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CX-5461通过p53-DUSP5途径抑制T细胞介导的同种异体免疫认领

作者：

潘国聘

学位授予单位：

山东大学

摘要：

研究背景器官移植是当代医学一项重要成就。然而,由于细胞表面的人类白细胞抗原HLA具有高度多态性,除同卵双生个体外,供-受体之间HLA不能完全匹配,在进行同种异体器官移植后,机体会启动免疫应答,导致急性排斥(acute rejection)反应。急性排斥反应是由获得性免疫和先天性免疫途径共同参与和介导的同种异体免疫反应。其中CD4+辅助T细胞在介导急性排斥反应导致的同种异体移植物的炎症和损伤中起着关键作用。CD4+T细胞活化后,进一步分化为Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg),并通过分泌多种细胞因子刺激其他效应细胞。其中Th1和Th17T细胞通过分泌细胞因子白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-17(IL-17)等促进免疫排斥的发生;而Treg细胞则可通过分泌白介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)等因子对免疫排斥反应产生负调控作用。因此,目前针对器官移植后急性排斥反应的干预策略主要关注如何有效抑制Th1、Th17T细胞的免疫功能及如何增加CD4+T细胞向Treg方向分化两个方面。当前临床上移植术后常用的免疫抑制剂主要包括糖皮质激素、钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)抑制剂、mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶点)抑制剂、霉酚酸盐和基于多克隆/单克隆抗体的生物疗法。这些药物的应用,使早期的急性排斥反应得到有效控制,极大提高了移植物的存活率。然而,使用免疫抑制药物所产生的不良影响,例如,肾毒性、慢性肾脏损伤和移植后恶性肿瘤等,某些患者中难治性排斥反应的发生,以及因一种治疗方案疗效不好而转换到另一种治疗方案时患者出现的药物不耐受,这些因素都可能限制现有药物的整体治疗效果。同时,这些药物通常不能诱导免疫耐受,使得移植后患者需要长期甚至终生用药。因此,寻找新的具有良好功效和安全性的替代性免疫抑制剂是非常必要的。CX-5461是一种选择性RNA聚合酶Ⅰ抑制剂,其最初的研发目的是作为抗肿瘤药,目前正在进行血液和实体恶性肿瘤的临床试验。这些试验的初步数据表明,CX-5461静脉注射后人体耐受性良好,并显示出良好的短期安全性。除了抑制肿瘤细胞增殖,我们之前的研究表明CX-5461对各种增殖性血管疾病有治疗作用,包括球囊损伤诱导的新生内膜增生、移植血管病变和实验性肺动脉高压。在这些研究中,我们观察到CX-5461在血管和巨噬细胞中表现出抗增殖和抗炎作用。此外,我们发现CX-5461在小鼠心脏成纤维细胞中有显著的抗纤维化作用。基于这些结果,本研究中我们探索CX-5461是否具有免疫抑制活性,是否可以用于预防同种异体移植后的急性排斥反应。研究目的1.在异位心脏移植模型(F344-Lewis大鼠)中观察CX-5461是否能防止急性同种异体移植排斥反应,延长移植物存活时间。2.在细胞水平研究CX-5461是否能抑制T细胞活化,是否对Treg细胞分化有影响。3.探索CX-5461潜在的免疫抑制作用的生物学机制。研究方法一、CX-5461抑制同种异体心脏移植后急性排斥反应的药理作用研究1.动物分组及给药将接受同种异体心脏移植大鼠随机分为3组:对照组、CX-5461干预组和FK506干预组(每组8只)。CX-5461以12.5mg/kg/3天的剂量灌胃给药。FK506给药剂量为1.Omg/kg/天,肌肉注射。每天对动物进行触诊检查,记录移植物生存时间。我们还设立一个单独的长期观察队列,前两周动物按上述方法分组和给药;之后采用CX-5461按12.5mg/kg/5天,FK506按1.0mg/kg/3天的剂量进行维持治疗。总观察时长为85天。2.异位心脏移植模型采用异体(F344 to Lewis)异位心脏移植模型。供体大鼠戊巴比妥钠(60 mg/kg腹腔注射)麻醉后剖开腹腔。经下腔静脉输注肝素,3分钟后,下腔静脉放血处死动物。胸腔置冰屑使供体心脏停跳。依次结扎下腔静脉、肺静脉、左右上腔静脉、主动脉弓;横断升主动脉(连同无名动脉)和肺动脉。