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丝裂原活化蛋白激酶信号通路在皮肤成纤维细胞的内毒素刺激模型中介导细胞表型改变的机制研究认领

被引量： 1

作者：

王伟东

学位授予单位：

中国人民解放军医学院

摘要：

增生性瘢痕(Hypertrophic Scar,HTS)是烧伤领域常见的病理性瘢痕,据报道称烧伤创面愈合后30%～91%的患者在创面愈合后继发增生性瘢痕。成纤维细胞作为增生性瘢痕的主要效应细胞,在增生性瘢痕的形成中起到重要作用,因此针对成纤维细胞的研究逐渐在瘢痕修复领域成为热点。目前研究普遍认为,创面的局部感染、炎症是导致成纤维细胞表型改变的重要因素。为此,国内研究者通过特定剂量的内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)对成纤维细胞进行培养,通过实验数据分析和基因芯片技术,得到与患者增生性瘢痕内成纤维细胞表型类似的细胞模型。本研究通过LPS刺激成纤维细胞的体外实验模型进行信号通路方面的研究。目的:通过应用LPS刺激成纤维细胞的体外实验细胞模型,观察不同刺激浓度和不同刺激时间对丝裂原活化蛋白激酶信号通路的激活情况,确定LPS对成纤维细胞MAPK信号通路的三个主要亚通路Erk、JNK、p38的激活或抑制,以及亚通路对刺激剂量和刺激浓度的反应,确定本研究适宜的细胞刺激模型;其次通过该模型及相应通路的抑制剂对亚通路进行抑制,观察皮肤成纤维细胞增殖的改变、分泌TGF-β 1和IFN-γ的改变、Ⅰ型Ⅲ型胶原蛋白的表达合成及分泌的改变。方法:(1)采用 Western Blotting 的实验方法检测 Erk、p-Erk、JNK、p-JNK、p38、p-p38在各组中的表达情况,分时间差异和浓度差异进行两次实验。第一组:内毒素浓度0.1ug/mL刺激Oh、24h、48h、72h;第二组:刺激48h但不同的LPS浓度 0ug/mL、0.005ug/mL、0.01ug/mL、0.05ug/mL、0.1ug/mL、0.5ug/mL 以及 1ug/mL。(2)采用 MAPK/JNK 抑制剂 SP600125 和 MAPK/Erk 抑制剂 PD98059(浓度10uM,抑制时间6小时)对第一部分激活的MAPK信号通路的亚通路进行抑制,随后制作体外模型,检测正常皮肤成纤维细胞各项指标的改变:(2-1)人正常皮肤成纤维细胞增殖的改变:应用倒置显微镜观察成纤维细胞的形态学,MTT法检测人正常皮肤成纤维细胞的增殖曲线,台盼蓝染色检测成纤维细胞的增殖数量,流式细胞仪检测成纤维细胞的增殖周期。(2-2)人正常皮肤成纤维细胞分泌TGF-β 1和IFN-y水平的改变:应用免疫组化检测细胞表型的改变,应用透射电镜观察细胞的超微结构,ELISA法检测细胞分泌TGF-β 1和IFN-γ的水平。(2-3)人正常皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达、合成及分泌的改变:使用3H-脯氨酸掺入率法检测细胞胶原DNA的合成,使用RT-QPCR法检测细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA的表达,运用免疫荧光染色检测细胞内Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达,运用ELISA法检测细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原和羟脯氨酸的水平。结果:(1)相同浓度LPS不同刺激时间结果提示:同对照组相比,实验组的p-JNK和p-Erk增加程度随着刺激时间逐渐增加。不同浓度LPS刺激结果提示:随着LPS浓度提高,MAPK/JNK和MAPK/Erk激活逐渐明显并在LPS浓度为0.1ug/mL时达到最高激活。(2-1)人正常皮肤成纤维细胞增殖的改变:同对照组相比,单独抑制组细胞增殖曲线、增殖数量、细胞周期均较低,双抑制组最低。(2-2)人正常皮肤成纤维细胞分泌TGF-β 1和IFN-y水平的改变:同对照组相比,单独抑制组α-SMA和α1(Ⅰ)表达低,细胞损伤更为严重、TGF-β 1含量低,IFN-γ含量高,双重抑制组趋势更明显。(2-3)人正常皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达、合成及分泌的改变:同对照组相比,单独抑制组胶原DNA合成减少、Ⅰ型Ⅲ型胶原mRNA减少、上清液Ⅰ型Ⅲ型胶原减少,双重抑制组趋势更明显。结论:(1)内毒素在增生性瘢痕体外模型中,内毒素刺激了 MAPK/Erk和MAPK/JNK信号通路的激活,这可能是皮肤成纤维细胞的表型改变的重要机制之一。(2)基于内毒素刺激成纤维细胞的体外模型,干扰激活通路会对皮肤成纤维细胞的表型改变及胶原合成有抑制作用,这也为增生性瘢痕的治疗提供了新的思路和治疗策略。

摘要译文

关键词：

内毒素; 成纤维细胞; 丝裂原活化蛋白激酶; 信号通路; 抑制剂

学位年度：

2018

学位类型：

博士

学科专业：

外科学（烧伤）

导师：

杨红明

中图分类号：

R622[整形手术学⑨]

学科分类号：

100202[普通外科学];100207[整形外科学]