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摘要： γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是非蛋白质类的氨基酸,对哺乳动物而言,为一种存在于中枢神经系统(central nervous system)与周边组织中的抑制性神经传导物质,扮演抑制大脑的神经传导与镇定作用的角色。GABA被认为对人体健康有许多好处,包含降血压、调解血糖、帮助睡眠与舒缓神经以及调整免疫等功能,所以被视为机能性食品添加物。γ-胺基丁酸生产工艺包含化学合成与微生物发酵转换,其中以乳酸菌的转换而成的γ-胺基丁酸,兼具安全与高产的特性。生合集团是一家具专业发酵制程与开发乳酸菌能力的企业,生产高纯度的γ-胺基丁酸,具备耐酸碱、耐高温、耐高压与易溶水的特点,其配伍性高,可添加在各种食品、饮品或保健品上,增加产品的价值,便于推广。
关键词: γ-胺基丁酸 ；食品应用 ；保健品
被引量
3
摘要： 神经发育不良给婴幼儿成长带来巨大的痛苦,亟需开发能够改善婴幼儿运动功能和神经发育的活性物。6′-唾液酸乳糖(6′-Sialyllactose,6′-SL)具有改善肠道健康等功效。该研究利用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)探究了6′-SL对神经发育和运动能力的改善功效。主要结果如下:6′-SL在0.02~1.00 mg/mL范围内延长线虫的瘫痪寿命。在最佳质量浓度6′-SL作用下线虫平均、中位和最大寿命分别为8.70、8.67和12.67 h。根据6′-SL在实际中的应用,选择0.56 mg/mL 6′-SL继续探究。0.56 mg/mL 6′-SL改善了CL4176线虫的头摆和吞咽频率,分别提高了7.39%和4.25%,并使运动速率提高了16.27%。6′-SL能够保护线虫胆碱能神经元形态。此外,6′-SL使线虫乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)活性下降了22.60%,同时提高了多巴胺(Dopamine,DA)、5-羟色胺(Serotonin,5-HT)、γ-氨基丁酸(4-aminobutyric Acid,GABA)和谷氨酸(Glutamate,Glu)4种神经递质的水平,分别提升了148.71%、72.17%、34.72%、68.47%。综上所述,6′-SL可通过改善线虫头摆、吞咽和运动速度改善运动能力并通过抑制AChE活性、提高神经递质含量促进神经发育,为6′-SL在婴幼儿配方食品和保健品领域的应用提供理论支持。
关键词: 母乳低聚糖 ；秀丽隐杆线虫 ；神经发育 ；运动协调性
摘要： 现代竞技体育快速发展,运动疲劳已成为不可忽视的问题。随着运动医学等学科的发展,关于缓解运动性疲劳、提高运动成绩的研究越来越多。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)属于新型资源食品,在保健食品中有广泛的应用。本文主要综述了近年来γ-氨基丁酸与运动疲劳相关研究的新进展,着重介绍了运动疲劳的产生及其机制、GABA受体及其抗运动疲劳的生理功能、GABA在中枢神经系统中的分布、GABA对中枢神经系统的作用、运动疲劳的判断和恢复方法,目的是研究训练中导致运动疲劳发生的原因。以期为缓解运动疲劳和运动损伤的保健食品的研发提供必要的依据,达到提高运动员竞技能力及比赛成绩的目的。
关键词: γ-氨基丁酸 ；运动疲劳 ；恢复方法
被引量
9
摘要： γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是四碳、非蛋白质氨基酸,广泛存在于植物、动物和微生物中,具有多种生理功能。其对人体的功能性和保健作用受到广泛关注,近年来GABA在食品领域中得到较多应用。目前,人们主要通过植物富集法和微生发酵法富集GABA,使得动植物中GABA得到更好地应用。本文综述了植物、微生物中GABA形成机理及富集方法的最新研究进展。
关键词: γ-氨基丁酸 ；植物富集法 ；微生物发酵法 ；形成机理
被引量
84
摘要： 目的研究4株不同乳酸菌对豆豉发酵产生氨基态氮含量、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)以及挥发性成分的影响。方法将高密度培养后的4株乳酸菌:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,LP)、发酵乳杆菌(Lactobacillus plantarum,LF)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus,LA)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus casei,LH)分别接入豆豉成曲进行发酵,与未添加乳酸菌的对照组作比较,测定发酵完成后氨基态氮含量、γ-氨基丁酸含量,并用气相色谱质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)检测各豆豉挥发性成分。结果添加乳酸菌发酵的豆豉氨基态氮含量都高于对照组豆豉,以LF、LP、LA效果明显,其中LF最为明显,达到2.355 g/100 g;添加LH、LP发酵豆豉产GABA含量高于对照组豆豉,其中LH最高,达38.2 mg/g;LF豆豉共检测出风味物质46种,LP豆豉共检测出风味物质50种,LH共检测出风味物质58种,LA共检测出风味物质49种,对照组未添加乳酸菌豆豉共检测出风味物质60种。结论本研究的结果为开发保健型发酵豆制品,4株不同乳酸菌发酵豆豉的应用提供信息。
关键词: 豆豉 ；氨基态氮 ；γ-氨基丁酸 ；风味物质
被引量
15
【会议论文】 • 林金生
+1位作者
会议时间： 2013-05-22
摘要： γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是非蛋白质类的氨基酸,对哺乳动物而言,为一种存在于中枢神经系统(central nervous system)与周边组织中的抑制性神经传导物质,扮演抑制大脑的神经传导与镇定作用的角色.GABA被认为对人体健康有许多好处,包含降血压、调解血糖、帮助睡眠与舒缓神经以及调整免疫等功能,所以被视为机能性食品添加物.γ-胺基丁酸生产工艺包含化学合成与微生物发酵转换,其中以乳酸菌的转换而成的γ-胺基丁酸,兼具安全与高产的特性.本研究由天然发酵蔬菜与乳制品寻找可生产γ-胺基丁酸的潜力乳酸菌.结果发现,C35乳酸菌产生GABA浓度高达5590.48 mg/mL,且分别在pH2.0、0.3％胆盐与高温高压恶劣环境下非常稳定,不易受到破坏.经过喷雾干燥,其易溶水的特性,配伍性高,可添加在各种食品、饮品或保健品上,增加产品的价值,便于推广.
