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裙带菜ACE抑制肽的分离纯化及其抑制机理研究认领

被引量： 19

作者：

冯学珍

学位授予单位：

广西大学

摘要：

高血压是导致心血管疾病的主要危险因素之一,血管紧张素转化酶（Angiotensin-I-converting enzyme,ACE）抑制剂是治疗高血压的主要药物。化学合成的ACE抑制剂,如赖诺普利、卡托普利等由于其副作用使其应用受限,从海洋食源生物中筛选ACE抑制肽成为众学者研究的热点。ACE抑制肽在酶解活性肽组分中存在含量相对较少、分离纯化步骤繁琐等问题,且有关抑制肽作用机理的研究相对较少。本文以裙带菜为研究对象,基于“蛋白改性-亲和介质制备-生物亲和纯化”的思路,运用超声预处理改性裙带菜蛋白,采用磁性金属有机骨架（Magnetic metal-organic framework,MOF）材料固定化ACE构建亲和介质,亲和分离获得新颖ACE抑制肽,研究抑制肽与ACE的相互作用,以解决亲和材料制备复杂、使用前仍需活化等问题。主要内容如下:（1）采用超滤、凝胶过滤柱层析和反相高效液相色谱（reversed high performance liquid chromatography,RP-HPLC）等对裙带菜蛋白酶解产物进行分离纯化,获得高抑制ACE活性组分,经质谱仪鉴定其氨基酸序列为:Tyr-Lys-Tyr-Tyr（YKYY）,IC50=71.88±1.43μM,经检索为已报道的抑制肽。实验纯化步骤相对较少,用于酶解的菠萝蛋白酶更安全、经济。（2）运用超声预处理对蛋白进行改性,改性蛋白酶解后产物具有更高水解度（Degree of hydrolysis,DH）和ACE抑制率:在超声功率200 W、超声时间15 min、超声工作间歇比1:2（s/s）的条件下,裙带菜蛋白(4.0mg·m L-1)酶解产物的ACE抑制率由41.2±2.0%提高至88.1±2.1%,DH由9.2±0.2%提高至15.6±0.3%,肽含量由13.6±0.2%提高至19.5±0.2%。运用紫外、红外、荧光光谱等分析其原因,结果表明超声预处理可诱导裙带菜蛋白结构由α-螺旋转向β-折叠,蛋白结构变得松弛,酶解产物中疏水性氨基酸含量增加;同时,显著提高了蛋白的溶解度、乳化活性、表面疏水性等性质。（3）采用磁性MOF材料（Fe3O4@ZIF-90）吸附-交联猪肺ACE,最佳固定化条件为:蛋白浓度为10.0 mg·m L-1,固定化pH值为8.0,温度为45℃,时间为2.0 h,Fe3O4@ZIF-90-ACE活力可达0.028±0.006 U·g-1。酶学性质研究结果表明固定化酶的最适pH为8.3,最适温度为45℃,与游离酶相比,固定化ACE增强了对温度的抵抗力,提高了酶的最适温度。稳定性研究结果表明固定化ACE具有较好的热、pH和储存稳定性,重复使用6次后的相对酶活保留率为54.05%,具有良好的操作稳定性。采用密度泛函理论和光电子能谱等方法从结合能、金属离子亲和层析、成键等方面探讨了Fe3O4@ZIF-90分离、固定化ACE机理,结果表明Zn2+可与ACE中的咪唑基（His）、硫醇基（Trp）和吲哚基（Cys）等配位结合亲和分离猪肺ACE,ACE通过物理吸附和共价结合固定在Fe3O4@ZIF-90上。（4）采用Fe3O4@ZIF-90-ACE磁性亲和分离结合RP-HPLC从裙带菜蛋白酶解液中分离纯化获得具有较高抑制ACE活性组分,经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪鉴定为未报道的ACE抑制肽:Lys-Asn-Phe-Leu（KNFL）,IC50=225.87±2.7μM。与传统分离纯化方法相比,亲和纯化时间短,过程简化,亲和介质Fe3O4@ZIF-90-ACE的制备无需活化,且固定化粗提ACE具备成本低、稳定性高、可操作性强的优点。（5）运用初始速率法、等温滴定量热法、紫外、荧光、圆二色谱和分子对接等方法,解析抑制肽KNFL与ACE的作用机理。抑制肽KNFL对ACE的抑制类型为混合型抑制模式;KNFL与ACE多位点结合,且结合为自发的放热反应;二者相互作用的热力学模式为熵、焓双驱动模式,KNFL可与ACE的活性中心和非活性中心发生氢键相互作用,使ACE分子直径增加;KNFL对ACE产生荧光猝灭效果,影响ACE的Trp-、Tyr-残基周围的微环境;使ACE的α-螺旋和无规则卷曲结构向β-折叠结构转变,引起肽链重排,导致ACE空间构象发生变化,ACE活性下降。采用分子动力学模拟对对接复合物进行稳定性考察,通过根均方偏差、均方根涨落和回旋半径的分析结果表明对接复合物在模拟条件下是稳定的,最终建立KNFL与ACE相互作用模型,KNFL与ACE通过多步的诱导契合和构象选择形成相对稳定的复合物。

摘要译文

关键词：

ACE抑制肽; 裙带菜; 磁性MOF; 固定化

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

生物化工

导师：

廖丹葵

中图分类号：

TQ464.7[氨基酸、肽、蛋白质]

学科分类号：

081702[化学工艺];083611[医药生物工程];100705[微生物与生物技术药物学]

D O I：

10.27034/d.cnki.ggxiu.2021.000049