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莪术奥酮二醇调控血小板外泌体-血管新生稳定动脉粥样硬化斑块的机制研究认领

被引量： 2

作者：

宋博策

学位授予单位：

中国中医科学院

摘要：

研究背景动脉粥样硬化(AS)斑块破裂继发血栓形成是引发急性心血管事件的主要病理基础,直接影响本病的疗效及预后。AS斑块内血管新生与斑块失稳密切相关,抑制斑块内血管新生已成为稳定斑块的治疗策略之一。本课题组在继承陈可冀院士“活血化瘀”学术思想基础上,结合现代研究结果,提出AS病变过程中“因瘀而血气不通”,“因瘀而气机郁遏成毒”,因此破血逐瘀是解决瘀毒互结的关键。莪术奥酮二醇(Zedoarondiol)是从破血逐瘀中药莪术中提取的单体成分,前期研究结果证实Zedoarondiol在保护内皮细胞功能、抑制平滑肌细胞异常增殖、减轻斑块内炎症负荷方面作用确切。然而Zedoarondiol能否调控内皮细胞血管新生,稳定AS斑块,目前尚无报道。现有研究中发现,外泌体在AS细胞间信号传导途径中发挥重要作用,可通过递送microRNA调控斑块内血管新生。本文的研究目的,旨在前期研究成果的基础上,进一步验证Zedoarondiol干预外泌体与内皮细胞之间串扰机制,明确Zedoarondiol抑制AS斑块血管新生效应。因此,我们提出Zedoarondiol调节外泌体microRNA这一关键机制。本文从临床、动物、细胞三个方面展开研究,首先通过小样本临床对照研究,探索外泌体miR-let-7a与急性心肌梗死之间相关性;其次利用高脂饲养ApoE-/-鼠建立AS模型,观察Zedoarondiol抑制斑块内血管新生作用,以及对外泌体miR-let-7a及其下游蛋白的影响;最后通过血小板体外活化实验及管腔生成实验验证Zedoarondiol调控血小板外泌体(Pexo)介导的miR-let-7a抑制血管新生的分子机理。研究一外泌体microRNA与急性心肌梗死相关性临床研究目的:基于临床样本,探索外泌体miR-let-7a与急性心肌梗死间的相关性。方法:从中国中医科学院西苑医院和中国中医科学院望京医院招募急性心肌梗死患者(MI组)和健康志愿者(健康组)各15人,收集其人口学资料、病史信息,检查血常规、心肌酶检测、血生化以及凝血检测。超速离心法提取两组人员血浆外泌体并检测外泌体内血管新生相关基因miR-let-7a,miR-210和miR-126,探索影响AS斑稳定性的关键外泌体microRNA。结果:与健康组比较,MI组中血浆外泌体miR-let-7a水平升高(P<0.05),miR-210以及miR-126无明显变化(P>0.05),血浆中促血管生成因子VEGF和MMP-9表达水平上调(P<0.01),APTT缩短、血小板活化相关因子CD62P和5-TH水平提高(P<0.01);两组间cGMP无明显差异(P>0.05)。结论:MI组患者血浆外泌体miR-let-7a水平升高,促血管新生蛋白水平上调,血小板活化水平增加。外泌体介导的miR-let-7a可能是调节AS斑块稳定性的关键基因。研究二Zedoarondiol对ApoE-/-小鼠斑块内血管新生的影响目的:探讨Zedoarondiol对小鼠AS斑块内血管新生的影响,并通过外泌体miR-let-7a/THBS-1途径探讨其相关机制。方法:ApoE-/-小鼠随机分为4组持续高脂饮食饲养建立AS模型,model组:等体积生理盐水,ZEL 组:Zedoarondiol 5mg/kg/d,ZEH 组:Zedoarondiol 10mg/kg/d,atorvastatin组:阿托伐他汀钙10mg/kg/d,同时以C57BL/6J小鼠为control组:等体积生理盐水。小鼠给药与高脂饲养同时进行,持续14周。全长主动脉以及主动脉根部切片进行油红O染色,观察斑块生成情况。免疫组化染色检测斑块内新生血管密度。蛋白免疫印迹(WB)检测主动脉内血管新生有关蛋白THBS-1、CD36、VEGF以及CD34表达情况。生化法检测血脂水平。Elisa检测血浆TNF-α、MMP-9、LDL以及HDL含量。qPCR检测外泌体miR-let-7a水平。流式细胞技术检测血小板活化率。结果:14周后与control组比较,model组全长主动脉及主动脉根部有明显斑块生成,小鼠主动脉根部斑块内新生血管密度明显增加(P<0.01),主动脉组织中抗血管新生蛋白THBS-1及其受体CD36含量下降(P<0.01),促血管新生蛋白VEGF水平升高(P<0.01),血浆中TG、TC、LDL、TNF-α以及MMP-9浓度增加(P<0.01),HDL水平下调(P<0.01),血小板活化率及外泌体衍生的miR-let-7a水平上升(P<0.01)。