关键词: γ-胺基丁酸(GABA) ；乳酸菌(Lactic acid bacteria)
摘要： 发芽和发酵在植物和微生物的生长和繁殖中有重要作用。籽粒发芽或发酵能改变淀粉的理化特性。红曲在我国历史悠久,是由红曲霉菌丝寄生在大米上而来,具有降脂功效。发酵过程中微生物消耗能源物质,并通过生理活动改变稻米中的营养物质含量。水稻发芽过程中亦会产生大量生物活性成份。发芽糙米(Germinated brown rice,GBR)被认为是一种天然功能性食品,具有较高营养价值。利用GBR进行红曲发酵可能会进一步提高红曲的营养价值,但发芽后糙米的离体消化速率较未发芽的有所增加,这可能会增大餐后血糖快速上升的风险。抗性淀粉(Resistant starch,RS)作为淀粉的一种,在小肠内不被消化而在大肠中被发酵,对人体健康具有重要保健功能。高RS大米已被研究证实具有平稳餐后血糖,改善低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)的功效,但同时高RS大米米饭适口性较差,在一定程度上影响着其市场接受度和进一步推广应用。为探索萌发及红曲菌发酵条件下稻米功能营养物质的变化,并进一步拓展高RS大米的应用,本研究以R7954、GZ93、RS4及海水稻共4种不同RS含量水稻(Oryza sativa L.)为材料,分别对其糙米(Brown Rice,BR)进行发芽,发酵和发芽发酵处理,对发芽发酵前后稻米的营养成分、功能成分以及抗氧化特性进行分析。结果表明:1.RS4 BR中RS含量为10.30%,脂质,总蛋白和总FAA分别为4.35%,8.92%和407.41 mg/100 g。发芽后4种水稻RS均降低,但RS4依然保持较高水平的RS含量,为4.09%。发芽后4种水稻的脂质均下降,而总自由氨基酸(Free amino acids,FAAs)含量显著增加,其中RS4总FAAs高达1269.91 mg/100 g。在4个水稻品种中,RS4最易被红曲发酵且发酵程度较彻底。BR直接发酵后,4种水稻的淀粉和蛋白质含量均显著下降,而RS、脂质、自由糖和总FAAs含量显著上升,其中RS4的RS增加至12.35%,脂质由BR的4.35%增加至7.57%,自由糖由0.82%增加至1.17%,总FAAs增加至1528.81 mg/100g。发芽发酵处理后,红曲米糊化温度显著降低,食品更易蒸煮,但其它指标变化不如直接发酵。2.RS4 BR中-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)含量为251.38 mg/100g,发芽后,所有材料中GABA含量急剧增加,为BR中的2-5倍,其中RS4 GABA增加至759.29 mg/100 g。β-葡聚糖含量在发芽后亦显著增加,其中R7954增加0.47%,发酵后GABA和β-葡聚糖含量较发芽处理增加更显著,其中RS4发酵后GABA含量高达835.53mg/100 g;发芽发酵后,GZ93 GABA含量高达1422.43 mg/100 g,β-葡聚糖高达0.97%,而其它材料GABA含量并未较GBR或直接发酵进一步增加,甚至不如直接发芽或发酵;3.发芽后,除HSD(海水稻袁两优1号)总酚酸含量增加不显著外,其它材料总酚酸含量和总类黄酮含量均显著增加,其中RS4总酚酸高达3.14 mg GAE/g,总类黄酮含量高为3.64 mg Rutin E/g。发酵或发芽发酵后游离酚酸含量、结合酚酸含量、总酚酸含量、总类黄酮含量,ABTS抗氧化能力、DPPH抗氧化能力、对香豆酸含量、阿魏酸含量、芥子酸含量均显著增加;发芽发酵后RS4中游离酚酸和总酚酸均含量最高,分别为8.11 mg GAE/g和9.25 mg GAE/g;各材料结合酚酸中共检测了11种酚酸单体,其中阿魏酸含量最高,其次为对香豆酸,芥子酸和临香豆酸。发芽、发酵及发芽发酵处理后,大多数酚酸单体含量均显著上升,其中RS4发酵和发芽发酵样品中的阿魏酸分别为80.91μg/g和71.78μg/g。发芽、发酵及发芽发酵后ABTS和DPPH抗氧化活性均较BR显著增加,其中RS4发酵后ABTS和DPPH抗氧化活性分别为19.99μmol trolox/g和11.56μmol trolox/g,显著高于BR的4.43μmol trolox/g和3.6μmol trolox/g。综上,RS4易被红曲发酵,且经红曲菌直接发酵后的红曲米有着最高的RS含量(12.35%)和阿魏酸含量(80.91μg/g),具较丰富的脂质(7.57%)、FAAs、GBGA(835.83 mg/100 g)以及较强的抗氧化能力,且红曲发酵后RS4糊化温度下降。食用RS4红曲米可能会有效降低血脂以及肥胖和糖尿病的发生概率。研究结果为利用高RS水稻开发新型抗氧化、降血脂食品提供参考。
关键词: 水稻 ；抗性淀粉 ；发芽 ；红曲菌发酵 ；GABA
被引量
2
摘要： γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是哺乳动物中一种重要的抑制性神经递质,具有多种生理功能,广泛应用于食品、药品、保健品、饲料、农业等领域。GABA在市场上日益增长的需求对目前的工业生产技术提出了新的挑战。生物发酵法合成GABA由于其高效、环境友好的特性而备受青睐,目前传统的微生物发酵生产GABA方法多为好氧发酵,为了在厌氧发酵平台中实现GABA的高效生产,本研究利用工程改造的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）建立了全新的厌氧GABA生产平台,并展现出较高水平的GABA合成能力。
谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,GAD）是GABA合成中的关键酶,能催化一分子L-Glu脱羧形成一分子GABA和CO2。为了在C.tyrobutyricum中实现GABA的从头合成,首先验证了GABA代谢途径中关键酶基因的表达以确认代谢路径设计的合理性,并过表达大肠杆菌（Escherichia coli）来源的GAD构建了工程菌Ct-p MA01,在以24 g/L葡萄糖为底物的摇瓶发酵中GABA产量仅为0.11 g/L。随后过表达柠檬酸合成酶（Citrate synthase）来强化TCA循环的代谢通量,GABA产量为0.16 g/L。为提高GABA产量,通过进一步对来自于乳酸乳球菌和植物乳杆菌的GAD进行转化效率的筛选来提高工程菌的GABA产量,其中工程菌Ct-p MA02（过表达来自于乳酸乳球菌的GAD）具有最高的转化效率,在添加10 g/L谷氨酸钠（Monosodium glutamate,MSG）为前体物质的摇瓶发酵中GABA产量达到6.05 g/L。
通过添加前体物质MSG进行GABA的合成会使细菌在发酵过程中受到MSG引起的一系列抑制作用,细菌的生长可能因此受到抑制进而影响产物合成。热激蛋白对细菌胞外环境变化具有多种响应机制,为提高C.tyrobutyricum对底物MSG的耐受性以进一步提高GABA的产量,考察了Class I型热激蛋白基因在MSG胁迫下的转录表达变化。结果显示,MSG胁迫下gro ES和gro EL的m RNA表达水平提升尤为显著,因此在Ct-p MA02的基础上过表达gro ES和gro EL构建工程菌Ct-p MAG,其MSG耐受性和GABA产量均有显著提高,在添加40 g/L MSG的摇瓶发酵中GABA产量达到14.26 g/L,比Ct-p MA02提高34.53%。随后在5 L发酵罐中使用工程菌Ct-p MAG进行补料分批发酵实验,通过补充MSG,GABA终浓度在p H-free模式和p H-control模式下分别达到35.57g/L和122.34 g/L。最后,使用谷氨酸（L-glutamate,L-Glu）作为底物并应用两阶段发酵策略,GABA终浓度达到400.32 g/L,生产强度达到36.39 g/L/h,转化率为97.07%,产量和生产强度为已报道的领先水平。
C.tyrobutyricum发酵过程中同步合成的丁酸为GABA合成提供了必要的酸性环境,使丁酸偶联GABA发酵成为可能。GABA的合成受底物MSG转运的影响,为进一步提高MSG向细胞内的转运速率,研究了四种氨基酸转运蛋白基因在MSG胁迫下的转录表达变化,其中glt ABCtp的m RNA表达变化最为显著。随后在Ct-p MA02的基础上过表达氨基酸转运蛋白基因glt ABCtp,得到工程菌Ct-p MA02ABCTP,该工程菌在添加24g/L葡萄糖和30 g/L MSG的摇瓶发酵中丁酸和GABA产量分别达到7.56 g/L和13.70g/L,GABA产量提高29.25%。之后在5 L发酵罐中对发酵条件进行优化,通过流加MSG母液控制p H为5,并在添加90 g/L葡萄糖的情况下最终丁酸和GABA的产量分别达到23.65 g/L和32.17 g/L,展现出了出色的丁酸和GABA联产能力。
