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红曲霉产GABA、桔霉素相关基因的克隆认领

被引量： 3

作者：

陈璨

学位授予单位：

浙江师范大学

摘要：

红曲霉(Monascus spp.)是我国酿造微生物中的一个重要的属,至今已有数百年的历史。近几年红曲霉的许多功效相继被证实,其发酵产物γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid, GABA)、莫纳可林K (Monacolin K)、红曲色素等己广泛应用于医药保健、食品加工及相关领域中。1995年法国学者首先在红曲中发现毒性物质—桔霉素,使红曲产品在国内外销售受到了一定限制。目前GABA、桔霉素等产物的生产、调控及应用已成为国内外研究的热点,虽进展比较缓慢,大多数研究成果暂时还不能应用于生产,技术手段尚处于建立阶段,但对调控GABA、桔霉素代谢的基因研究,是未来红曲霉产物调控、生产的必要基础。本实验利用红曲霉(Monascus ruber) Mr-5菌株(CGMCC NO. M208043)作为实验材料,建立了根癌农杆菌介导红曲霉的高效转化体系,获得了1478株红曲霉转化子,通过摇瓶发酵并对GABA、桔霉素进行检测,筛选到50余株GABA、桔霉素产量与原始菌株有较大变化的红曲霉突变子,进而以HPLC技术进行精确定量。之后利用TAIL-PCR和hiTAIL-PCR两种方法扩增部分转化子的T-DNA侧翼序列,获得与GABA、桔霉素代谢相关的基因片段,通过生物信息学比对,扩增出相关基因全长。通过生物信息学软件分析了相关基因功能。主要研究结果如下：1、根癌农杆菌介导的红曲霉T-DNA插入突变体库的构建利用根癌农杆菌AGL-1菌株对红曲霉Mr-5菌株进行转化,探讨了农杆菌浓度、诱导时间、诱导剂浓度、红曲霉培养时间、孢子浓度、共培养温度、共培养时间等条件,建立了一个高效的红曲霉转化体系：将根癌农杆菌AGL-1活化2d～3d,挑取单菌落扩大培养到OD600约为0.15。离心得菌体,加入含有50～200 μmol/L AS、pH值5.0-5.8的IM培养基,菌悬液培养至OD600约为0.5。以无菌水洗下培养21d的红曲霉孢子,经4层擦镜纸过滤,去除菌丝及杂质,制成105个/mL左右的孢子悬液。两种悬液等体积混匀,涂布于贴在Co-IM培养基的承载膜上,25℃培养2.5 d。将膜揭下贴于含有头孢霉素和筛选物质的平板上。待转化子长出,挑取单菌到筛选平板上,并转接5-6次,验证遗传稳定性。2、转化子的遗传稳定性分析、PCR鉴定及形态观察在1478株红色红曲霉转化子随机挑选50株转化子接种于PDA培养基,30℃、7d培养,转接6次以上后至PDA培养基(150 μg/mol潮霉素B)上培养,观察菌落生长情况,计算红曲霉转化库的稳定性。提取转化子基因组DNA,对潮霉素抗性基因进行扩增。结果显示,随机挑选的转化子中96%的样本基因组中存在潮霉素抗性基因,表明该T-DNA插入突变库的遗传稳定性高,符合实验要求。对各转化子的菌落形态及显微形态观察。大部分转化子形态及生理生化特征与原始菌株相似,少数转化子在菌落颜色、菌落形态、生长速度、显微特征等方面发生了较大变化。3、GABA、桔霉素产量变化较大的红曲霉突变子的筛选利用250mL锥形瓶对红曲霉转化子进行发酵培养,通过纸层析法对1478株转化子的发酵液进行检测,选取部分GABA产量变化较大的红曲霉转化子进行再发酵,通过高效液相(HPLC)法对其GABA产量进行精确测定；通过薄层层析对1478株转化子的发酵液进行检测,选取部分桔霉素产量变化较大的红曲霉转化子进行再发酵,通过HPLC法对其桔霉素产量进行精确测定。最终获得50余株GABA、桔霉素产量较原始菌株Mr-5变化较大的红曲霉转化子。4、转化子T-DNA侧翼序列扩增及生物信息学分析利用TAIL-PCR和hiTAIL-PCR技术,通过T-DNA右翼序列设计3条嵌套引物、7条短简并引物和5条长简并引物,对插入红曲霉转化子T-DNA的侧翼序列进行扩增,经过测序获得片段序列。通过Blast比对,表明82号突变子T-DNA侧翼片段与细菌色氨酸合成酶B亚基基因有66-100%的相似性:1358号突变子T-DNA侧翼片段与细胞色素C过氧化物酶基因有85%的相似性；1338号突变子T-DNA侧翼片段与B葡糖苷酶基因有99%的相似性；660号突变子T-DNA侧翼片段,经比对与多种细菌、真菌的谷氨酸脱羧酶(GAD)相似程度较高,特别是与黑曲霉(Aspergillus niger)部分片段相似程度达到79%,与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)部分片段相似程度78%,与棒曲霉(Aspergillus clavatus)部分片段相似程度达到76%。5、红曲霉GAD基因的扩增、验证与分析将TAIL-PCR所得片段与红曲霉Mr-5的cDNA进行比对分析,设计引物并以红曲霉基因组作为模板,扩增出G2-1片段；经上下游序列的分别验证,证明了该片段为红曲霉Mr-5基因组中的完整序列,并确认了内含子与外显子部分,通过Orf Find、Conserved Domains、Blastp、ClustalX等工具分析了该基因序列的氨基酸组成。

摘要译文

关键词：

红曲霉; ATMT; GABA; TAIL-PCR; GAD

学位年度：

2015

学位类型：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

蒋冬花

中图分类号：

Q933[微生物遗传学]

学科分类号：

071003[微生物学];071007[遗传学]

D O I：

10.7666/d.Y2905513