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摘要： 目的 构建肺炎链球菌comD基因敲除突变株,了解comD基因与细菌β-内酰类抗生素耐药性的相关性,探讨氯氰碘柳胺下调comD、comE和comC基因mRNA的作用.方法 构建用于comD基因敲除的自杀质粒pEVP3comD,通过同源重组及插入失活获得肺炎链球菌ATCC6306株comD基因敲除突变株comD-.采用PCR及免疫荧光法对comD-突变株进行鉴定.采用实时荧光定量RT-PCR检测氯氰碘柳胺处理前后comD-突变株及野生株comD、comE和comC基因mRNA水平变化.采用二倍琼脂稀释法测定comD-突变株及野生株对青霉素G和头孢噻肟的敏感性.结果 测序及免疫荧光试验结果证实,所构建的comD-突变株染色体DNA中comD基因被插入失活.50μmol/L或100 μmol/L的氯氰碘柳胺能明显下调comD、comE和comC基因mRNA水平（P＜0.05）,25μmol/L的氯氰碘柳胺则否.comD-突变株对青霉素及头孢噻肟最低抑菌浓度（MIC）值均为32μg/ml,明显高于野生株的0.06 μg/ml和1 μg/ml.结论 本研究成功地构建了肺炎链球菌comD基因敲除突变株.comD基因与细菌对β-内酰类抗生素耐药性密切相关.氯氰碘柳胺可通过下调comD、comE和comC基因的转录水平,从而对细菌感受态形成产生影响.
关键词: 肺炎链球菌 ；ComD/ComE二元信号传导系统 ；β-内酰胺类抗生素 ；耐药性 ；氯氰碘柳胺 ；表达调控
被引量
3
摘要： 肺炎链球菌感染可引起细菌性肺炎、中耳炎和脑膜炎等疾病,临床上常采用β-内酰胺类抗生素、大环内酯类和喹诺酮类抗生素进行治疗。近年来,肺炎链球菌感染性疾病发病率不断升高,究其原因主要是耐药或多重耐药菌株日趋流行。肺炎链球菌不产β-内酰胺酶,该菌对β-内酰胺类抗生素耐药主要是青霉素结合蛋白(PBPs)突变,其次是与PBPs突变无关的调控感受态ComD/ComE二元信号传导系统(TCSS)以及调控细胞壁合成或完整性的CiaH/CiaR-TCSS和StkP-PhpP信号偶联相关基因突变。肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要是ErmB甲基化酶对药物作用的核糖体靶点甲基化修饰和MefA/E药物外排泵功能增强。肺炎链球菌对喹诺酮类抗生素的耐药机制是DNA回旋酶和/或拓扑异构酶Ⅳ中喹诺酮类耐药决定区域(QRDR)变异和药物外排作用增强。肺炎链球菌19F和19A血清型在中国优势流行且对多种抗生素耐药。
关键词: 肺炎链球菌 ；抗生素 ；耐药性
被引量
18
摘要： 目的：构建肺炎链球菌ciaH基因敲除（ΔciaH）突变株，了解肺炎链球菌二元信号系统CiaH／CiaR中ciaH基因与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性。方法采用PCR 扩增肺炎链球菌ATCC6306株ciaH基因片段，T-A克隆后测序。构建用于敲除ciaH基因的自杀质粒pEVP3ciaH ，CaCl2法将其转化入肺炎链球菌ATCC6306株，通过同源重组、插入失活及氯霉素筛选获得肺炎链球菌ATCC6306株ciaH基因敲除突变株ΔciaH。采用PCR、测序及激光共聚焦显微镜法对ΔciaH突变株进行鉴定。采用二倍琼脂稀释法测定并比较青霉素G（ PCN）或头孢噻肟（ CTX）对ΔciaH突变株和野生株最低抑菌浓度（ MIC）及其差异。采用实时荧光定量RT-PCR（ qRT-PCR）检测1／4 MIC PCN或CTX作用前后ciaH-mRNA水平变化。结果 PCR和测序结果显示，所构建的ΔciaH突变株染色体DNA中ciaH基因被插入失活；免疫荧光法检测结果显示，ΔciaH突变株不表达CiaH蛋白。 PCN和CTX对ΔciaH突变株MIC分别为32μg／ml 和64μg／ml，明显高于野生株的0．06μg／ml 和1μg／ml （ P＜0．01）。1／4 MIC PCN或CTX作用后，肺炎链球菌ciaH-mRNA水平显著升高（P＜0．01）。结论肺炎链球菌CiaH／CiaR二元信号系统中CiaH与其对β-内酰胺类抗生素耐药性有关。