综上所述,本文通过筛选和过表达GAD获得了能够高效合成GABA的C.tyrobutyricum工程菌（Ct-p MA02）,随后通过提升菌株对MSG的耐受性,以及强化MSG转运进一步增强了工程菌合成GABA的能力,并初步探究了丁酸和GABA联产的方法。本文利用工程改造的C.tyrobutyricum建立了一个全新的GABA厌氧生产平台,为微生物发酵合成GABA的发展提供了新思路。
关键词: 酪丁酸梭菌 ；GABA ；谷氨酸脱羧酶 ；热激蛋白 ；丁酸和GABA联产
摘要： 鸡爪谷（Eleusine coracana L.）是一种耐寒耐旱的特色杂粮作物,因其丰富的营养价值备受关注。鸡爪谷籽粒中富含蛋白质、膳食纤维和黄酮类化合物、多酚等生物活性成分。黄酮类化合物在人体中展现出抗炎、抗菌、抗氧化以及抗病毒等多种药理活性。因此提升鸡爪谷中黄酮含量并以其为原料开发营养保健食品受到关注。研究表明,植物籽粒在外源处理条件下发芽,尤其是硫酸锌（Zinc sulfate,ZnSO4）或茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,Me JA）等处理能够促进植物体内黄酮的生物合成。水杨酸（Salicylic Acid,SA）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）作为重要的植物生长调节剂,不仅参与调控植物生长发育,增强非生物胁迫抗性,而且诱导次级代谢产物的合成。本文优化鸡爪谷发芽工艺,从生理代谢、酶活力和基因表达水平三个层面探究发芽及外源化合物处理调控鸡爪谷芽苗中黄酮生物合成及其生理代谢调控作用,以期为提高鸡爪谷的营养价值、拓展鸡爪谷原料的应用提供理论依据和技术支撑。主要研究结果如下: 1、优化了鸡爪谷发芽富集黄酮的工艺。发芽时间、发芽温度和光照时长均显著影响鸡爪谷中黄酮含量（p<0.05）,通过响应面法优化得到最佳发芽条件为:发芽时间5.7 d,发芽温度31.0℃,光照时长17.4 h,在此条件下鸡爪谷芽苗中黄酮含量最高达7.10μg/株。 2、研究了鸡爪谷发芽期间生理代谢和黄酮生物合成的变化。鸡爪谷在发芽5 d内,黄酮含量持续增加,3日龄和5日龄鸡爪谷芽苗中黄酮含量分别是籽粒的4.71和6.15倍。鸡爪谷发芽后总酚和花色苷含量显著增加（p<0.05）。鸡爪谷发芽过程中过氧化氢酶（Catalase,CAT）、过氧化物酶（Peroxidase,POD）、抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase,APX）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活力及其对应的基因表达量均显著提高（p<0.05）,表明发芽激活了鸡爪谷芽苗抗氧化系统。同时,发芽显著增强了3日龄和5日龄鸡爪谷芽苗中苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）、肉桂酸4-羟化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase,C4H）和4-香豆素辅酶A连接酶（4-Coumarate:Co A Ligase,4CL）活力并上调了黄酮合成代谢相关基因（Ec PAL、Ec C4H和Ec4CL等）的相对表达量,表明发芽通过提高黄酮合成关键酶活力及合成相关基因的表达量促进了鸡爪谷芽苗中黄酮的合成积累。 3、研究了ZnSO4/Me JA处理对鸡爪谷芽苗生理代谢和黄酮富集的影响。筛选得到适宜富集鸡爪谷芽苗黄酮的处理条件为5 m M ZnSO4和150μM Me JA。ZnSO4/Me JA处理显著提高了鸡爪谷芽苗中黄酮含量（p<0.05）,在发芽6 d时,ZnSO4/Me JA处理下黄酮含量分别为对照的1.21和1.22倍。鸡爪谷芽苗经ZnSO4/Me JA处理后,H2O2、O2￣·和MDA含量增加,芽长和鲜重下降,表明ZnSO4/Me JA对鸡爪谷芽苗造成了氧化损伤和生长抑制。ZnSO4和Me JA处理均显著提高了CAT、POD和APX活力及相应基因的相对表达量（p<0.05）,增强了抗氧化能力。ZnSO4处理显著提高PAL、4CL和C4H活力并上调Ec PAL、Ec C4H、Ec4CL等基因的相对表达量。Me JA显著提高PAL和C4H活力并上调Ec PAL、Ec C4H等基因的相对表达量。胁迫相关转录因子Ec MYB和Ec NAC在ZnSO4/Me JA处理下均显著上调（p<0.05）。ZnSO4和Me JA处理对鸡爪谷芽苗中黄酮合成的调控呈现一定的差异,但均通过增强黄酮合成关键酶活力及相关基因的相对表达量来促进黄酮的生物合成。 4、研究了外源SA/GABA对ZnSO4处理下鸡爪谷芽苗生理代谢和黄酮富集的影响。筛选得到ZnSO4处理下适宜富集鸡爪谷芽苗黄酮的外源添加物及其作用浓度为50μM SA和1 m M GABA。外源SA/GABA均显著增加了ZnSO4处理下鸡爪谷芽苗中黄酮含量并改善了芽苗的生长形态,但对生理代谢的调控有所不同。其中,SA显著降低了鸡爪谷芽苗中MDA、H2O2和O2￣·含量,而GABA显著降低了H2O2和O2￣·含量（p<0.05）。同时,SA显著增强了CAT、SOD和APX活力并上调Ec CAT、Ec SOD和Ec APX相对表达量,而GABA显著增强了CAT、SOD、APX和POD活力并上调Ec CAT、Ec SOD、Ec POD和Ec APX相对表达量（p<0.05）,表明外源SA/GABA均能通过增加抗氧化酶活力及其基因表达量,提高抗氧化能力。此外,ZnSO4处理下,外源SA/GABA通过增强PAL和C4H活力及提高Ec PAL、Ec C4H等基因的相对表达量来促进黄酮积累（p<0.05）。结果表明,SA/GABA处理通过增强苯丙烷代谢途径中关键酶的活性及其基因表达水平,从而促进黄酮类化合物的富集。
关键词: 鸡爪谷 ；发芽 ；黄酮 ；硫酸锌 ；水杨酸 ；γ-氨基丁酸
摘要： γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是一种非蛋白质氨基酸,也是一种神经递质。GABA与神经系统相关疾病的发生和发展密切相关,在精神类疾病的诊断与治疗中发挥着不可替代的作用。GABA还参与免疫系统中激素的合成和释放、扩张心脑血管调节血压的过程。鉴于GABA重要的生理作用,其逐渐被研究开发为功能性食品和药物用于保健和治疗疾病。GABA可通过不同方法来制备,但不论何种方法都面临着从复杂基质中分离的困境。现有分离方法因前处理过程复杂、设备昂贵、有机溶剂使用量大、耗时长、能耗高、或对分离环境和操作人员的要求高等,无法满足快速大批量分离的要求。由此可见,开发一种高效快速分离纯化GABA的方法,对食品和药物的制造以及营造良好的市场环境均有重要意义。为此,本文进行了以下探索:1.为准确评价所制备材料的分离性能,首先对GABA的测定方法进行了研究。氨基酸可与水合茚三酮显色,有色产物在可见区可测,对仪器的要求低。但不同文献报道的测定条件不尽相同,主要区别在于体系的酸度、显色剂的用量、加热的温度和时间。为建立准确定量检测GABA的方法,本文首先研究了溶剂的影响,并系统地探究显色条件的影响。结果表明,在p H=7.0时,0.5～80 mg/L浓度范围内的GABA与1.8 g/L水合茚三酮乙醇溶液沸水浴60 min,反应生成的有色产物在567 nm处的吸光度与GABA的浓度线性关系良好（R2=0.9998）。这为茚三酮显色测定GABA提供了一个针对性较高的最佳测定条件,为后续工作奠定了基础。该方法有较好的重现性和一定的选择性。结合TLC对市售的玉米淀粉发酵提取的含GABA的添加剂样品进行分析,结果证明该方法的准确度较高。该方法不仅可直接用于一些样品中GABA的直接定量检测,也可为液相色谱的检测提供参考。这种简便、快捷、直观的检测方法在当前GABA被日益广泛关注和大量应用的情况下,对于指导生产和产品质量检验均具有重要意义。2.由于GABA水溶性好,很难将GABA从水溶液中吸附以达到在复杂基质中快速分离GABA的目的。为此,本文以有机物苯乙烯（St）聚合包覆改性后的Fe3O4磁珠为磁性聚合物分离载体,利用氯磺酸对Fe3O4@St表面的有机层进行磺化,成功制备表面富含磺酸基的磁性复合材料Fe3O4@St-SO3H,并将其应用于GABA的吸附分离。