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原花青素对2型糖尿病胰岛β细胞铁死亡的作用机制研究认领

作者：

李海燕

学位授予单位：

新疆医科大学

摘要：

目的:通过病例对照研究,探讨血清铁蛋白（Serum ferritin,SF）与2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）之间的联系;揭示铁死亡与β细胞功能损伤之间的关联,探讨原花青素是否通过铁死亡保护β细胞功能以及核因子红系2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）信号通路在β细胞铁死亡中的作用,明确原花青素保护效应可能的靶点。方法:（1）人群研究:选取石河子市人民医院符合T2DM纳入标准及排除标准的患者81例为病例组,按照年龄进行匹配的81例健康人为对照组。使用ELISA试剂盒检测SF浓度,同时测量被检者的身高、体重、血压及相关的生化指标。相关分析采用Pearson及Spearman相关,根据SF水平按照性别特异性四分位法将对照组分为4组,T2DM组采用对照组相同截点值进行分组,回归采用二元logstic回归分析。（2）动物实验:为研究铁死亡与β细胞功能损伤之间的关联,大鼠分为对照组、T2DM组、T2DM组+Fer-1（铁死亡抑制剂）组,为研究葡萄籽原花青素提取物（Grape seed proanthocyanidin extract,GSPE）对β细胞铁死亡的保护效应及机制,将大鼠分为6组,分别为对照组、对照组+GSPE（250mg/kg）组、T2DM组、125mg/kg GSPE组、250mg/kg GSPE组和500mg/kg GSPE组。记录大鼠的饮水、尿量、体重和血糖;ELISA试剂盒测量Hb A1c和胰岛素水平;根据血糖和胰岛素水平计算HOMA-IR;HE染色观察胰腺组织病理改变;透射电子显微镜观察β细胞线粒体超微结构改变;试剂盒检测胰腺组织谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）水平;免疫组化染色观察4-羟基壬烯醛（4-Hydroxynonenal,4-HNE）的含量;ELISA试剂盒、Lillie染色测量各组胰腺组织中铁水平;WB检测各组中铁死亡关键蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）、半胱氨酸/谷氨酸转运蛋白（cysteine/glutamate transporter,XCT）、酰基辅酶A合成酶长链家族4（acyl-Co A synthe-tase long-chain family 4,ACSL4）、Nrf2通路相关蛋白Nrf2、血红素加氧酶-1（Heme Oxygenase 1,HO-1）、醌氧化还原酶1(NAD（P）H Quinone Dehydrogenase1,NQO1)的表达水平;RT-qPCR对铁死亡特异性基因前列腺素内过氧化物合酶2（Prostaglandin-endoperoxide synthase,PTGS2）、GPX4、XCT及Nrf2通路相关基因进行定量分析;（3）细胞实验:小鼠胰岛瘤细胞株MIN6细胞根据实验目的分为三部分:（1）对照组、Erastin组、高葡萄糖+高棕榈酸钠损伤组（HG/SP）、HG/SP+Fer-1组、HG/SP+DFO组、HG/SP+Erastin组;（2）对照组、HG/SP组、HG/SP+GSPE-low（10mg/L）、HG/SP+GSPE-mid（20mg/L）和HG/SP+GSPE-high（30mg/L）组;;（3）对照组、对照组+siNrf2、HG/SP组、HG/SP+siNrf2组、HG/SP+siNrf2+GSPE组、HG/SP+siNrf2+Fer-1组。用CCK8检测细胞存活;PI染色检测细胞死亡;显微镜观察细胞形态;免疫荧光观察Nrf2的表达及分布;试剂盒检测GSH、MDA、SOD、荧光素酶;WB及RT-qPCR检测内容和胰腺组织检测内容相同。结果:（1）在人群中T2DM组的收缩压、空腹血糖、球蛋白和SF高于对照组,血红蛋白、高密度脂蛋白、白蛋白、总胆红素、直接胆红素和间接胆红素低于对照组,差异均具有统计学意义（P<0.05）;经相关性分析可得,在T2DM组中SF与舒张压成负相关,r=-0.2855,SF与空腹血糖成正相关,r=0.216（P<0.05）。