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双氢青蒿素调控MiR-133b保护心肌细胞的作用机制研究认领

作者：

王世亚

学位授予单位：

苏州大学

摘要：

脂肪异位过度沉积是糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy,DCM）发生的主要病因。糖尿病能导致多种并发症,其中在心血管系统常会引起发DCM,这也是糖尿病引起病患死亡的关键因素之一。时至今日,对于DCM的发生发展机理尚未研究透彻,有研究表明脂毒性、糖代谢紊乱、OS、心肌钙化、线粒体功能障碍以及心肌功能变化等都是导致DCM发生的因素。脂毒性心肌损伤常引起严重的心肌功能不全,影响心肌的正常收缩功能,严重危害患者的生命健康。调节脂质代谢平衡,改善心功能,成为预防治疗DCM的重要手段。脂毒性是由于人体外周血中FFA含量增加,超过机体正常利用范围,引起FFA在肝脏、肌肉等组织中以TG模式过量累积,损伤组织器官。长期处于高脂环境中的机体,其脂质以及中间产物积累过剩,会导致机体细胞功能障碍、代谢异常以及相关病理改变。心肌内过多的脂质累积,激发ERS,引起OS,使得心肌细胞大量凋亡,最终对心肌功能产生了很大的影响。脂代谢紊乱可激发OS和线粒体功能异常,从而使得机体心脏结构和机能发生异常,如导致心肌肥大、心肌梗死,乃至心力衰竭及死亡。由此可知,脂毒性心肌损伤在DCM的病程进展中起到至关重要的作用。众人熟知的青蒿素是中药青蒿的提取物,青蒿素及其衍生物对多种原因所致心律失常、心肌缺血及动脉粥样硬化及斑块稳定性等均有较好的治疗作用。活化NF-κB途径能够增加TF、MMP以及CF的表达,进而促使炎症以及纤维化发生,最终引发左室重构;研究发现,青篙素可以抑制NF-κB通路以减轻心肌重构。青蒿素类药物抗心律失常机制是通过对离子通道的阻断、对心肌细胞间连接蛋白表达的促进等实现的,青蒿素类药物抑制动脉粥样硬化的作用主要体现在抵抗炎症和抗氧化以及抑制血管内皮细胞运动分裂和抑制巨噬细胞表型转化等方面。青蒿素在对抗脂毒性引起的心脏、肾脏和肝脏等重要器官的并发症方面亦疗效显著。其能够抑制炎性反应从而保护胰岛β细胞,提高其存活率,改善胰岛素抵抗,诱导胰岛α细胞转化为β细胞,减轻肾脏和心脏纤维化进程,降低尿蛋白排出。microRNAs是一类在真核生物中被发现一类呈现类似发夹结构的短链非编码RNA,具有转录调控功能,这类短链非编码RNA具有分布广泛的特点,能通过调控多种多样的靶基因而发挥生物学作用。已有报道表明microRNAs不仅仅能够参与到心脏发育过程中,而且在心血管类疾病发生过程中亦扮演着十分重要的角色。伴随着日渐增高的心血管疾病发病率及病死率,miRNA对心血管疾病发生的病理生理调控机制也成为热点研究。miRNA-133b参与多个生理过程的调控,包括心肌细胞对抗缺氧和梗死。研究报道miRNA-133b能够抑制心肌成纤维细胞的活化增殖,在急性心肌梗死患者循环血浆中表达水平也显著增高。但关于miR-133b在心肌脂毒性损伤中的作用研究却未见报道。本研究以心肌细胞HHHM2为研究对象,通过PAL诱导心肌脂毒性损伤细胞模型,通过转染miR-133b inhibitor处理,采用MTT分析法和实时荧光定量PCR分析miR-133b在PAL诱导的心肌脂毒性损伤中的作用。通过双荧光素报告实验,揭示Sirt1是否为miR-133b的靶向基因,通过Westernblot分析miR-133b对HHHM2细胞中沉默信息转录调控因子1表达量的影响,构建Sirt1过表达质粒（pcDNA3.1-Sirt1）,并将过表达质粒与miR-133b mimic或inhibitor单独或同时转染心肌细胞,通过挽救实验验证miR-133b是否通过调控Sirt1发挥着PAL处理后心肌细胞损伤的作用。利用DHA挽救PAL处理后心肌细胞,MTT观察细胞活力变化,qRT-PCR检测miR-133b的表达,应用qRT-PCR检测DHA改善（减轻）PAL处理后心肌细胞凋亡因子的转录水平,采用荧光素酶报告基因系统进行检测DHA通过影响miR-133b调控Sirt1的转录。