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摘要： 目的:活化的免疫细胞分泌的颗粒酶B(Granzyme B)可诱导急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)中靶细胞的凋亡。我们通过检索mi RNA数据库,鉴定出microRNA-874可以靶向Granzyme B。本研究通过测定急性心肌梗死患者及健康受试者血浆中Granzyme B和microRNA-874的表达水平,评价Granzyme B和microRNA-874在急性心肌梗死患者血浆中的变化趋势及相关性,判定Granzyme B和microRNA-874在急性心梗诊断及治疗中的潜在作用。方法:研究对象:选取80例AMI患者及40例健康受试者,AMI患者均来自2016年10月至2017年1月期间相继在吉林大学第二医院心血管内科住院的患者。我们通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)及实时聚合酶链式反应(q RT-PCR)分别测定AMI患者及健康受试者血浆中Granzyme B和microRNA-874的水平,并用Spearman相关性检验评估血浆Granzyme B与microRNA-874之间的关系。建立受试者工作特征曲线(ROC),以评估循环microRNA-874和Granzyme B对AMI患者的预测能力。ROC曲线下面积(AUC)被用来评估所选变量的预测能力和最佳截止点。结果:1、AMI患者血浆中的Granzyme B为16.71±7.23ng/ml,对照组血浆中的Granzyme B为9.27±3.90ng/ml,与对照组相比AMI患者血浆中Granzyme B水平显着升高(p<0.01)。2、对AMI患者和健康受试者中microRNA-874的血浆水平进行测定,结果显示,与对照组相比,AMI患者microRNA-874血浆水平明显降低(0.20±0.17倍)(P<0.01)。3、对急性心梗患者血浆中Granzyme B和microRNA-874行相关性分析。结果表明,microRNA-874与Granzyme B呈负相关(R=-0.237;p<0.05)。4、我们通过对Granzyme B和microRNA-874进行ROC分析,评价循环Granzyme B和microRNA-874对AMI的预测能力。结果显示Granzyme B的AUC为0.829(95%CI:0.749-0.909;p<0.01),最佳临界值为11.44,灵敏度和特异度分别为73.8%和70.0%,由于microRNA-874显著下降,我们使用1/microRNA-874预测AMI。microRNA-874的AUC为0.815(95%CI:0.743-0.892;p<0.01),最佳临界值为0.1576,灵敏度和特异度分别为80.0和70.9%。我们通过二元逻辑回归分析得出AMI的Granzyme B(优势比:1.304;95%CI:1.168-1.445;p<0.01)和microRNA-874(优势比:0.068;95%CI:0.022-0.209;p<0.01)的相似预后性质。结论:1、AMI患者血浆中的Granzyme B明显升高,microRNA-874明显降低,microRNA-874与Granzyme B呈负相关,说明microRNA-874可能靶向Granzyme B。2、血浆中microRNA-874与Granzyme B可以作为辅助诊断AMI的标志物。
关键词: 急性心肌梗死 ；颗粒酶B ；微小RNA-874 ；生物标志物 ；凋亡 ；炎症
被引量
2
摘要： 目的观察CD100、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、MMP9在冠心病患者中的变化,评估MMP2/9对T细胞中CD100的调控在冠心病发病中的作用。方法24例稳定性心绞痛(stable angina,SA)、22例不稳定性心绞痛(unstable angina,UA)、31例急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)和18例对照者入组本研究。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆可溶型CD100(sCD100)、MMP2、MMP9水平,流式细胞术检测T细胞中膜型CD100(mCD100)平均荧光强度(MFI)。分选CD4^(+)和CD8^(+)T细胞,使用CD100、MMP2/9和抗CD100抗体刺激,ELISA法检测上清中细胞因子水平,实时定量PCR法检测CD4^(+)T细胞中转录因子T-bet、GATA-3、FoxP3、RORγt和CD8^(+)T细胞中穿孔素、颗粒酶B mRNA相对表达量。结果AMI组血浆sCD100、MMP2、MMP9水平高于对照组、SA组和UA组,AMI组CD4^(+)和CD8^(+)T细胞中mCD100 MFI低于对照组、SA组和UA组(P<0.05)。CD100刺激后CD4^(+)T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-17、IL-22水平及T-bet、RORγt mRNA相对表达量升高(P<0.05)。