物合成的相关性,取得以下研究进展:一、盐胁迫能够使愈伤组织的细胞活性显著降低,在120 h降低到正常细胞的5%以下。因此我们在盐胁迫初期研究H2O2和NADPH氧化酶在2-苯乙基色酮生物合成中的相关性。盐胁迫初期,2-苯乙基色酮的含量持续上升,而H2O2的含量在24 h达到最高,之后显著降低。盐胁迫下外源添加H2O2 120 h能够显著降低2-苯乙基色酮的含量,而盐胁迫下添加DMTU（H2O2的清除剂）120 h,2-苯乙基色酮的含量明显增加。NADPH氧化酶,又称为Rboh,是盐胁迫下产生H2O2的主要酶类。为研究NADPH氧化酶对2-苯乙基色酮生物合成的影响,根据白木香愈伤组织转录组数据,通过RT-PCR结合RACE技术从白木香愈伤组织中克隆得到3个Rboh基因:AsRbohA-C。盐胁迫下AsRbohA-C的表达量与NADPH氧化酶的活性24 h瞬时增加,之后降低,这与H2O2在盐胁迫下的变化趋势一致。盐胁迫下外源添加H2O2能够增加AsRbohA-C的表达量和NADPH氧化酶的活性,而添加DMTU后AsRbohA-C的表达量和NADPH氧化酶的活性明显降低,说明NADPH氧化酶能够参与白木香愈伤组织中2-苯乙基色酮的生物合成。为进一步确定NADPH氧化酶与2-苯乙基色酮生物合成的相关性,盐胁迫下利用NADPH氧化酶的抑制剂—DPI处理愈伤组织120 h,发现DPI能够明显降低盐胁迫下AsRbohA-C的表达量和NADPH氧化酶的活性,显著提高2-苯乙基色酮的产量。因此,盐胁迫初期H2O2和NADPH氧化酶影响2-苯乙基色酮的生物合成。二、盐胁迫初期,白木香愈伤组织产生的主要2-苯乙基色酮是AH6和AH8。为研究MAPKs蛋白激酶与2-苯乙基色酮生物合成的相关性,利用MAPKK的抑制剂PD98059处理盐胁迫下的白木香愈伤组织,LC-MS-IT-TOF与Qtrap检测发现愈伤组织中含有的2-苯乙基色酮AH6和AH8的含量明显降低,预测MAPKs蛋白激酶家族可能影响2-苯乙基色酮的生物合成。台盼蓝与DAB染色的方法表明盐胁迫诱导愈伤组织细胞凋亡,预示2-苯乙基色酮生物合成可能与细胞凋亡相关。利用RT-PCR技术首次在白木香愈伤组织中克隆得到AsMAPKK5基因,农杆菌注射瞬时表达证明,AsMAPKK5定位于细胞壁和细胞核中,并且瞬时表达的本生烟叶片呈现明显的凋亡现象,同时利用台盼蓝和DAB染色证明瞬时表达AsMAPKK5使叶片细胞产生凋亡和大量的H2O2。实时荧光定量PCR结果表明AsMAPKK5在盐胁迫下其表达量上升,同时PD98059能够抑制AsM4PKK5的表达量。在白木香悬浮细胞中过表达AsMAPKK5,实时荧光定量PCR检测发现其能够显著提高生物合成2-苯乙基色酮关键酶AsPKS3的表达量。三、MAPKs蛋白进行信号传递都是通过MAPKKK-MAPKK-MAPK级联途径进行传递的,利用酵母双杂筛选结果表明AsMAPKK5与AsMAPK11互作。农杆菌注射实验表明AsMAPK11定位于细胞壁上,DAB和台盼蓝染色结果表明AsMAPK11不能够诱导细胞凋亡。利用双分子荧光实验、GST Pull down和Far Western Blotting结果表明AsMAPKK5和AsMAPK11能够在体内体外互作。实时荧光定量PCR分析发现,AsMAPK11在NaCl和PD98059处理下表达量的变化趋势与AsMAPKK5相似。在白木香悬浮细胞中过表达AsMAPK11,实时荧光定量PCR检测发现其能够显著提高生物合成2-苯乙基色酮关键酶AsPKS3的表达量,以上结果证明AsMAPKK5-AsMAPK11级联途径能够影响2-苯乙基色酮的生物合成。综上,H2O2、NADPH氧化酶以及AsMAPKK5-AsMAPK11能够参与盐胁迫下沉香中2-苯乙基色酮生物合成,这为阐明白木香树在胁迫条件下生成沉香的分子生物学机制提供理论依据,为改善、建立高效的白木香结香技术提供指导。

摘要译文

关键词：

白木香; H2O2; NADPH氧化酶; MAPKs; 2-苯乙基色酮

学位年度：

2018

学位类型：

硕士

学科专业：

中药化学

导师：

王晓晖

中图分类号：

R284.1[化学分析与鉴定]

学科分类号：

1005[中医学];100803[中药鉴定学];100804[中药化学];100805[中药分析学]

D O I：

10.26973/d.cnki.gbjzu.2018.000307