关键词: 肺炎链球菌 ；二元信号传导系统 ；CiaH蛋白 ；β-内酰胺类抗生素 ；耐药性
被引量
6
摘要： 目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统(TCS)基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。建立肺炎链球菌comD基因敲除突变株,了解comD基因与细菌β-内酰类抗生素耐药性的相关性,探讨氯氰碘柳胺下调comD、comE和com(?)基因mRNA的作用。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。构建用于comD基因敲除的自杀质粒pEVP3comD,通过同源重组及插入失活获得肺炎链球菌ATCC6306株comD基因敲除突变株comD.采用PCR及免疫荧光法对comD突变株进行鉴定。采用实时荧光定量RT-PCR检测氯氰碘柳胺处理前后comD—突变株及野生株comD、comE和comC基因1nRNA水平变化。采用二倍琼脂稀释法测定comD—突变株及野生株对青霉素G和头孢噻肟的敏感性。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3 pET42a-comD、E.coli BL21DE3 pET42a-comE和E.coli BL21DE3 pET32a-comC(?)有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1：4、1：4和1：8。ComD和／或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。测序及免疫荧光试验结果证实,所构建的comD突变株染色体DNA中comD基因被插入失活。50μmol/L或100μmol/L的氯氰碘柳胺能明显下调comD、comE和com(?)基因mRNA水平(P＜0.05),25μmol/L的氯氰碘柳胺则否。comD突变株对青霉素及头孢噻肟MIC值均为32μg/mL,明显高于野生株的0.06和1μg/mL。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。成功地构建了肺炎链球菌comD基因敲除突变株。comD基因与细菌对p-内酰类抗生素耐药性密切相关。氯氰碘柳胺可通过下调comD, comE和com(?)基因的转录水平,从而对细菌感受态形成产生影响。
关键词: 肺炎链球菌 ；ComD/ComE二元信号传导系统 ；β-内酰胺类抗生素 ；耐药性 ；氯氰碘柳胺 ；表达调控
被引量
1
摘要： 背景：肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是人类细菌性肺炎、中耳炎和脑膜炎常见病原体。β-内酰胺类抗生素是临床治疗肺炎链球菌感染性疾病的一线药物，但近年来该菌对β-内酰胺类抗生素耐药率不断升高。β-内酰胺类抗生素能与细菌表面青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins，PBPs）共价结合，使细菌细胞壁合成受阻而导致裂解。早已证实，PBPs突变可使其与β-内酰胺类抗生素亲和力下降，从而出现对β-内酰胺类抗生素的耐药性。尔后发现，PBPs未突变肺炎链球菌也可对β-内酰胺类抗生素耐药，但机制不明。有文献报道，肺炎链球菌二元信号传导系统（two-component signaling system，TCSS）CiaH/CiaR与β-内酰胺类抗生素耐药相关，生物信息学预测结果显示肺炎链球菌有5个microRNA基因为 CiaR靶基因，并将该 microRNAs命名为 cia-依赖小 RNAs（cia-dependent small RNAs，csRNAs）。