CD100刺激后CD8^(+)T细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、IFN-γ水平及穿孔素、颗粒酶B mRNA相对表达量升高(P<0.05)。MMP2或MMP9单独刺激AMI患者CD4^(+)T细胞,上清sCD100、mCD100 MFI无明显变化,MMP2+MMP9联合刺激后,上清sCD100升高,mCD100 MFI降低,分泌IFN-γ、IL-17、IL-22水平及T-bet、RORγt mRNA相对表达量升高(P<0.05),加入抗CD100抗体后CD4^(+)T细胞中上述指标较联合刺激组降低(P<0.05)。MMP2、MMP9或MMP2+MMP9联合刺激AMI患者CD8^(+)T细胞,上清sCD100升高,mCD100 MFI降低,TNF-α、IFN-γ水平及穿孔素、颗粒酶B mRNA相对表达量升高(P<0.05),加入抗CD100抗体后CD8^(+)T细胞中上述指标较联合刺激组降低(P<0.05)。结论AMI患者中,高表达的MMP2/9促进T细胞mCD100脱落,上调sCD100水平,诱导T细胞活化。
关键词: 冠状动脉粥样硬化性心脏病 ；基质金属蛋白酶 ；CD100 ；T淋巴细胞
被引量
5
摘要： 第一部分急性心肌梗死患者血清外泌体miRNA筛选及生物信息学分析[目 的]急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是导致患者心源性死亡的首要原因,寻找AMI新的诊断标志物和治疗靶点一直以来都是临床医生关注的重点。既往研究发现,多种外泌体miRNA在AMI后表达升高,且可能与心梗后心室重塑相关,提示外泌体miRNA有潜力成为AMI诊断和预后评估的生物标志物。由于miRNA数量繁多,参与的调控网络比较复杂,因此,本部分研究旨在通过生物信息学方法筛选AMI患者血清外泌体miRNA及关键基因,为后续临床试验及机制研究提供依据。[方 法]1.查阅GEO数据库以及相关文献、论文,筛选AMI患者外泌体miRNA表达变化的相关数据,提取差异性表达的miRNA;2.结合miRNA数据库,对筛选出miRNA的靶基因进行预测,并进行GO和KEGG富集分析;3.选择表达上调的miRNA,结合文献,进一步缩小miRNA范围,对最终筛选出的miRNA进行靶基因预测,STRING软件对靶基因进行蛋白互作网络分析,结合分析结果筛选出关键基因;4.对最终筛选出的关键基因进行GO和KEGG富集分析,并采用Cytoscape软件建立miRNA与关键靶基因相互作用的网络图。[结 果]1.共纳入7个研究,提取出77个有表达差异的miRNA,其中32个miRNA表达上调,45个miRNA表达下调;2.通过数据库预测到77个miRNA共有12335个靶基因,共富集到2588条GO条目,主要富集在生长发育及信号传导等生物学过程,富集到150条KEGG通路,主要为内吞、MAPK、PI3K-Akt、Ras等信号通路;3.结合文献阅读,最终筛选出12个miRNA,依次为:miR-17-3p、miR-21-3p、miR-29a-3p、miR-30a-5p、miR-122-5p、miR-125a-5p、miR-126-3p、miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-150-5p、miR-199a-5p、miR-214-3p;4.共筛选出90个关键基因,富集到了 1571条GO条目,主要富集在细胞外基质和结构重构、正向调控细胞黏附等生物学过程,富集到154条KEGG通路,主要为黏着斑激酶、PI3K-Akt、MAPK、Toll样受体、TNF等信号通路。[结 论]生物信息学筛选出AMI患者外泌体内12个差异性表达的miRNA及90个关键基因,主要富集在细胞外基质重构等生物学过程,参与了 PI3K-Akt、MAPK、Toll样受体、TNF等信号通路。第二部分血清外泌体miR-146a-5p对急性冠脉综合征诊断和预后评估的价值研究[目 的]急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)是因冠状动脉不稳定斑块破裂,血栓部分或完全堵塞血管,从而引起急性缺血的一种临床综合征,而AMI是其最重要的临床分型。ACS早期诊断、及时治疗对降低其死亡率,改善远期预后至关重要。结合第一部分生物信息学筛选结果,我们在预实验中发现,AMI患者血浆miR-146a-5p表达水平显著高于冠脉正常组,在急诊介入手术治疗后血浆miR-146a-5p表达水平下降,72小时后逐渐上升,提示miR-146a-5p可能参与AMI发生发展。因此,本部分内容旨在探索血清外泌体miR-146a-5p(exo-miR-146a-5p)对ACS诊断和预后评估的价值。[方 法]1.收集入组患者血液样本及一般临床资料;2.提取患者血清中的外泌体(Exosomes),采用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质印迹法(Western Blot,WB)进行鉴定;3.