通过TEM、FTIR、XRD、TG和BET对Fe3O4@St@SO3H磁性复合材料表征。通过制备条件和吸附条件的优化,最终Fe3O4@St-SO3H材料对GABA吸附率高达89.03%。研究发现,Fe3O4@St-SO3H对GABA的吸附属于单层均相物理吸附。Fe3O4@St-SO3H对GABA的最大吸附容量为127.3mg/g。通过对洗脱液和洗脱方式的研究发现,吸附在Fe3O4@St-SO3H表面的GABA可利用p H=7.0的PBS（0.3 mol/L）在20℃震荡1 h被洗脱,洗脱率达97.54%,且洗脱后的Fe3O4@St-SO3H材料重复使用10次后,对GABA的吸附率仍在75%以上,重复使用的性能优异。最后将Fe3O4@St-SO3H磁性复合材料用于分离实际桑叶和麦麸样品中的GABA,通过LC-MS手段对比检测吸附前后和洗脱前后的溶液中GABA的相对含量,发现Fe3O4@St-SO3H磁性复合材料对两种实际样品中GABA的吸附率分别为87.61%和89.35%,富集倍数分别为3.99和3.97。该磁性复合材料不仅可用于复杂基质中GABA的快速磁性分离纯化,也可用于GABA检测前的样品处理。3.为进一步实现GABA的高选择性吸附分离,本文将高顺磁性的Fe3O4纳米材料与高选择性的分子印迹技术相结合,以GABA为模板分子,以高生物相容性的SiO2为印迹层,成功制备出磁性纳米印迹聚合物Fe3O4@SiO2 MIPs。通过对材料制备和吸附条件进行优化,得到最佳制备和吸附条件,并通过TEM、FTIR等对材料进行表征。热力学和动力学数据表明,该种磁性纳米印迹聚合物对GABA的最大吸附容量为36.05 mg/g。通过对洗脱液的探究发现,0.1 mol/L的HCl可将吸附在印迹聚合物表面的GABA顺利洗脱,还不破坏Fe3O4@SiO2 MIPs的结构及吸附性能,洗脱后的材料重复使用10次后仍具有良好的吸附性能。Fe3O4@SiO2 MIPs对GABA的吸附属于单分子层吸附,动力学模型拟合结果为准二级动力学,说明该行为并非单一吸附机理作用的结果。相对温和的条件下,Fe3O4@SiO2 MIPs在30 min内可完成对GABA的吸附分离,分离速度快。比较Fe3O4@SiO2 MIPs和非印迹聚合物（Fe3O4@SiO2 NIPs）对干扰物的吸附,发现Fe3O4@SiO2 MIPs对干扰物的吸附均低于Fe3O4@SiO2 NIPs的吸附,说明Fe3O4@SiO2 MIPs对GABA具有较好的选择性。与常用的高效液相色谱法相比,该方法避免了分离过程中大量使用有机溶剂;降低了对分离条件和人员的要求,条件更易满足。该方法对于未来食品和药用级别的GABA的工业生产提纯和营造良好的市场运营环境具有积极作用。4.为排除其他基质对测定GABA的干扰,制备了水溶性较好的CdTe@SiO2 QDs,并与高选择性的分子印迹技术相结合,以GABA为模板分子,通过高透光性的SiO2的固定,实现了GABA在CdTe@SiO2 QDs表面的印迹。通过对洗脱条件和制备条件优化后,发现CdTe@SiO2 MIPs与GABA相互作用呈现荧光增强的结果,且荧光增强的程度与GABA的浓度具有一定的线性关系。通过抗干扰实验证明GABA对CdTe@SiO2 MIPs的荧光增强作用具有一定选择性。这为利用量子点与分子印迹结合选择性检测GABA提供了新方法,为在复杂样品中直接检测GABA奠定了基础。
关键词: γ-氨基丁酸 ；水合茚三酮 ；磁性材料 ；分子印迹 ；磺化 ；量子点
被引量
1
摘要： 谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),是能够将谷氨酸(Glutamate,L-glu)转化成 γ-氨基丁酸的唯一酶。γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA),是生物体内广泛存在的一种非蛋白氨基酸,具有许多重要的生理功能,如降低血压、镇静和预防老年痴呆等,因此,GABA在制药、食品、保健等行业存在巨大的应用潜能。目前,国内产GABA野生菌株能力较低,同时,在发酵生产过程中,GAD的最适pH偏低,普遍在4.0-5.0之间,当pH达到6.0时,酶就因解聚而失活,不利于工业应用。因此,为了得到能够高产GABA的菌株和拓宽GAD的pH适应范围,本研究从泡菜样品中筛选高产GABA的菌株,优化其发酵条件,同时在体外对GAD分子进行改造。主要研究内容和结果如下:1.高产GABA菌株的筛选鉴定。本研究以自贡地区的酸菜为样品,以乳酸菌产酸分解含有碳酸钙的MRS培养基形成溶钙圈为依据,初步筛选出乳酸菌,再通过TLC和HPLC法筛选出4株能够产GABA的菌株,对4株产GABA的菌株分别进行发酵培养,以产GABA的标准菌株CICC22144为对照,检测到其GABA的产量分别为 0.736g/L,0.691g/L,1.11g/L 和 1.92 g/L。对产量最高的 Liulab84菌株进行形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学鉴定,结果表明其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),命名为 Lactobacillus plantarum LC84。2.菌株产GABA发酵条件优化。通过单因素和正交试验,进行发酵条件优化后,结果表明A3B2C1D3为最优组合,即L.plantarum LC84的最优发酵条件确定为:发酵温度39℃,pH6.0,接种量4%,发酵时间60h,测得GABA的含量为3.83 g/L,。3.谷氨酸脱羧酶基因的克隆表达。利用分离得到的L.plantarum LC84作为出发菌株,得到其中的GAD基因亚克隆,与pET28a(+)质粒连接,构建重组质粒pET28a-gad在E.coli BL21(DE3)中进行表达,分离纯化,检测其酶学性质。结果表明,来自不同物种的谷氨酸脱羧酶,在碱基序列上也存在较大的差异。SDS-PAGE电泳分析检测表达了一个约53KDa的可溶性蛋白。对得到的蛋白进行纯化,检测其酶活和基本的酶学性质,谷氨酸脱羧酶的酶活最适pH为4.8,最适温度在45-50℃之间,最适辅酶磷酸哔多醛(PLP)的添加量为50μm/L,研究中添加的金属离子对酶活都没有明显的促进作用,相反,Cu2+和Ag+对酶活具有强烈的抑制作用,Ag+几乎使GAD酶失活。4.谷氨酸脱羧酶的分子改造。为拓宽GAD的pH适应性,利用同源建模的方法对其进行分子改造。采用DPn1的方法,对野生谷氨酸脱羧酶成功进行了定点突变,成功将294位点的天冬氨酸(ASP)突变为甘氨酸(Gly),307位点的丝氨酸(Ser)突变为天冬酰胺(Asn),312的位点谷氨酸(Glu)突变为丝氨酸(Ser),346的位点谷氨酰胺(Gln)突变为组氨酸(His),进过突变之后,E312S突变体,在pH4.8条件下,酶活为野生型的1.6倍左右,在pH6.2时,突变体酶活相比于野生型提高了 5倍左右,在4.8-5.8范围内,酸性稳定性保持60%以上。Q346H突变体,在pH4.8条件下,酶活稍高于野生型,在pH6.2处,其酶活提高了 2倍左右,在4.8-5.8范围内,Q346H突变体,保持40%以上酶活性。综上,从酸菜中获得了野生产GABA的植物乳杆菌,通过对其发酵条件进行优化,最大限度地发挥菌种生产GABA的性能,同时对植物乳杆菌中的GAD,利用基因工程手段进行外源表达,在此基础上,进行定点突变,拓宽了该酶的反应pH,为GAD酶学性质的改造提供依据,同时为生产GABA的工业应用中降低生产和设备损耗成本奠定基础。
关键词: 植物乳杆菌 ；谷氨酸脱羧酶 ；γ-氨基丁酸 ；基因克隆与表达