我们以往研究也发现，肺炎链球菌CiaH/CiaR-TCSS中的CiaH与β-内酰胺类抗生素耐药性有关。近年文献报道，细菌microRNAs也能在转录后水平调控基因表达。因此，CiaR有可能直接或通过csRNAs介导PBPs未突变肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药性。 目的：采用生物信息学软件预测肺炎链球菌5个microRNAs与pbps-mRNAs相互结合的序列或位点，为今后实验研究microRNAs与pbps-mRNAs之间相互作用的提供依据。了解青霉素（PCN）和头孢噻肟（CTX）对肺炎链球菌microRNAs与pbps-mRNAs表达的诱导作用。构建肺炎链球菌ciaR基因敲除突变株（ΔciaR），通过ΔciaR突变株和野生株比较，了解肺炎链球菌CiaH/CiaR二元信号传导系统中反应调节蛋白 CiaR对青霉素结合蛋白基因（pbps）和 cia-依赖小 RNA基因（csRNAs）表达的调控作用以及耐药性变化。 方法：采用RNA-RNA相互作用的专用分析软件IntaRNA（Interacting RNAs）预测肺炎链球菌csRNAs与pbps-mRNAs相互结合的序列或位点。构建用于敲除肺炎链球菌ciaR基因的自杀质粒pEVP3ciaR，通过自杀质粒同源交换、插入失活及氯霉素筛选获得ΔciaR突变株。采用PCR及其产物测序鉴定ΔciaR突变株。采用生长曲线测定法了解肺炎链球菌ΔciaR突变株及其野生株的生长情况并进行比较。采用E-test测定青霉素（PCN）和头孢噻肟（CTX）对肺炎链球菌ciaR突变株（ΔciaR）和野生菌株最低抑菌浓度（MIC）。采用实时荧光定量RT-PCR，检测ΔciaR突变株及其野生株1/4 MIC PCN或CTX作用前后pbps-mRNAs和csRNAs水平变化与差异。 结果：IntaRNA预测结果显示，肺炎链球菌csRNAs与pbps-mRNAs存在相互结合的序列或位点。肺炎链球菌ΔciaR突变株PCR及其产物测序结果证实，ΔciaR突变株中 ciaR基因被插入失活而敲除，但生长曲线测定结果显示，ciaR突变株及其野生株的ΔciaR突变株与野生株生长曲线基本一致。1/4 MIC PCN或CTX作用后，肺炎链球菌ΔciaR突变株pbps-mRNAs水平明显升高（P＜0.05）、csRNAs水平明显降低（ P＜0.05），但其野生株 pbps-mRNAs水平明显降低（P＜0.05）、csRNAs水平明显升高（P＜0.05）。E-test结果显示，PCN和CTX对ΔciaR突变株MIC均较野生株增加250倍。 结论：肺炎链球菌CiaR通过上调csRNAs表达在转录后水平抑制PBPs表达可能是该菌对PBPs突变无关PCN和CTX耐药性增强的机制之一。
关键词: 肺炎链球菌 ；基因表达 ；耐药性
摘要： 第一部分我国东部地区淋病奈瑟菌临床菌株porB基因分型与耐药相关性研究
背景：淋病奈瑟菌感染引起的淋病不仅是我国发病率最高的性传播性疾病(STD),也是严重的全球性公共卫生问题。淋病奈瑟菌多种外膜蛋白在细胞膜上形成孔道,又称孔蛋白(Porin, Por).其中PorB占细菌外膜蛋白总量的60%以上,根据PorB免疫原性的差异,可分为PorB1A和PorB1B两类,其氨基酸序列相似性为65%～80%。PorB1A和PorB1B由一个等位基因编码,故一株淋病奈瑟菌仅含有porB1A或porB1B等位基因中的一种。国外文献报告,分别有10%～30%和70%～90%淋病奈瑟菌临床菌株分别表达PorB1A或PorB1B。采用单克隆抗体均可将PorB1A或PorB1B分为若干血清型,其中porB1B基因遗传多样性和重组变异率明显高于porB1A基因,且不同地区优势流行的porB1A和porB1B基因型有明显差异。近年文献报道,PorB1B分子中第120和121位氨基酸残基G120D/K/R/P和/或A121D/H/P变异,与淋病奈瑟菌对青霉素和四环素耐药性增高相关,但PorB1A分子中第120和121位氨基酸替换突变与细菌对两种抗生素的耐药性关系不大,因此确定不同地区淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PorB编码基因变异程度及其优势基因型分布具有现实意义,但国内未有类似研究报道。