采用实时荧光定 量 PCR(real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)观察血清 exo-miR-146a-5p 的表达水平;4.采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)观察入选患者血清白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素 6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平;5.通过受试者工作曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析血清exo-miR-146a-5p 对 ACS 的诊断价值;6.对ACS患者进行随访,记录一年内主要心血管不良事件(Major adverse cardiovascular events,MACE)的发生率,随访指标包括:心源性死亡、心力衰竭、再发心肌梗死、再次血运重建,并采用ROC曲线分析血清exo-miR-146a-5p对ACS预后评估的价值。[结 果]1.ACS组白细胞、肌钙蛋白I、N末端B型利钠肽原表达水平明显高于对照组(P<0.01),左室射血分数低于对照组(P<0.01),其余临床指标未见显著差异(P>0.05);2.透射电镜提示:镜下可见外泌体呈圆形或类圆形囊泡结构;纳米颗粒跟踪分析提示:提取样本中囊泡的平均直径为83.18 nm;WB提示:外泌体表达特征性蛋白(CD9、CD63、CD81 和 HSP70);3.ACS患者血清exo-miR-146a-5p表达水平明显高于对照组(P<0.01);4.ACS患者血清炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)表达水平明显高于对照组患者;5.血清exo-miR-146a-5p可用于诊断ACS,具有较高的敏感性(71.4%)和特异性(92%);6.ACS患者一年MACE发生率为17.5%;7.血清exo-miR-146a-5p对ACS患者MACE发生有较高的预测价值,敏感性和特异性分别为81.8%和75%。[结 论]血清exo-miR-146a-5p可作为ACS诊断和预后评估新的生物标志物。第三部分血清外泌体miR-146a-5p对H9C2心肌细胞缺氧复氧后炎症反应和细胞凋亡的影响[目 的]研究表明,外泌体miRNA参与了炎症反应、细胞迁移、增殖、凋亡等过程,在ACS、心肌缺血再灌注损伤中发挥着重要作用。本部分研究旨在探索血清exo-miR-146a-5p对H9C2心肌细胞缺氧复氧(H/R)后炎症反应和细胞凋亡的影响。[方 法]1.H9C2细胞经H/R处理后,分别采用RT-qPCR检测细胞miR-146a-5p的表达水平,CCK-8试剂盒检测H9C2细胞活力,ELISA检测培养基中炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的表达水平,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)和 TUNEL免疫荧光检测H9C2细胞凋亡水平;2.提取健康志愿者血清中的外泌体,采用miR-146a-5p模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)或阴性对照组(NC)对exo-miR-146a-5p表达水平进行改造,而后采用RT-qPCR检测exo-miR-146a-5p表达水平;3.荧光显微镜下观察血清外泌体被H9C2细胞摄取情况;4.将健康志愿者血清外泌体或改造后的外泌体与H9C2细胞进行共培养,经H/R诱导心肌细胞损伤,而后采用CCK-8试剂盒检测H9C2细胞活力;采用ELISA检测培养基中炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)表达水平;采用FCM、TUNEL免疫荧光检测H9C2细胞凋亡水平。[结 果]1.与正常培养细胞相比,H9C2细胞经H/R处理后miR-146a-5p表达水平明显下降、细胞活力减弱、炎症因子表达升高、细胞凋亡率显著增加(P<0.01);2.miR-146a-5p mimic或inhibitor转染至血清外泌体后,miR-146a-5p表达水平明显升高或降低(P<0.01);3.血清外泌体可被H9C2细胞摄取;4.与H/R组相比,外泌体组和miR-146a-5p mimics外泌体改造组对H9C2细胞H/R后损伤均具有保护作用,可增强细胞活力、减轻炎症反应、减少细胞凋亡(P<0.01),且miR-146a-5pmimics外泌体改造组效果更显著(P<0.01)。[结 论]血清exo-miR-146a-5p对H9C2细胞H/R损伤具有保护作用,其机制可能与减轻炎症反应和减少细胞凋亡有关。第四部分miR-146a-5p通过靶向IRAK1改善H9C2细胞H/R损伤的机制研究[目 的]第三部分研究发现血清exo-miR-146a-5p对H9C2细胞H/R损伤具有保护作用,但具体机制不清楚。生物信息学结果提示:IRAK1是exo-miR-146a-5p的关键靶基因,并可富集到NF-κB信号通路。