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摘要： 酶作为一种生物催化剂具有高效、温和、环保的优点，在工业生产中可以作为一种安全环保的生产方式，受到越来越普遍的关注和应用。L-色氨酸是人和动物重要的必需氨基酸，在医药、食品和饲料添加剂等方面具有广泛的用途。由于丝氨酸羟甲基转移酶（Serine hydroxymethyltransferase，SHMT）和色氨酸酶（Tryptophanase，Tpase）两种酶特殊的物理和化学特性，可以利用甘氨酸和吲哚采用双酶结合联用的方法酶法转化生产 L-色氨酸，将为色氨酸的高效生产带来新的曙光。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）在食品、医药保健、饲料加工领域都有广泛的应用前景，其市场需求也越来越大。谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）是一种能够高效专一的催化谷氨酸生产γ-氨基丁酸的酶，因此在发酵工业、制药等领域发挥着很重要的作用，但游离态的谷氨酸脱羧酶在应用上却受到很大的限制，因此对其进行固定化研究和转化过程控制就成为酶工程的重要课题之一。 为了实现双酶共表达和催化的功能，本文首先构建一株丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶共表达菌株（BL21-pET28a-SHMT-Tpase），并采用design expert软件设计和优化了酶活表达诱导条件，考察了IPTG浓度，温度和时间等对丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶酶活的影响。根据响应面结果确定BL21-pET28a-SHMT-Tpase共表达菌株在0.5 mM IPTG浓度、33℃条件下诱导4 h表达的酶活性最高，丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶酶活分别为5500 U和1300 U。并进一步确定了酶法转化条件，实现由甘氨酸到色氨酸的高效转化，当甘氨酸浓度为1 g/L时，转化率为45.72％。 另外本文还构建了一株谷氨酸脱羧酶具有纤维素结合域固定化标签的谷氨酸脱羧酶表达菌株（BL21-pET35b-GAD），并考察了高碘酸氧化和纤维素结合域亲和吸附等多种谷氨酸脱羧酶的固定化条件，实现由谷氨酸到γ-氨基丁酸的固定化高效转化。测定γ-氨基丁酸含量验证酶活约为0.9 U，转化率为100%。此外，采用近红外光谱在线控制技术监测反应过程，优化了光谱预处理方法，构建了谷氨酸和γ-氨基丁酸多元校准模型，实现了产物和底物含量的准确预测。利用该技术结合酶法固定化转化条件，实现了近红外技术监测酶法转化过程，描绘了100 g/L谷氨酸底物连续酶法转化生成GABA过程的反应过程曲线，当选定波长区间为1567～1789 nm时，对于L-谷氨酸外部验证的预测标准偏差为1.7 g/L，决定系数为97.81%;对于γ-氨基丁酸外部验证的预测标准偏差为5.14 g/L，决定系数为92.91%，可用于酶法转化过程中预测谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量变化。 本研究成功构建构建一株丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶共表达菌株，和一株谷氨酸脱羧酶固定化表达菌株，进行酶法转化条件的优化，以及建立转化过程快速检测方法，为 L-色氨酸和γ-氨基丁酸的酶法转化和近红外在线监测提供了理论和实践基础。
关键词: 酶法 ；L-色氨酸 ；γ-氨基丁酸 ；转化过程
摘要： γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,简称GABA)是一种非蛋白质组成成份的天然氨基酸,是哺乳动物中枢神经系统中广泛分布的最重要的抑制性神经递质,具有降低血压、治疗癫病、促进生殖、增进脑活力、增强记忆、控制哮喘等多种生理功能。GABA作为一种新型功能性因子,正逐渐被广泛用于医药、食品保健、化工及农业等行业,因此受到越来越多的科学工作者的关注。
乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌,能够将碳水化合物发酵生成乳酸,有帮助消化、有助人体肠道的健康等功能,因此常被视为健康食品。科学家长期研究的结果证明,以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌,它们数量的多和少,直接影响到人的健康与否,直接影响到人的寿命长短。因此,利用乳酸菌生产的GABA能达到食品安全级,并可进一步丰富乳酸菌作为有益菌的保健功效,具有广阔应用范围和市场前景。
本研究使用短乳杆菌L2菌株生产GABA,并建立一个反映因素与产量之间的非线性的模型,保证得到MRS培养基最优组合,提高GABA产量；有效利用两种农副产品资源培养乳酸菌,高产高效生产食药用级的GABA,降低生产成本；最后研究了GABA分离纯化的相关工艺。
首先,运用Plackett-Burman设计对培养基组成和培养条件进行主要影响因素筛选,如培养基碳源、氮源、初始pH值、培养温度和培养时间等。在此基础上通过误差反向传播神经网络(BPN)和遗传算法(GA)用来确定GABA产量的最佳发酵参数。使GABA产量达到了27.765g/L,比原始培养基的13.452g/L提高了106.4%。
其次,以廉价的农副产品麦麸和小米糠为培养基原料,L-谷氨酸钠(L-MSG)为合成底物,采用单因素法优化发酵条件(pH值、培养温度、培养时间)。结果表明,适宜的培养条件为：pH4.0,培养温度30℃,培养时间72h。利用D-优化设计研究对GABA产量影响较大的3种培养基成分(麦麸、小米糠、L-MSG)之间的交互关系以及最佳值。利用D-优化设计建立回归方程。通过计算获得最优发酵培养基组成成分为：麦麸22.454g/L,小米糠20.000g/L,谷氨酸钠57.546g/L。在优化的培养基组合和发酵条件下,发酵液中GABA的产量可达27.2069g/L,比原始培养基的13.452g/L提高了102.3%。
第三,为了尽可能的获得高纯度的GABA,还对脱色工艺进行了初步研究。考察了6种不同的大孔脱色树脂和活性炭对GABA发酵液的脱色效果,发现ADS-7具有较好的脱色效果和GABA得率。在此基础上,进一步研究了不同因素对ADS-7脱色效果的影响。确定了ADS-7最佳的脱色条件为：pH5.0,脱色温度25℃,脱色时间60min。在此条件下脱色率达到95%以上,GABA损失率为7%。最后,通过D001阳离子交换树脂对GABA进行提取,工艺条件为：上柱发酵液pH5.0,上柱速度1BV/h,去离子水和1mol/LNH3·H2O分步洗脱,取得较好的分离效果。
最后,将实验提取获得的粉末状固体采用核磁共振(NMR)手段进行了分析,并与标准品进行比较。核磁共振中的氢谱中几乎无杂质峰并且与GABA标准品的出峰一致,结果证明从发酵液提取获得的物质为GABA并且纯度接近100%。
关键词: γ-氨基丁酸 ；短乳杆菌 ；发酵 ；提取 ；神经网络 ；D-优化设计
被引量
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摘要： 糙米,即含有胚芽与皮层的稻米籽粒,是全谷物食品的重要原料之一。目前稻谷的加工过程去除了糠层和胚芽,致其无法发芽,造成可食用资源的浪费。经过发芽与富钙处理后,糙米的营养成分远高于精白米,保健功效显著,市场前景巨大。本文立足于糙米的富钙发芽工艺、营养价值、发芽后品质的改善、结合我国人体钙摄入情况不容乐观等现状,研究开发出最大限度强化营养、改善食用品质、适合广大消费者的富钙发芽糙米方便米饭。论文就富钙发芽糙米做出以下研究:1.富钙发芽糙米发芽工艺优化对浸泡温度、浸泡时间、发芽温度、发芽时间以及钙浓度对γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)累积量、有机钙含量的影响进行了单因素试验。选取发芽温度、发芽时间、钙浓度作为研究对象,以GABA累积量、有机钙含量作为试验指标,进行响应面设计、交互作用分析,得到显著性水平为极显著的回归方程;经软件分析出富钙发芽糙米工艺优化参数后,考虑到可行性因素,对试验结果进行了修正:发芽温度、发芽时间、钙浓度因素修正为35℃、24.2h、0.5%,该修正因素试验下GABA累积量达到132.56mg/100g,有机钙含量达到212.68mg/100g。经验证模型试验中得出实际值与预测值的相对误差为1.38%、1.49%,认为该方程能够较准确的反应所筛选的因素对GABA累积量与有机钙含量的影响。2.富钙发芽糙米营养特性与理化性质分析富钙激活了糙米吸水能力,35℃条件下吸水速率与40℃下吸水性几近一致,富钙发芽糙米吸水率大于空白发芽糙米;试验中所测定糙米的游离氨基酸含量为0.88mg/g,发芽与富钙发芽后游离氨基酸含量分别增加了0.19mg/g、0.26mg/g;富钙发芽糙米在发芽过程中,赖氨酸含量达到166.6μg/g,比糙米、发芽糙米相比分别提高55.45μg/g、13.15μg/g;富钙发芽后可溶性蛋白积累量为2.63mg/100g,与发芽糙米相比提高0.12 mg/100g;发芽后干物质损失率不断增大,发芽至24h,Ca2+处理的损失率比发芽糙米高出2.35个百分点;糙米在发芽过程中膳食纤维含量变化为缓慢增加。