取出心脏,经无名动脉用冷肝素生理盐水冲洗,4℃保存在肝素生理盐水中。受体大鼠术前禁食12小时,戊巴比妥钠(60 mg/kg)加卡洛芬(5 mg/kg,皮下)麻醉。沿颈部行纵行旁正中切口。分离右侧颈外静脉和颈动脉,夹闭血管近端;远端结扎切断。采用套袖原理用静脉留置针套管翻套动脉和静脉。分别将移植物上的肺动脉与受体的颈外静脉吻合,将移植物上的无名动脉与受体的颈动脉吻合。取出血管夹恢复血流。生理盐水冲洗并缝合皮肤切口。给予庆大霉素(20mg/kg/天,腹腔注射)连续3天预防感染。如果供体心脏跳动正常,则在术后48小时(计为实验第1天)开始免疫抑制治疗;否则,该样本将视为手术失败排除在外。3.取材及标本检测第7天,动物腹腔注射戊巴比妥钠(～300 mg/kg)安乐死,采集外周血、心脏移植物、手术同侧颈浅淋巴结、脾脏。全自动血细胞分析仪对外周血细胞进行分类计数;Elisa试剂盒检测外周血血浆中IL-2、IFN-γ的含量。对心脏组织切片进行苏木素-伊红(HE)和Masson染色,统计心外膜纤维-炎症组织层的平均厚度。免疫组化检测心外膜边缘区T细胞(CD3)、巨噬细胞(CD68)、B细胞(CD20)和浆细胞(CD138)的数量。用qPCR检测心脏和脾脏组织中 IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-1 7、IL-10、TGF-β、B 细胞激活因子(BAFF)及Pax5的mRNA表达;流式细胞术检测受体大鼠脾脏和外周淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的数量。二、CX-5461抑制T细胞增殖、活化的作用及机制研究1.人原代T细胞分离、培养取健康志愿者的外周血,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,加入X-VIVOTM 15无血清造血细胞培养基重悬,接种到24孔板中,加入抗CD3/CD28抗体(磁珠)刺激T细胞增殖,作用48小时,收集细胞于25cm2培养瓶中培养。2.CX-5461对T细胞增殖和活化的影响CX-5461(1μM)作用于用PMA(80 nM)+离子霉素(1μM)(P/I)刺激的Jurkat细胞。使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒测定细胞增殖。qPCR检测IL-2、IFN-γ、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)及IL-17的mRNA表达。ELISA试剂盒检测细胞培养液中IL-2和IFN-γ的含量。Western blot检测IL-2和IFN-γ的蛋白表达。3.CX-5461对T细胞活化相关信号通路的影响由于蛋白激酶C(PKC)依赖的核因子(NF)-κB的激活和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)级联反应的激活是参与T细胞激活的两个关键信号通路,我们随后利用P/I刺激的Jurkat细胞研究了 CX-5461是否影响这些通路。用P/I诱导细胞活化,CX-5461(1μM)处理24小时。Western blot检测细胞中PKC的膜转位;检测NF-κB p65、细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)、JNK和p38的磷酸化水平;检测IκB-α、c-Fos、c-Jun和活化T细胞核因子(NFATc1)的蛋白表达水平。为了证实CX-5461在原代T细胞中具有类似的作用,我们用CX-5461处理预激活的人原代T细胞。Western blot检测Erk1/2磷酸化和c-Fos的蛋白表达水平。qPCR检测c-Fos的mRNA水平。4.CX-5461在人类T细胞中的全基因组mRNA测序分析为了进一步了解CX-5461抑制T细胞活化的分子机制,我们在预先活化的人原代T细胞中用CX-5461处理,然后进行全基因组mRNA测序。基于测序信息,我们在Jurkat细胞中进行了一系列的PCR验证。5.p53-DUSP5途径在CX-5461抑制T细胞活化作用中的角色基于测序信息和以往研究结果,我们进一步检测p53-双特异性磷酸酶5(DUSP5)通路是否介导了 CX-5461的免疫抑制作用。qPCR和Western blot检测DUSP5的mRNA和蛋白水平;Western blot检测p53蛋白的磷酸化水平。