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乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位融合蛋白（S/preS1）在CHO细胞中的稳定高效表达认领

被引量： 1

作者：

杨振西

学位授予单位：

安徽大学

摘要：

乙型肝炎是一种严重的全球性疾病,易引发肝硬化和肝癌。目前国内外尚无显著有效的乙肝治疗方法,主要采用预防为主、治疗为辅的方针。自从1981年第一代乙肝疫苗问世至今,乙型肝炎的蔓延得到有效地控制,全球肝癌的发生率下降了75%。目前全球广泛使用的是利用基因工程技术在酵母和哺乳动物细胞中表达的乙肝病毒表面抗原S蛋白(HBsAg)疫苗,接种疫苗后约有10-15%的人群无应答或者低应答,且一般不能诱导细胞免疫应答。研制能克服现有乙肝疫苗缺陷的新型乙肝疫苗已成为一项迫切的研究课题。研究表明,在主蛋白抗原S的基础上增加额外的HBV表面抗原能够增强免疫原性,含前S蛋白的重组乙型肝炎疫苗是第三代乙肝疫苗研发的重点,有望替代现在广泛使用的基因工程疫苗。本研究的研究思路是将乙肝病毒S抗原基因和preS1抗原表位(21-47位氨基酸)基因组合形成融合基因,在CHO细胞中实现S/preS1的稳定高效表达。本研究采用转录水平调控为主、转录后调控为辅的表达载体设计思想,将S/preS1基因插入含有克服位置效应、细胞内源性强启动子及mRNA运输及稳定性调控元件的真核细胞表达载体,成功构建表达乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位(21-47位氨基酸)融合蛋白(S/preS1)的真核表达载体HMRCHEF53u/Neo-S/preS1。通过脂质体介导表达载体转染CHO-S细胞,经有限稀释克隆筛选,在96孔板内获得单克隆细胞27株,ELISA检测表明均为阳性单克隆。将单克隆细胞经过24孔板、6孔板传入T25细胞方瓶,再次ELISA检测获得13株较高S/preS1表达水平的单克隆细胞系。对13株细胞系进行无血清悬浮批次培养,最终获得了体外生长性状好、S/preS1表达效率高的重组细胞系10G6。RT-PCR结果显示S/preS1基因在重组CHO细胞中得到表达,Western blot印迹分析证实10G6细胞表达的S/preS1同时保留S和preS1的天然免疫原性。以活细胞密度、S/preS1累计表达量、葡萄糖消耗量及乳酸积累量为观察指标,本研究考察了10G6细胞的生长表达特性及稳定性。有血清培养时10G6细胞的最高活细胞密度达到0.67×105cells/mL,S/preS1累积表达水平达到1.82μg/mL培养终止时葡萄糖剩余4.73mM,乳酸累积量为9.85mM。通过计算得到10G6细胞的比生长速率μ和S/preS1表达速率qS/preS1分别为0.2d-1和1.23μg/106cells/d。无血清培养时10G6细胞的最高活细胞密度达到5.4×106cells/mL, S/preS1累积表达水平达到3.99μg/mL,培养终止时葡萄糖完全消耗,乳酸累积量为8.8mM。通过计算得到10G6细胞的比生长速率μ和S/preS1表达速率qS/preS1分别为1.54d-’和0.88μg/106cells/d。结果表明,10G6细胞在无血清培养时的比生长速率μ高于有血清培养,S/preS1表达速率qS/preS1接近低于有血清培养。由于10G6细胞在无血清培养的活细胞密度明显高于有血清培养,相应地S/preS1累积量也明显高于的在10G6细胞在在有血清培养的水平。在为期约2月的连续15批次无血清培养中,各批次10G6细胞的活细胞密度基本保持在4×106cells/mL以上、活力维持在90%以上,反映10G6细胞表达稳定性的S/preS1值基本稳定在1-1.25mg/L水平,表明10G6细胞在无血清培养中具有良好的细胞生长和稳定的产物表达性状,符合生物技术药物规模化生产细胞系的质量要求。流加培养是当前重组蛋白生产的主流培养模式,流加培养根据细胞对营养物质的不断消耗和需求,在培养过程中流加浓缩的营养液,有效地减缓乃至消除营养限制因素,从而延长细胞培养时间,提高细胞培养密度及细胞表达产物浓度。本研究以活细胞密度、细胞活力和S/preS1表达水平为观察指标,分别考察了包括细胞接种密度、流加培养基选择、流加起始时间、培养温度等重要工艺参数,建立了以CHO CD EfficientFeedTM B为流加培养基、接种密度为3×105cells/mL、流加起始时间为2-3d、每48h按10%培养体积补充流加培养基、累计流加3次(30%培养体积)、起始培养温度为37℃、培养6d后温度下调至32℃、培养持续时间17-20d为主要工艺参数的10G6细胞无血清流加培养工艺。采用所建立的10G6细胞无血清流加培养工艺,不同批次10G6细胞流加培养的活细胞密度达到7-10×106cells/ml、S/preS1的累积浓度达到17-20mg/L,较之于10G6细胞的在温度设置为37℃的无血清培养工艺,10G6细胞无血清流加培养工艺的活细胞密度和S/preS1表达水平约分别提高60%和360%。

摘要译文

关键词：

乙肝病毒表面抗原; PreS1抗原表位; CHO细胞; 表达; 流加培养

学位年度：

2013

学位类型：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

陈昭烈

中图分类号：

R392[医学免疫学];R512.62

学科分类号：

100102[医学免疫学];100601[中西医结合基础医学]

D O I：

10.7666/d.Y2322049