综上可知富钙后发芽糙米营养价值有所提高。发芽糙米透光率为0.39,比糙米的0.30升高了30.0%;而富钙发芽糙米透光率为0.40,比糙米高了33.3%;糙米析水率为46.3%,而空白与富钙发芽糙米析水率为32.5%、29.1%,分别下降了13.8个百分点和17.2个百分点,冻融稳定性增强,富钙后呈显著性变化;在静置初期,糙米糊上清液体积变化速率大,在发芽后期糙米、发芽糙米与富钙发芽糙米糊的上清液体积变化趋于平缓,因此可知糙米凝沉性较富钙与发芽糙米相比较差;糙米发芽后淀粉酶活力升高,富钙处理后活力得到进一步提升。由于糙米透明度低,冻融稳定性与凝沉性差,淀粉的化学性质较差,淀粉老化速度快,因此不利于加工和直接食用,需进行发芽处理。而富钙后,其淀粉性质较单纯发芽有所改善。3.富钙发芽糙米品质改善通过蒸煮工艺的试验,选择浸泡时间、富钙发芽糙米与精白米配比比例、米水比、焖蒸时间分别为60min、0.8:1、1:1.2、40min较宜;通过对酶的筛选,选择纤维素酶为品质改善酶,其酶解单因素的最佳条件为:浓度1.0mg/m L、时间90min、温度50℃、料液比1:2、p H值5.0。经品质改善后进行品质评价,得出如下结论:糙米、精白米和富钙发芽糙米出饭率存在显著性差异;富钙发芽糙米体积膨胀度适中,糙米的体积膨胀度小于精白米;富钙发芽后米汤固形物含量低于糙米,避免了营养的大量流失。富钙发芽糙米碱消值大于糙米,蒸煮时间有所减少。经成分测定分析可知,煮饭后其有机钙含量可较好保存。综上,本文选择富钙发芽糙米为方便米饭的应用研究。4.富钙方便米饭的储藏特性与货架期预测富钙方便米饭具有既不过硬弹性又大,并且咀嚼性较好的质构特性;富钙与发芽糙米方便米饭的弹性随发芽时间延长而降低,因此,储藏时间过长会影响方便米饭的品质特性。富钙与精白米方便米饭比较,硬度上升速率较大,说明精白米方便米饭在短期内较容易回生,而富钙方便米饭相对不易回生;发芽糙米的细菌数量远高于富钙与精白米,但焖蒸后其细菌数量显示为0cfu/g。得到酸价货架期预测模型与过氧化值货架期预测模型。本文基于国内外研究现状做出研究,具有以下创新点:(1)技术创新:优化糙米富钙发芽工艺,研究富钙量对有机钙量与GABA累积量的影响;(2)产品创新:将富钙发芽糙米应用于方便米饭。
关键词: 富钙 ；发芽糙米 ；品质改善 ；方便米饭 ；货架期预测
被引量
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摘要： γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种非蛋白质天然氨基酸,经谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸(L-glutamic acid)脱羧所得。普遍存在于自然界中,是哺乳动物中枢神经系统的主要抑制性递质,具有多种重要的生理功能,在医疗、食品保健、化工和农业等方面的应用存在巨大潜力。GABA的天然含量极低,从动植物中提取非常困难,目前生产GABA的方法主要为化学合成法与微生物发酵法。相比之下,微生物发酵法反应条件温和、安全性高、成本低,更具备开发前景。目前已报道的微生物GAD活力普遍不高,GABA产量大多在3～30 mg/mL左右,且研究对象多为大肠杆菌GAD,因其生物合成GABA过程中存在巨大的安全隐患,其产物在食品、医药方面的应用也存在很大的局限性。近年来虽有许多关于筛选产GABA菌株的研究,但是可实际投入生产的却极少,探索得到安全、高产的菌株仍是急待解决的课题。为获得产γ-氨基丁酸安全菌株,本实验从泡菜汁及酸奶液中进行定向筛选,利用薄层层析法对其发酵物进行了初步分析,随后对其进行了16S rDNA基因测序,最后利用HPLC法对产物定量分析评估其生产能力。结果表明得到六株产GAD催化L-Glu脱羧生成GABA的菌株,此六个菌株均可生产GABA,在GenBank中进行同源性比对后,鉴定六菌株均属于植物乳酸短杆菌。定量分析六株菌发酵液中γ-氨基丁酸含量发现其产量均在200～500μg/mL之间,其中最高产量为493.3μg/mL。结果表明,硅胶薄层层析(TLC)可以快速定性检测发酵产物中是否含有GABA,而优化后的HPLC方法能准确定量检测培养物中的GABA含量。筛选获得的乳酸杆菌生物安全性高,有一定应用推广前景。
关键词: 谷氨酸脱羧酶 ；γ-氨基丁酸 ；筛选 ；鉴定
摘要： 红曲霉(Monascus spp.)是我国酿造微生物中的一个重要的属,至今已有数百年的历史。近几年红曲霉的许多功效相继被证实,其发酵产物γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid, GABA)、莫纳可林K (Monacolin K)、红曲色素等己广泛应用于医药保健、食品加工及相关领域中。1995年法国学者首先在红曲中发现毒性物质—桔霉素,使红曲产品在国内外销售受到了一定限制。目前GABA、桔霉素等产物的生产、调控及应用已成为国内外研究的热点,虽进展比较缓慢,大多数研究成果暂时还不能应用于生产,技术手段尚处于建立阶段,但对调控GABA、桔霉素代谢的基因研究,是未来红曲霉产物调控、生产的必要基础。本实验利用红曲霉(Monascus ruber) Mr-5菌株(CGMCC NO. M208043)作为实验材料,建立了根癌农杆菌介导红曲霉的高效转化体系,获得了1478株红曲霉转化子,通过摇瓶发酵并对GABA、桔霉素进行检测,筛选到50余株GABA、桔霉素产量与原始菌株有较大变化的红曲霉突变子,进而以HPLC技术进行精确定量。之后利用TAIL-PCR和hiTAIL-PCR两种方法扩增部分转化子的T-DNA侧翼序列,获得与GABA、桔霉素代谢相关的基因片段,通过生物信息学比对,扩增出相关基因全长。通过生物信息学软件分析了相关基因功能。主要研究结果如下：1、根癌农杆菌介导的红曲霉T-DNA插入突变体库的构建利用根癌农杆菌AGL-1菌株对红曲霉Mr-5菌株进行转化,探讨了农杆菌浓度、诱导时间、诱导剂浓度、红曲霉培养时间、孢子浓度、共培养温度、共培养时间等条件,建立了一个高效的红曲霉转化体系：将根癌农杆菌AGL-1活化2d～3d,挑取单菌落扩大培养到OD600约为0.15。离心得菌体,加入含有50～200 μmol/L AS、pH值5.0-5.8的IM培养基,菌悬液培养至OD600约为0.5。以无菌水洗下培养21d的红曲霉孢子,经4层擦镜纸过滤,去除菌丝及杂质,制成105个/mL左右的孢子悬液。两种悬液等体积混匀,涂布于贴在Co-IM培养基的承载膜上,25℃培养2.5 d。将膜揭下贴于含有头孢霉素和筛选物质的平板上。待转化子长出,挑取单菌到筛选平板上,并转接5-6次,验证遗传稳定性。2、转化子的遗传稳定性分析、PCR鉴定及形态观察在1478株红色红曲霉转化子随机挑选50株转化子接种于PDA培养基,30℃、7d培养,转接6次以上后至PDA培养基(150 μg/mol潮霉素B)上培养,观察菌落生长情况,计算红曲霉转化库的稳定性。提取转化子基因组DNA,对潮霉素抗性基因进行扩增。结果显示,随机挑选的转化子中96%的样本基因组中存在潮霉素抗性基因,表明该T-DNA插入突变库的遗传稳定性高,符合实验要求。对各转化子的菌落形态及显微形态观察。大部分转化子形态及生理生化特征与原始菌株相似,少数转化子在菌落颜色、菌落形态、生长速度、显微特征等方面发生了较大变化。3、GABA、桔霉素产量变化较大的红曲霉突变子的筛选利用250mL锥形瓶对红曲霉转化子进行发酵培养,通过纸层析法对1478株转化子的发酵液进行检测,选取部分GABA产量变化较大的红曲霉转化子进行再发酵,通过高效液相(HPLC)法对其GABA产量进行精确测定；通过薄层层析对1478株转化子的发酵液进行检测,选取部分桔霉素产量变化较大的红曲霉转化子进行再发酵,通过HPLC法对其桔霉素产量进行精确测定。最终获得50余株GABA、桔霉素产量较原始菌株Mr-5变化较大的红曲霉转化子。4、转化子T-DNA侧翼序列扩增及生物信息学分析利用TAIL-PCR和hiTAIL-PCR技术,通过T-DNA右翼序列设计3条嵌套引物、7条短简并引物和5条长简并引物,对插入红曲霉转化子T-DNA的侧翼序列进行扩增,经过测序获得片段序列。通过Blast比对,表明82号突变子T-DNA侧翼片段与细菌色氨酸合成酶B亚基基因有66-100%的相似性:1358号突变子T-DNA侧翼片段与细胞色素C过氧化物酶基因有85%的相似性；1338号突变子T-DNA侧翼片段与B葡糖苷酶基因有99%的相似性；660号突变子T-DNA侧翼片段,经比对与多种细菌、真菌的谷氨酸脱羧酶(GAD)相似程度较高,特别是与黑曲霉(Aspergillus niger)部分片段相似程度达到79%,与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)部分片段相似程度78%,与棒曲霉(Aspergillus clavatus)部分片段相似程度达到76%。5、红曲霉GAD基因的扩增、验证与分析将TAIL-PCR所得片段与红曲霉Mr-5的cDNA进行比对分析,设计引物并以红曲霉基因组作为模板,扩增出G2-1片段；经上下游序列的分别验证,证明了该片段为红曲霉Mr-5基因组中的完整序列,并确认了内含子与外显子部分,通过Orf Find、Conserved Domains、Blastp、ClustalX等工具分析了该基因序列的氨基酸组成。