与model组相比,Zedoarondiol干预后,ZEH组小鼠主动脉根部斑块面积比减小(P<0.05),斑块内新生血管密度下降(P<0.01),主动脉中 THBS-1、CD36 表达量增加(P<0.01,P<0.05),VEGF 减少(P<0.01,P<0.05),血浆中TC、LDL、TNF-α以及MMP-9浓度下降(P<0.05),而TG以及HDL水平无明显变化(P>0.05),小鼠血小板活化率及血浆外泌体miR-let-7a水平下降(P<0.01)。结论:Zedoarondiol抑制AS小鼠主动脉斑块生成,减少斑块内血管新生,上调主动脉组织中血管新生抑制蛋白THBS-1,下调血管新生促进蛋白VEGF,降低血浆TC、LDL、MMP-9和TNF-α浓度,同时抑制小鼠体内血小板活化并降低血浆外泌体miR-let-7a水平。表明Zedoarondiol抗血管新生作用与调控外泌体miR-let-7a和血小板活化相关。研究三Zedoarondiol调控Pexo衍生的miR-let-7a影响内皮细胞管腔生成的体外研究目的:观察Zedoarondiol抑制血小板体外活化、下调PexomiR-let-7a水平的效应。并通过Pexo/miR-let-7a/THBS-1信号途径,探讨Zedoarondiol抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管新生的机制。方法:(1)血小板体外活化实验:获取健康志愿者血小板,分为rest组、model组和Zedoarondiol组。rest组:等体积PBS孵育,不加激活剂;Zedoarondiol组:Zedoarondiol 15μg/mL 孵育 10min 后加入 ADP 激活;model 组:等体积 PBS 孵育10min后加入ADP激活。干预结束后用多聚甲醛固定血小板,采用FITC-CD61和PE-CD62P标记血小板,流式细胞仪检测血小板活化率。qPCR检测各组Pexo中 miR-let-7a 水平。(2)细胞转染:HUVEC 转染 miR-let-7a minics 建立 miR-let-7a过表达细胞模型,并以无效的NC转染作为阴性对照,qPCR及WB验证转染模型。(3)HUVEC管腔生成实验:转染成功后用富含miR-let-7a的Pexo干预,细胞分组:HU 组:正常 HUVEC,HU+Pexo 组:正常 HUVEC+Pexo 100μg/mL,HU+Pexo+minics组:转染 miR-let-7a minics的 HUVEC+Pexo 100μg/mL,HU+Pexo+NC组:转染NC的HUVEC+Pexo 100μg/mL,24h后收集各组细胞进行管腔生成实验观察其成管能力。实验结束后qPCR检测细胞中miR-let-7a以及THBS-1 mRNA 水平,WB 检测 THBS-1、CD36 水平。结果:(1)血小板活化实验中,与rest组比较,model组血小板活化率以及Pexo 衍生的 miR-let-7a 水平均升高(P<0.01);相较于 model 组,Zedoarondiol 干预后血小板活化率降低(P<0.01)且Pexo miR-let-7a减少(P<0.01)。(2)细胞转染实验中,与正常HUVEC相比,miR-let-7a minics转染后细胞中miR-let-7a表达量升高、THBS-1蛋白含量下降(P<0.01,P<0.05),而NC转染的细胞较之无显著差异(P>0.05),表明成功建立miR-let-7a过表达细胞模型。(3)管腔生成实验中,与HU组比较,HU+Pexo组和HU+Pexo+NC组中管腔长度增加(P<0.01),miR-let-7a 水平升高(P<0.01),THBS-1 mRNA 降低(P<0.01),THBS-1 和 CD36蛋白表达量下降(P<0.01,P<0.05),HU+Pexo组和HU+Pexo+NC组无明显差异(P>0.05),与HU+Pexo组相比,HU+Pexo+minics组中各项指标较进一步改变(P<0.05)。结论:Zedoarondiol可抑制血小板体外活化,下调PexomiR-let-7a水平。Pexo miR-let-7a能够抑制THBS-1 mRNA表达,促进HUVEC管腔生成。表明Zedoarondiol可通过抑制血小板活化,下调Pexo miR-let-7a水平,减轻其对THBS-1 mRNA的干扰,促进THBS-1蛋白表达,从而抑制血管新生。

摘要译文

关键词：

莪术奥酮二醇; 动脉粥样硬化; 血管新生; 血小板外泌体; miR-let-7a

学位年度：

2023

学位类型：

博士

学科专业：

中西医结合临床（专业学位）

导师：

赵福海史大卓

中图分类号：

R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27658/d.cnki.gzzyy.2023.000078