方法：采用纸片酸度定量法测定菌株的β-内酰胺酶,筛选出β-内酰胺酶检测结果阴性即不产青霉素酶淋病奈瑟菌临床菌株。以淋病奈瑟菌临床菌株porB全基因核苷酸序列测定为基础建立多重PCR(mPCR)用于对淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码等位基因porB分型,对倍稀释法检测淋病奈瑟菌临床菌株对青霉素和四环素的药物敏感性。
结果：315株临床菌株中检出porB1A基因型98株(31.1%)、porB1B基因型217株(68.9%)。98株porB1A基因型菌株血清型均为IA6, porB1A+菌株中88.8%不发生120和121位氨基酸突变,11.2%发生D120G突变,且所有98株菌株对青霉素和四环素均敏感。217株带有porB1B基因菌株中,分别有26.7%(58/217)、22.6%(49/217)和11.5%(25/217)属IB3、IB3/6和IB4血清型；有35.5%(77/217)5’端与IB3/6相似,3’端与IB2相似,属IB3/6-IB2嵌合血清型,且其中有15株第121和122位氨基酸缺失；另有3.7%(8/217)5’和3’端序列类似IB2血清型,中间序列类似IB4血清型。212株(97.7%)porB1B基因编码的氨基酸序列发生120和／或12l突变,其中163株(76.9%)为双突变。尤其是77株porB1B+IB3/6-IB2血清型临床菌株有15株发生A121和N122删除突变。上述所有发生突变的212株porB1B+菌株药敏试验结果对青霉素和四环素均呈现不同程度的耐药。
结论：我国东南部流行的淋病奈瑟菌主要携带porB1B基因,检出porB1B型菌株血清型有5型类型,以IB3/6-IB2嵌合、IB3和IB3/6血清型常见,IA6为porB1A型菌株优势血清型。淋病奈瑟菌临床菌株株携带的porB基因类型与青霉素和四环素耐药密切相关, porB1B型120和121位突变常见且与两种抗生素耐药密切相关。所建立的mPCR临床应用证明可用于淋病奈瑟菌porB1A和porB1B基因的分型,检测阳性率90%以上,分型准确率97.9%以上。
第二部分肺炎链球菌二元信号系统CiaR/H、Pkn2与β-内酰胺类抗生素耐药相关性研究
背景：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是人类肺炎主要病原体,也可引起脑膜炎、中耳炎等疾病。近年来,肺炎链球菌感染性疾病的发病率一直居高不下,全球每年死于肺炎链球菌感染的人数约为300-500万人。众所周知,β-内酰胺类抗生素是临床上治疗肺炎链球菌等革兰阳性菌感染性疾病的一线药物。业已肯定,肺炎链球菌对p-内酰胺类药物耐药性不断增强及耐药菌株广泛流行,是该菌所致疾病发病率不断升高的根本原因。肺炎链球菌对β-内酰胺耐药机制复杂,已有研究认为PBPs突变介导耐药,PBPs的本质是参与细菌细胞壁合成的转肽酶、羧肽酶和内肽酶类,肺炎链球菌有6种PBP。然而,有文献报道,除PBPs突变外,还有些与PBPs无关的基因也与肺炎链球菌β-内酰胺耐药相关,肺炎链球菌二元信号传导系统(TCSS) CiaH/CiaR也与β-内酰胺类抗生素耐药密切相关,ciaH基因突变菌株可出现高水平的耐药性。又2004年Echenique等发现,肺炎链球菌具有一种跨膜真核型丝氨酸／苏氨酸(Ser/Thr)激酶Pkn2,其磷酸化位点位于N端胞内区,C端胞外区含有PBP功能结构域(PBP-domain)、两者构成PBP-Ser/Thr激酶联合功能结构域(PASTA-domain).最近Dias等(2009)报告,Pkn2介导肺炎链球菌产生与PBPs突变无关的β-内酰胺类抗生素耐药性,但未研究其作用机制。