在调整高密度脂蛋白、总胆红素、空腹血糖和血红蛋白后,SF OR=3.7（1.1～12.2）(P<0.05)。（2）与对照组大鼠相比,T2DM组大鼠饮水、尿量、血糖显著增加,体重减少（P<0.05）;胰岛素显著降低,HOMA-IR显著增加（P<0.05）;HE染色显示胰岛出现病理改变;转铁蛋白显著提升,Fe2+沉积明显（P<0.05）;GSH和SOD的水平显著降低,而MDA的水平显著升高（P<0.05）;4-HNE的蛋白质水平升高;β细胞线粒体出现膜破裂、嵴消失的现象,正常线粒体占比减少;GPX4和XCT的蛋白和mRNA表达显著降低,而ACSL4的蛋白和PTGS2的mRNA水平上调（P<0.05）;Fer-1处理能显著逆转这些结果。细胞实验也得到了相似的结果:与对照组相比,在使用Erastin、HG/SP、HG/SP+Erastin之后,均显著减少细胞的存活（P<0.05）;细胞出现铁死亡的形态特征且细胞死亡增加（P<0.05）;Fe2+沉积明显（P<0.05）;GSH和SOD的水平显著降低,而MDA和ROS的水平显著升高（P<0.05）;GPX4和XCT的蛋白和mRNA表达显著降低,PTGS2的mRNA水平上调（P<0.05）;而Fer-1和DFO处理能逆转这些损伤。（3）与T2DM组相比,GSPE可以降低大鼠饮水、尿量、血糖,增加体重（P<0.05）;胰岛素显著升高,HOMA-IR显著降低（P<0.05）;HE染色显示胰岛病理改变得到改善;转铁蛋白含量显著降低,Fe2+沉积减少（P<0.05）;GSH和SOD的水平显著上升,而MDA的水平降低（P<0.05）;4-HNE的蛋白质水平降低;β细胞线粒体损伤减轻,正常线粒体占比增加（P<0.05）;GPX4和XCT的蛋白和mRNA表达升高,而ACSL4的蛋白和PTGS2的mRNA水平下调（P<0.05）。细胞实验也得到了类似的结果,与HG/SP组相比,不同剂量组的GSPE处理后,细胞的存活增加（P<0.05）,细胞死亡减少（P<0.05）;Fe2+沉积降低（P<0.05）;GSH和SOD的水平升高,而MDA和ROS的水平显著下降（P<0.05）;GPX4和XCT的蛋白和mRNA表达升高,PTGS2的mRNA水平下调（P<0.05）;（4）动物和细胞实验结果都发现,与正常大鼠,T2DM大鼠以及细胞的对照组和HG/SP组相比,GSPE处理提高了Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白和mRNA水平（P<0.05）;在细胞实验中,免疫荧光显示GSPE促进了Nrf2的核转位（P<0.05）,核Nrf2蛋白显著提升（P<0.05）,且GSPE进一步提高ARE的活性（P<0.05）。在siNrf2细胞实验中发现,与对照组相比,siNrf2组、HG/SP组及siNrf2+HG/SP组的细胞活力下降（P<0.05）,细胞出现铁死亡的形态特征且细胞死亡增加（P<0.05）,GSH和SOD均降低,而MDA和ROS升高（P<0.05）,细胞内Fe2+沉积明显（P<0.05）,GPX4和XCT的蛋白和mRNA表达显著降低,PTGS2的mRNA上调（P<0.05）;然而GSPE和Fer-1的处理在一定程度上逆转了这些情况（P<0.05）。结论:（1）T2DM患者体内存在铁过载状态,升高的SF与T2DM的发生具有相关性,且SF与FBG之间也具有相关关系,提示SF可能参与T2DM的发生和发展。（2）T2DM大鼠胰岛β细胞和高糖高脂损伤的MIN6细胞中存在铁死亡;（3）GSPE增加铁死亡关键蛋白GPX4和XCT的表达,降低PTGS2和ACSL4的表达,是一种有效的铁死亡抑制剂,可改善T2DM;（4）GSPE在体内和体外通过Nrf2通路显著减少β细胞铁死亡,通过体外siRNA技术对Nrf2进行沉默,进一步验证了Nrf2信号通路在拮抗β细胞铁死亡中的作用,为T2DM的防治提供新的启示。

摘要译文

关键词：

2型糖尿病; 铁死亡; GSPE; 氧化应激; Nrf2

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

流行病与卫生统计学

导师：

刘金宝丁玉松

中图分类号：

R587.1[糖尿病⑨]

学科分类号：

100201[内科学]

D O I：

10.27433/d.cnki.gxyku.2022.001168