因此,本部分研究将结合IRAK1和NF-κB信号通路,探索血清exo-miR-146a-5p改善H9C2细胞H/R损伤的分子机制。[方 法]1.使用数据库预测miR-146a-5p的靶基因,结合文献阅读及生物信息学结果,挑选关键靶基因进行后续研究;2.采用双荧光素酶基因报告实验验证miR-146a-5p与IRAK1的靶向关系;3.IRAK1过表达慢病毒转染H9C2细胞株,采用RT-qPCR及WB进行验证;4.将IRAK1过表达慢病毒(ov-IRAK1)或空载慢病毒(NC)与miR-146a-5p mimic 或 inhibitor共转染到H9C2细胞,经H/R处理后,RT-qPCR和WB分别检测TLR-4/IRAK1/TRAF6/NF-κB信号轴信使RNA(mRNA)和蛋白表达水平,WB检测细胞凋亡通路中的经典分子(Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax)的蛋白表达水平。[结 果]1.miR-146a-5p对IRAK1具有直接靶向作用;2.IRAK1过表达慢病毒(ov-IRAK1)可稳定转染至H9C2细胞,转染后,IRAK1 mRNA和蛋白水平均明显增高(P<0.01);3.各组TLR-4/IRAK1/TRAF6/NF-κB信号轴mRNA和蛋白表达情况:①各组TLR-4 mRNA和蛋白质表达水平未见明显差异(P>0.05);②与NC组相比,miR-146a-5p mimics组IRAK1 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.01),抑制NF-κB信号通路活化;miR-146a-5p inhibitor组则具有相反的生物学效应:③miR-146a-5p mimics 和 IRAK1 过表达慢病毒载体(mimics+ov-IRAK1 组)同时转染后,可逆转miR-146a-5p mimics对H9C2细胞H/R的保护效应;4.各组细胞凋亡通路中的经典分子(Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax)蛋白表达情况:①与 NC 组相比,miR-146a-5p mimics 组 Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达水平明显下降,Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.01);miR-146a-5p inhibitor组Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显升高,Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.01);②与mimics组相比,ov-IRAK1+mimics组Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.01)。[结 论]1.miR-146a-5p可通过靶向IRAK1基因,进而抑制NF-κB通路活化,减轻细胞炎症反应,从而改善H9C2细胞H/R后细胞损伤;2.miR-146a-5p可通过间接调控作用降低H9C2细胞H/R后细胞凋亡水平。
关键词: 急性冠脉综合征 ；诊断和预后 ；心肌保护 ；miR-146a-5p ；外泌体
被引量
1
摘要： 目的：冠状动脉疾病（Coronary artery disease,CAD）及其后续心血管事件仍是全球死亡的主要原因之一。其主要是由于血管内皮细胞的持续损伤导致内皮细胞活化和细胞凋亡，内皮功能障碍以及随后的动脉粥样硬化病变所致。急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠状动脉疾病的一种严重临床类型，是在动脉粥样硬化的基础上形成不稳定斑块，斑块破裂导致冠状动脉狭窄或完全梗阻，从而引起冠脉血流量急剧较少和心肌损伤。微小RNA（microRNAs,miRNAs）是短的非编码RNA，通过与其特定的信使RNA（message RNA，mRNA）靶向性结合并抑制其表达，从而介导转录后基因调节。最近的研究已经证明，miR以无细胞形式存在于人体循环中,可以在循环血液中检测到。本文目的是研究AMI患者梗死动脉处、穿刺桡动脉处血浆中的微小RNA含量是否不同，并与冠脉造影阴性患者的穿刺桡动脉处血浆中微小RNA进行比较，探究三个部位是否具有浓度梯度改变，并进一步探究梯度改变的原因及意义。 方法：将实验对象分为三组，即AMI病人梗死冠脉处、AMI病人穿刺桡动脉处和冠脉造影阴性病人穿刺桡动脉处。并从中各选3例血浆进行miRNAs微阵列分析，筛选目的miRNAs。并通过实时定量PCR（real-time PCR,RT-PCR）技术在30个AMI患者和18对照组中再次检测。培养人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells，HCAEC），并给与细胞氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）刺激探索梯度变化原因。使用细胞转染技术和蛋白免疫印迹（western blot，WB）方法研究目的微小RNA的功能及机制。 结果：1.