关键词: 红曲霉 ；ATMT ；GABA ；TAIL-PCR ；GAD
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摘要： 红曲菌(Monascus spp.)是我国传统的食用和药用微生物,在我国已有上千年的应用历史。它能分泌产生色素、莫呐可啉类(monacolins)物质、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、麦角固醇和丰富的水解酶类等,是生产食品发酵剂、着色剂、保健食品、药品或其原料的重要微生物资源。目前,国内外对红曲菌菌种的分类、选育、发酵条件及代谢产物分离纯化的研究相对较多,而有关红曲菌的分子生物学研究才刚刚起步,有关功能基因的研究很少,而关于红曲菌产色素、产孢等相关基因的研究尚未见报道。
本研究以紫外线为诱变剂,以红色红曲菌(Monascus ruber)M-7为出发菌株,获得24株稳定的白化子与小菌落等突变株。在此基础上,对突变子的菌落形态、显微结构及其次生代谢产物等进行了分析。本课题为鉴定红曲菌菌落大小、颜色和产孢子等相关基因的研究提供了材料。具体内容如下:
1红色红曲菌(Monascus ruber)M-7的紫外诱变
对出发菌株M-7进行斜面培养18 d,用无菌水洗下孢子,用玻璃珠打散,稀释至10～6个/mL,涂布于25 cm×30 cm玻璃板,30 W,40 cm进行30 min紫外照射,避光培养7 d,挑选形态发生变化的突变子。经过多轮诱变共获得26株形态发生显著变化的突变子。突变子经过3代连续培养后,筛选获得24株稳定的突变子,遗传稳定性为92.3%。这些突变子的编号分别为501c、518b、518e、618a、618f、618e、618h、1102a、729b、929b、929h、929j、1102g、929k、729c、501d、929d、929f、929g、421a、421c、426q、618g、1102b。
2突变子的形态特征观察
25℃,PDA培养出发菌株M-7与筛选到的突变子9 d,按其菌落直径、正反面颜色、气生菌丝形态等特征共分为六大类:Ⅰ.出发菌株M-7;Ⅱ.与出发菌株M-7菌落特征相似的菌株,共7株,分别是1102a、729b、929b、929h、929j、1102g、929k;Ⅲ.小菌落菌株,直径仅1.9 cm左右,分别是501c、518b、518e、618a、618f,618e、618h;Ⅳ.白化子菌株,菌落粉色,共一株,为729c;Ⅴ.绒毡状菌落,共4株,分别是501d、929d、929f、929g;Ⅵ.栗色菌株,共5株,分别是421a、421c、426q、618g、1102b。随后,25℃下用插片法PDA培养9 d对所筛突变子进行显微形态观察。
3突变子次生代谢产物的分析
从供试菌株制得的红曲粉中分别提取色素、桔霉素、莫呐可啉K、γ-氨基丁酸四种次生代谢产物,检测分析其产量,得出结果如下:501d莫呐可啉K产量最高,达390.77μg/g;618f、929h、929b、929j的monacolin K产量均较低,已低于本实验条件下HPLC的最低检测限。其中有10株突变子monacolin K产量提高。618h的桔霉素产量最高,达40.12μg/g;729c、421a、421c产量低于检测限。518b的γ-氨基丁酸产量最高,达798.25μg/g,426q产量最低,仅20.07μg/g。618h色价最高,达2457 u/g;729c色价最低,为37 u/g。
4突变子501d和618h发酵条件初步研究
为了更好的了解各突变子的特性,对高产莫呐可啉K突变子501d与高产色素与桔霉素突变子618h进行发酵条件初步研究,包括固态发酵与三角瓶液态发酵。其中,固态发酵条件研究包括培养温度和时间因素;液态摇瓶发酵条件研究包括碳源与初始发酵液pH值两因素。得出结果如下:(1)固态发酵:不同温度培养红曲菌,其次生代谢产物变化较大。在30℃时,桔霉素产量达最高,之后呈下降趋势;25℃时,莫呐可啉K产量最高,之后下降;色价在15～35℃逐渐升高,25℃以后,上升趋势减缓。从8 d～15 d,色价、桔霉素、莫呐可啉K均呈上升趋势,15 d色价与桔霉素、莫呐可啉K产量基本达到最大值,之后变化趋于平缓或降低。(2)三角瓶发酵:甘油为碳源时其色价、莫呐可啉K和桔霉素产量均较高,但以葡萄糖为碳源时,桔霉素产量相对要低,莫呐可啉K与色价均较高。pH值变化对两株突变子色素、桔霉素与莫呐可啉K的产量都有较大的影响。pH值为3时莫呐可啉K与桔霉素产量均极低。桔霉素产量在pH为6时达最高;莫呐可啉K产量在pH为5时最高;色价在pH值为6时达最高。
关键词: 红曲菌 ；紫外诱变 ；显微观察 ；次生代谢产物
被引量
3
摘要： 红曲菌（Monascus spp.）是我国传统的食用和药用微生物,它能分泌产生色素、莫呐可啉类（monacolins）物质、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）等多种有益代谢产物,被广泛用于食品发酵剂、食品着色剂和保健食品的生产。红曲色素作为红曲菌的重要代谢产物,在我国有上千年的应用历史,主要用于肉制品和豆腐乳等的着色。现代研究表明,红曲色素属于复合色素,包括红色、橙色和黄色三大类,每一类色素中又包含多种组分。近年来,关于红曲色素组分的提取分离、结构分析和稳定性研究已经有很多报道,对红曲色素的功能研究也有一定的进展,但是对红曲色素各个组分功能的系统研究尚未见报道。
本实验通过TLC方法成功分离得了7种红色色素组分,4种黄色色素组分,2种橙色色素组分,然后对分离得到的红色组分1、红色组分2、橙色组分1、橙色组分2等4个组分以及红曲色素的初提物、总红色色素、总黄色色素和总橙色色素等4种主要色素混合物进行了抗氧化、抑菌和抗肿瘤等功能的研究。主要研究结果如下:
1.建立了红曲色素各组分的薄层色谱（TLC）分离方法。红曲红色色素和黄色色素以80%乙醇为提取剂,红色色素以甲苯:乙酸乙酯:甲酸=7:3:1（v/v）为展开剂,黄色色素以正己烷:乙酸乙酯:石油醚=30:17:5（v/v）为展开剂,可以对红色和黄色色素组分进行有效的分离。橙色色素以乙酸乙酯为提取剂,以正己烷:乙酸乙酯:石油醚=30:17:5（v/v）为展开剂,展开后将带有橙色色素的硅胶刮下,重新用乙酸乙酯提取,离心取上清浓缩后,再以甲苯:乙酸乙酯:甲酸=7:3:2（v/v）为展开剂,能够有效分离橙色色素各组分。
在上述条件下,成功得到了7种红色色素组分RP1～RP7,4种黄色色素组分YP1～YP4,2种橙色色素组分OP1～OP2。其中,RP1和RP2的含量较多,黄色色素各组分在总色素中含量较少,因此将提取纯化得到的主要红曲组分及其混合物作为后续实验的研究材料,它们分别是红曲色素初提物（PT）,总红色色素（RP）,总黄色色素（YP）,总橙色色素（OP）,红色组分1（RP1）,红色组分2（RP2）,橙色组分1（OP1）,橙色组分2（OP2）。
同时,采用HPLC方法对RP1、RP2、YP1、YP2、YP3、YP4、OP1、OP2的纯度进行了分析,结果表明,当色谱条件为色谱柱Kromasil C18（5μm,4.6 mm×250mm）、流动相为乙腈:水=75:25（v/v）、紫外检测波长λ=254 nm、进样量30μL、流速1 mL/min、柱温30℃时,色素各组分的HPLC图谱均只有一个峰,表明用TLC方法提取分离的色素组分的纯度较好。
2.研究了红曲组分及其混合物的抗氧化功能。采用·OH体系、O2·-体系和DPPH体系三种抗氧化模型,系统研究了PT、RP、YP、OP、RP1、RP2、OP1、OP2的抗氧化功能。结果表明,红曲红色色素组分和橙色色素组分都有很强的清除自由基能力,尤其是RP2,在40μg/mL的浓度下,对·OH的清除率达到32%,比同浓度的Vc约高20%;对DPPH的清除率达到64%,比同浓度的Vc约高41%。黄色色素组分表现出微弱的抗氧化功能。