方法：采用PCR扩增全长ciaR、ciaH和pkn2基因,并建立其原核表达系统,SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rCiaR.rCiaH和rPkn2表达量。免疫家兔制备rCiaR、rCiaH和rPkn2抗血清及IgG。检测IgG胞外或胞内封闭肺炎链球菌菌株CiaH和CiaR后,细菌对青霉素和头孢噻肟耐药性的变化。构建用于ciaH和pkn2基因敲除的自杀质粒pEVP3ciaH和pEVP3pkn2,通过同源重组及插入失活获得肺炎链球菌ATCC6306株ciaH和pkn2基因敲除突变株ciaH-和pkn2-。采用PCR测序及免疫荧光法对ciaH-和pkn2突变株进行鉴定,"transformation test"测定野生株与ciaH-和pkn2-突变株进行感受态测定,实时荧光定量RT-PCR检测ciaH和pkn2基因敲除前后相关基因mRNA水平变化,用二倍琼脂稀释法测定菌株基因敲除前后对青霉素G或头孢噻肟MICs的变化,采用电泳迁移率检测(ESMA)确定CiaR-P调控的pbps等靶基因、p-内酰胺类抗生素信号激活CiaH/CiaR和Pkn2/PhpP通路及其介导的生物学效应差异。
结果：与报道序列比较,所克隆的ciaR、ciaH和pkn2基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%-100%和100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-ciaR、 E.coli BL21DE3pET42a-ciaH和E.coli BL21DE3pET32a-pkn2能有效表达目的重组蛋白rCiaR、rCiaH和rPkn2,其产量分别为细菌总蛋白的23%、28%和25%。rCiaR、 rCiaH和rPkn2抗血清免疫双扩散效价分别为1：4、1：4和1：8,IgG免疫双扩散效价都为1：1。CiaR和／或CiaH被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。PCR测序及免疫荧光试验结果证实,所构建的ciaH-和pkn2-突变株染色体DNA中ciaH和pkn2基因被插入失活。感受态测定结果野生株转化效率为0.08,而ciaH和stkP-突变株中转化效率为O。RT-PCR检测结果ciaH基因敲除突变株(ciaH-)的ciaR和pkn2mRNAs水平明显低于野生株(P<0.01),pkn2基因敲除突变株(pkn2-)的ciaH和ciaR mRNAs水平也明显低于野生株(P<0.01)；ciaH-突变株pbps mRNAs水平明显低于野生株(图3-4A),pkn2-突变株pbps mRNAs水平也明显低于野生株；0.001-0.004μg/mL青霉素或0.5-2.0μg/mL头孢噻肟37℃作用肺炎链球菌ATCC6306株30mmin后,ciaH和pkn2和几乎所有的pbps的mRNAs水平均较抗生素作用前明显下降(P<0.05)。ciaH-和stkP-突变株对青霉素及头孢噻肟MIC值分别为40μg/mL、50μg/mL和25μg/mL、30μg/mL明显高于野生株的0.06和1μg/mL。感受肽鉴定结果ciaH-和stkP-突变株转化效率为O。ESMA结果显示纯化的CiaR蛋白可以和pbp1a、pbp1b和pbp2b基因的启动子结合。
结论：肺炎链球菌二元信号系统CiaR/H和Pkn2参与p-内酰胺类抗生素耐药性调控。
关键词: 淋病奈瑟菌 ；porB基因 ；序列分析 ；多重PCR ；耐药 ；突变 ；肺炎链球菌 ；二元信号传导系统 ；β-内酰胺类抗生素 ；耐药性 ；表达调控