为了确定CX-5461对DUSP5表达的刺激作用是否依赖于p53,我们用选择性p53抑制剂pifithrin预处理Jurkat细胞,用Western blot/qPCR重新检测DUSP5和c-Fos的表达变化,Erk1/2的磷酸化水平,以及各种细胞因子的表达变化。为了进一步确定DUSP5在介导CX-5461药理作用中的角色,我们在Jurkat细胞中分别进行了 DUSP5基因沉默和过表达实验,用Western blot分别检测细胞中DUSP5和c-Fos蛋白的表达水平,Erk1/2的磷酸化水平;qPCR检测IL-2、IFN-γ、TNF-β及IL-17细胞因子的mRNA表达。6.CX-5461对Treg分化的影响由于Treg在调节机体免疫反应中起着关键作用,因此我们研究了 CX-5461 对急性同种异体排斥反应的抑制作用是否与 Treg 分化的改变有关。在人原代T细胞及Jurkat细胞中用qPCR检测CX-5461是否影响Treg标志物IL-10和TGF-β的表达;用pifithrin预处理明确p53在其中的角色。结果一、CX-5461抑制同种异体心脏移植后急性排斥反应的药理作用研究1.CX-5461延长大鼠同种异体心脏移植物存活时间CX-5461和FK506均能显著延长移植物生存期。HE染色和免疫组化结果显示,CX-5461治疗显著抑制了心外膜纤维炎性组织的形成,并减少了心肌中免疫细胞(T细胞、巨噬细胞、B细胞和浆细胞)的浸润。FK506的保护作用与CX-5461相似。2.CX-5461不引起系统性造血抑制外周血细胞分类计数表明,心脏移植术后白细胞总数显著增加,其中主要是由于淋巴细胞数量的扩增。CX-5461处理部分逆转了这种变化。FK506也有类似的效果。此外,与正常基线值相比,CX-5461没有引起明显的贫血或白细胞减少,说明CX-5461治疗与系统性造血抑制无关。3.CX-5461抑制受体大鼠体内T细胞的活化外周血血浆Elisa检测结果显示,接受CX-5461治疗的大鼠循环中IL-2和IFN-γ水平均显著下降;PCR结果显示CX-5461干预显著抑制了心脏移植物和脾脏中IFN-γ和IL-2的表达,但IL-6、IL-17和BAFF的改变不明显;B细胞特异性标记物Pax5在移植物中表达下降,但在脾脏中没有。4.CX-5461促进体内Treg分化在移植受体大鼠中,CX-5461 显著增加了脾脏和淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Treg的数量;相比之下,FK506对Treg没有任何影响。PCR结果证实,CX-5461干预的大鼠脾脏中Treg标志物IL-10和TGF-β的表达水平上调,而在移植心脏组织中没有明显变化。二、CX-5461抑制T细胞增殖、活化的作用及机制研究1.CX-5461抑制T细胞增殖和细胞因子的表达CCK-8结果显示,1μM CX-5461能显著抑制P/I刺激的Jurkat细胞的增殖;PCR结果显示CX-5461显著降低了 P/I刺激的Jurkat细胞中IL-2、IFN-γ、TNF-β 和 IL-17 的 mRNA 水平;Elisa 和 Western blot 结果显示,CX-5461不仅显著抑制P/I刺激的Jurkat细胞上清中IL-2和IFN-γ的水平,还抑制了人原代T细胞中IL-2和IFN-γ的蛋白表达。2.CX-5461对T细胞中PKC和NF-κB通路的激活无显著作用Western blot结果显示,在Jurkat细胞中CX-5461对P/I刺激的PKC膜转位和NF-κB的抑制蛋白IκB-α的降解无显著影响;此外,NF-κB p65磷酸化水平无论在静息细胞还是P/I刺激的Jurkat细胞中均不受CX-5461的影响。3.CX-5461抑制T细胞中MAPK信号转导Western blot结果显示,CX-5461显著减弱P/I诱导的Jurkat细胞中Erk1/2的磷酸化水平,而并未改变c-Jun氨基末端激酶(JNK)或p38的磷酸化水平;

摘要译文

关键词：

同种异体免疫; CX-5461; 急性排斥反应; p53; DUSP5; Erk1/2; T细胞受体信号转导

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

病理学与病理生理学

导师：

蒋凡王建丽

中图分类号：

R392.4[移植免疫学]

学科分类号：

100102[医学免疫学];100601[中西医结合基础医学]

D O I：

10.27272/d.cnki.gshdu.2022.000324