3.研究了红曲组分及其混合物的抑菌功能。以金黄色葡萄球菌、李斯特菌、大肠杆菌、志贺菌和沙门菌等几种食品中常见的病原菌为研究对象,系统分析了PT、RP、YP、OP、RP1、RP2、OP1、OP2对其的抑菌功能。结果表明,橙色色素各组分对革兰氏阳性菌,如金黄色葡萄球菌、李斯特菌具有很好的抑制效果,并且在20μg/mL～100μg/mL的浓度范围内,随着浓度的增加抑制作用增强;对革兰氏阴性菌,如大肠杆菌、志贺菌和沙门菌有一定的抑制作用。在60μg/mL的浓度下,OP2对李斯特菌的抑制率为38.49%,对志贺菌的抑制率为15.66%。红色色素组分对革兰氏阳性菌也有一定的抑制作用,但是对革兰氏阴性菌的抑制效果不好。在60μg/mL的浓度下,RP2对李斯特菌的抑制率为34.37%,对志贺菌的抑制率仅为9.2%。黄色色素没有抑制作用。
4.研究了红曲组分及其混合物的体外抗肿瘤功能。以SP2/0、HepG2和Hela等3株肿瘤细胞为研究材料,系统分析了PT、RP、YP、OP、RP1、RP2、OP1、OP2对其的抗肿瘤作用。结果表明,红曲橙色色素尤其是OP2具有较好的抑制SP2/0、HepG2和Hela细胞的功能,在72 h内,在0.05μg/mL～100μg/mL的浓度范围内,随着时间的延长和色素浓度的增加,抑制效果增强。OP2在100μg/mL的浓度下,作用48 h,对Hela细胞的抑制率为36.84%,72 h抑制率为44.96%。红色色素对肿瘤细胞有一定的抑制作用,但是抑制率稍差于橙色色素。在100μg/mL的浓度下,作用72 h,RP2对Hela细胞的抑制率为32.83%,OP2抑制率为44.96%。黄色色素表现出微弱的抑制效果。
关键词: 红曲菌 ；TLC ；抗氧化 ；抑菌 ；抗肿瘤
被引量
58
摘要： 红曲霉（Monascus spp．）是我国传统的食用和药用微生物，在我国已有上千年的应用历史。它能分泌产生色素、莫呐可啉类（monacolins）物质、γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）、麦角固醇和丰富的水解酶类等多种有益代谢产物，是生产食品发酵剂、着色剂、保健食品、药品或其原料的重要微生物资源。目前，国内外对红曲霉菌种的分类、选育、代谢产物分离纯化及发酵条件的研究较多，而有关红曲霉的分子生物学研究才刚刚起步。GenBank检索结果查见，与红曲霉相关的核酸序列大部分是研究分类和亲缘关系的，有关功能基因的研究很少，而关于红曲霉产色素基因的研究尚未见报道。
近年来，利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导T-DNA转化真菌获得突变体的方法成为寻找和鉴定新基因的有效手段。本课题采用根癌农杆菌介导的T-DNA转化法建立了包含5100多株转化子的红曲霉转化子库，从转化子库中筛选得到了24株菌落颜色发生了明显变化的色素突变子，并对其菌落形态及显微结构、潮霉素抗性稳定性及主要代谢产物的分泌能力等进行了分析。在此基础上，采用TAIL-PCR分离到8株色素突变子T-DNA插入位点的左侧序列，并应用RACE技术克隆得到了一株色素突变子805#T-DNA插入位点的cDNA全长序列，采用基因敲除（gene knock-out）技术对其功能进行了验证。具体研究结果如下：
1转化子库的构建及色素突变株的筛选
通过优化农杆菌（A．tumefaciens）介导的T-DNA转化红曲霉的条件，构建了包含5100多个转化子的转化子库。T-DNA的PCR验证结果表明，随机挑选的60株转化子均含有T-DNA插入片段。24株随机挑选的转化子的Southern杂交结果表明，T-DNA单拷贝插入率为70.8％。通过对转化子菌落形态的观察，筛选得到53株形态发生明显变化的转化子，其中24株为菌落颜色发生显著变化的色素突变子，其编号分别为189#、192#、533#、635#、733#、805#、959#、1132#、1164#、1263#、1295#、2066#、2606#、2887#、3108#、3257#、3715#、3742#、4081#、4096#、4591#、4698#、4963#和4968#。色素突变子连续传代培养5代后，除733#、1132#、3715#和4591#外，其它20株色素突变子均能在潮霉素抗性培养基上稳定生长，潮霉素抗性稳定性达83.3％。
2色素突变子产红曲色素、monacolin K、GABA和桔霉素的分析
采用UV-VIS、TLC、HPLC等方法对上述20株潮霉素抗性稳定的色素突变子的固态发酵产物红曲的色素（包括色价、吸收波长、色素组分）、monacolin K、GABA和桔霉素的产生情况进行了分析。结果表明，与出发菌株相比，色素突变子产代谢产物的能力都发生了不同程度的变化。
在产色素方面，色素突变子959#的色价最高，达2 712，是出发菌株M-7色价1228的2.2倍；1263#的色价最低，仅为20，只有出发菌株M-7色价的0.01倍。另外，色素突变子红曲乙醇萃取液的UV-VIS扫描图谱和色素组分也发生了显著的变化。在产monacolin K方面，突变子4081#红曲的含量最高，达1601μg／g，而出发菌株M-7红曲的含量低于0.1μg／g。在产GABA方面，突变子1263#红曲含量最高，达6183.9μg／g，是出发菌株M-7 436.3μg／g的14.2倍；635#红曲的含量最低，只有156.1μg／g，约为出发菌株M-7的0.33倍。在产桔霉素方面，突变子635#红曲的含量最高，达154.57μg／g，是出发菌株0.75μg／g的206倍；1295#含量最低，为0.10gg／g，为出发菌株的0.1倍。
比较上述20株色素突变子产色素和桔霉素的情况，可将其分为4类：第一类，色价和桔霉素都升高的，包括635#、959#、1164#、2066#、2606#、2887#、4081#和4698#共8株；第二类，色价和桔霉素都降低的，包括805#、1295#、3742#和4968#共4株；第三类，色价降低而桔霉素含量升高的，包括189#、192#、1263#和4963#共4株；第四类，色价升高而桔霉素降低的，包括533#、3108#、3257#和4096#共4株。从上述四类突变子中挑选出635#、1164#、2606#、805#、1295#、189#、1263#、4963#、533#和3257#共10株代表性菌株，作为研究红曲霉产色素相关基因的材料。
3色素突变子T-DNA插入位点侧翼序列TAIL-PCR扩增及扩增片段功能分析
采用TAIL-PCR法对上述10株色素突变子T-DNA插入位点的侧翼序列进行了扩增，得到了635#、1164#、2606#、805#、3257#、189#、4963#和533#共8株突变子T-DNA插入位点左侧的DNA序列，扩增的DNA片段长度介于500 bp～1 300 bp之间。FASTA比对分析表明，805#突变子DNA扩增序列与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）Af293的G蛋白信号调节子（regulator for G-protein signaling，RGS）功能域的同源性达84％：其它7株突变子的T-DNA插入位点侧翼的DNA序列未发现有功能明确的相似性序列。突变子533#、1164#和2606#的DNA扩增片段已经登陆Genbank，登陆号分别为DQ861336、DQ861338和DQ1337。
4红曲霉G蛋白信号调节子的功能验证
以突变子805#扩增序列的Blast比对分析结果为依据，设计特异性引物，采用RACE技术，扩增得到了对应于该DNA序列的2012 bp的cDNA序列。ORFfin工具分析显示，其包含的最长开放读码框架（open reading frame，ORF）为1851bp，推衍得到包括了RGS和2个DEP（disheveled，Eg1+10，pleckstrin）3个结构域在内的氨基酸序列。以RGS结构域两侧的DNA序列为同源臂，采用基因敲除（gene knock-out）技术对其功能进行了初步研究。研究结果表明，805#突变子T-DNA插入位点的基因，即编码红曲霉FlbA（nuffy for brlA）的序列对红曲霉色素分泌具有正调节作用。
关键词: 红曲霉 ；农杆菌介导的T-DNA转化库 ；色素突变子 ；TAIL-PCR ；RACE ；flbA基因 ；基因敲除
被引量
22