主要目的是研究microRNA-133b（miR-133b）在心肌细胞脂毒性环境中的作用,并探究其下游分子机制,以及双氢青蒿素通过调控MiR-133b保护心肌细胞的作用机制,为肥胖、高血脂及DCM的诊治提供新的策略。第一部分 miRNA-133b在PAL诱导的心肌脂毒性损伤中的作用目的:建立体外高脂刺激模型,探讨PAL对HHHM2心肌细胞的毒性机制及在PAL诱导的脂毒性心肌损伤中miRNA-133b的作用。方法:1、体外培养心肌细胞HHHM2,应用棕榈酸盐诱导建立体外高脂刺激模型（Lipid toxicity）,MTT(3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)分析法检测抑制miR-133b前后心肌细胞在PAL处理后对细胞活力的影响。。2、qRT-PCR 检测 Caspase3、Bax、Bcl-2 以及 miR-133b 在正常心肌细胞与 PAL处理后心肌细胞与中的表达差异。3、Western blot实验探究PAL处理后心肌细胞中的Caspase3、Bax和Bcl-2与正常心肌细胞中的表达差异性。4、实时荧光定量PCR分析转染miR-133b inhibitor前后miR-133b在高脂刺激模型细胞内的表达差异。结果:1、心肌细胞HHHM2能够成功进行体外培养,MTT结果显示,PAL处理24h后,心肌细胞活力较正常细胞显著下降（p<0.05）,PAL处理72h后,心肌细胞活力下降显著（p<0.01）。2、qRT-PCR检测显示,PAL处理12h后,Caspase 3的表达水平较正常对照组显著上升（p<0.05）;PAL 孵育48h后,Caspase3蛋白表达水平上升极显著（p<0.01）;Bcl-2含量未见显著差异（p>0.05）;Bax在PAL处理12h后表达量显著提升（p<0.05）,在48h提升更显著（p<0.01）。3、Western blot方法检测结果显示,Caspase3表达在PAL处理后12h略有升高（p<0.05）,24h开始急剧上升（p<0.001）,并且持续增加到72h（p<0.001）。Bax的表达与Caspase3类似,也随着PAL处理时间的增加而升高。Bcl-2含量在PAL孵育前期（12h）其表达量显著增加,并随着时间的延长而逐步降低。4、利用实时荧光定量PCR分析经PAL处理的心肌细胞中miR-133b的表达变化,结果显示,经PAL处理后,心肌细胞中miR-133b的表达明显上升。与对照组比较,PAL处理6h后,miR-133b的表达水平略有上升（p>0.05）,经PAL处理12h和24h后,miR-133b的表达水平显著上升,分别上升了 60%和80%（p<0.05,p<0.01）;在PAL处理48h时显著升高（p<0.01）,处理72h后,miR-133b表达开始下降,但仍显著高于对照组（p<0.01）。5、miR-133b inhibitor转染心肌细胞后,孵育PAL,随后用qRT-PCR检测,结果表明:转染miR-133b inhibitor的心肌细胞组中miR-133b的表达水平较Scramble组和Blank组显著下降（p<0.001）;表达miR-133b inhibitor心肌细胞在PAL孵育后,细胞中miR-133b的表达水平显著低于对照组（p<0.001）,其表达水平下降了约50%。6、MTT实验检测的结果发现,Blank组以及Scramble组细胞活力与对照组相比显著降低（p<0.01）,miR-133b inhibitor转染组中的心肌细胞活力较对照组心肌细胞也显著下降（p<0.05）;但同Blank组以及Scramble组比较,miR-133b inhibitor转染组的细胞活力显著上升（p<0.05）。结论:心肌细胞HHHM2经PAL处理能够抑制的增殖,导致细胞凋亡相关基因及蛋白表达量的增加,从而促进细胞凋亡。PAL刺激可以诱导心肌细胞中miR-133b表达增加,抑制miR-133b表达可以减轻PAL诱导的心肌细胞脂毒性损伤。第二部分 miR-133b调控心肌脂毒性损伤的机制研究目的:探讨miR-133b调控心肌脂毒性损伤的机制方法:1、课题组使用在线版本软件（网址:http://www.targetscan.org/）搜索及分析miR-133b可能存在的候选靶基因集合。2、开展双荧光素酶报告基因系统（Luciferase）来验证miR-133b序列调控靶基因Sirt1（Sirtuin 1）的转录活性。3、蛋白免疫印迹法检测miR-133b分子影响心肌细胞中Sirt1蛋白的表达水平。4、构建Sirt1过表达质粒（pcDNA3.1-Sirt1）,并将过表达质粒与miR-133b mimic或inhibitor单独或同时转染心肌细胞,通过挽救实验观察miR-133b是否通过调控Sirt1发挥PAL处理后保护心肌细胞的生物学作用。结果:1、在线版本软件（网址:http://www.targetscan.org）筛查出Sirt1是miR-133b的候选靶基因之一。2、双荧光素酶活性数据显示,在转染过miR-133b mimic并囊括了 Sirt1基因的3'UTR（Wild type-野生型）荧光素酶质粒组中读取的相对荧光素酶活性数值显著低于对照组（p<0.01）,表明miR-133b能够作用在Sirt1 3'-UTR的预测靶位点上。3、蛋白免疫印迹实验结果显示,跟对照组（Scramble组）相比较,Sirt1蛋白含量在miR-133b mimic转染组中显著降低（p<0.01）,提示过表达miR-133b抑制了 Sirt1蛋白的表达。4、实时荧光PCR检测转染Sirt1质粒后各组细胞中的其mRNA表达水平,结果提示,对比空载体（Backbonevector）转染对照组（pcDNA3.1组）,转染pcDNA3.1-Sirt1（过表达组）的心肌细胞中Sirt1表达含量显著升高（p<0.01）;然而,pcDNA3.1-Sirt1+miR-133b mimic转染组（抑制组）的Sirt1表达显著低于pcDNA3.1-Sirt1过表达组（p<0.01）,但与空载体转染组（Backbonevector）无显著差异（p>0.05）。同样,转染pcDNA3.1-Sirt1后Sirt1表达显著升高,而同时加入miR-133b后其表达量下降。5、MTT法检测PAL诱导后细胞活力的变化,结果显示细胞活力在pcDNA3.1-Sirt1转染组显著高于空载体对照组（pcDNA3.1组）(p<0.01),而在miR-133b mimic+pcDNA3.1-Sirt1转染组显著低于pcDNA3.1-Sirt1转染组（p<0.01）,与空载体对照组（Backbone vector组）对比未见显著差异（p>0.05）。结论:miR-133b抑制了 Sirt1对心肌细胞的保护,Sirt1是miR-133b的靶基因,PAL处理后的心肌细胞由于miR-133b对Sirt1的调控作用发生损伤。第三部分 DHA调控MiR-133b保护心肌细胞的作用机制研究目的:探索DHA调控miR-133b保全心肌细胞的作用机制。方法:1、应用MTT法观察DHA对PAL处理后心肌细胞活力的影响,qRT-PCR检测miR-133b的表达变化。2、应用qRT-PCR检测DHA对PAL处理后心肌细胞凋亡因子转录水平的作用。3、采用荧光素酶报告基因系统检测DHA是否通过影响miR-133b调控Sirt1的转录。结果:1、心肌细胞接种后,待其汇合率达到80%,加入浓度为0.5mM的PAL作为PAL组。DHA组在PAL处理的同时,加入终浓度为10μM的DHA,随后在处理12h、24h、48h及72h进行检测,其细胞存活率在12h并未检测到差异,而DHA组在24h略有升高,但未能检测到显著差异。48h时DHA组细胞存活率显著高于PAL组（p<0.05）,这种差异显著性在72h进一步增加（p<0.01）。2、与模型组比较,DHA显著提升了心肌细胞的存活率,

摘要译文

关键词：

棕榈酸; miR-133b; 心肌细胞脂毒性; miR-133b; 双氢青蒿素; 调控; 保护作用

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

内科学（心血管内科）（专业学位）

导师：

李勋

中图分类号：

R285[中药药理学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27351/d.cnki.gszhu.2021.004184