在AMI患者梗死动脉处、穿刺桡动脉处和冠脉造影阴性患者穿刺桡动脉处存在梯度变化的微小RNA。 2.通过RT-PCR证明芯片结果，并挑选出目的miRNAs。 3.HCAEC在氧化型低密度脂蛋白环境下，细胞内外hsa-miR-29b-3p的表达水平下降。 4.上调人冠状动脉内皮细胞内hsa-miR-29b-3p的水平，细胞活力增强，ICAM-1和VCAM-1水平下降。 5.内皮细胞hsa-miR-29b-3p与AKT3呈现依赖关系。 结论：急性心肌梗死患者不同部位血浆中存在梯度改变的循环miRNAs。hsa-miR-29b-3p在AMI患者梗死动脉处表达下降，可能与ox-LDL刺激内皮细胞，导致释放减少有关。下降的hsa-miR-29b-3p可能通过AKT3，导致细胞活力下降，炎症细胞黏附能力增加，促进粥样硬化的进展。
关键词: 冠状动脉疾病 ；病理机制 ；微小核糖核酸 ；血浆浓度 ；梯度改变 ；急性心肌梗死
摘要： 目的:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是一种常见的心血管急危重症,致死率高,尽管对急性心肌梗死的诊治水平在不断提高,然而从2005年开始我国AMI死亡率一直呈现快速上升趋势,并且急性心肌梗死的发病机制仍然不明确。Micro-RNAs(miRNAs)是一类保守的短链非编码RNA,有一些miRNAs参与调控心血管疾病的发生发展,并且多种miRNAs之间存在着互相调控。有研究发现miR-503、miR-210可以参与调控血管生成以及细胞凋亡,从而可能在心血管系统发挥作用,并且两者之间可能存在一定的调控作用。本研究通过检测miR-503、miR-210在急性心肌梗死患者血浆中含量改变,评估miR-503及miR-210在急性心梗患者血浆中变化趋势及两者相关性,并分析miR-503和miR-210在急性心肌梗死患者中诊断及治疗的潜在作用。方法:选择64例急性心肌梗死患者和26例体检受试者,急性心肌梗死患者均来自2018年10月至2019年1月期间在吉林大学第二医院心血管内科住院的患者。我们通过实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)分别测定AMI患者及受试者血浆中miR-503和miR-210的水平,并用Spearman相关性检验评估血浆miR-503和miR-210之间的关系。结果:1、对急性心肌梗死患者和体检受试者血浆中miR-503以及miR-210的水平进行测定,结果显示,与对照组相比,急性心肌梗死患者血浆中miR-503(4.89±5.25倍)以及miR-210(6.30±8.14倍)水平升高,有显著的统计学意义(P<0.01)。2、在急性心肌梗死患者组中,有既往高血压病史的急性心肌梗死患者血浆中miR-503的含量(6.27±6.40倍)高于无高血压病史急性心肌梗死患者组(3.87±4.02倍),有统计学意义(P<0.05)。3、对急性心梗患者血浆中miR-503和miR-210行Spearman相关性分析。结果表明,miR-503与miR-210含量呈低度正相关(r=0.235,P<0.05)。结论:1、血浆中microRNA-503的表达量在急性心肌梗死后明显升高,在合并既往高血压病史的急性心肌梗死患者中microRNA-503的表达量升高更为显著。2、血浆中microRNA-210的表达量在急性心肌梗死后也明显升高,且与microRNA-503的表达量呈低度正相关。
关键词: 急性心肌梗死 ；microRNA-210 ；microRNA-503 ；血管生成 ；凋亡
摘要： 背景 在全球范围内，由于心血管危险因素的日益普遍，心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的发病率和死亡率处于持续上升阶段。研究表明，2020年全球约有1900万人死于CVD,比2010年增加了 18.7％。急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠状动脉血流中断，心脏组织持续性缺血缺氧所引起的急性心肌细胞缺血性坏死。随着疾病的不断发展，心肌梗死最终可进展为心力衰竭(heart failure,HF),严重威胁人类的健康和生命。目前，临床上经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)的发展为治疗AMI带来了前所未有的突破，但如何在心肌梗死后更多保留有效心脏组织、促进心脏损伤修复和改善预后仍是困扰心内科医师的重大问题。 MicroRNAs(miRNAs)是在动物、植物和一些病毒中发现的大小约为17-25个核苷酸的小型非编码RNA,参与基因表达的转录后调控。MiRNAs的生物调控受到严格的时间和空间控制，其在许多疾病中发挥着关键作用,尤其是在心肌氧化损伤、凋亡、心室肥厚、纤维化和心肌梗死等心血管疾病进展中有着重要意义。外泌体(exosomes)是一类直径约为30-150nm的细胞外囊泡，由脂质、蛋白质和编码或非编码RNA等生物活性分子组成，可进行细胞间的信息传递，从而交换遗传信息、重编程宿主细胞。血液来源的外泌体含量高，并广泛参与心血管疾病的发生、发展等病理生理过程，可作为miRNAs、蛋白质等生物分子的载体，进行细胞间信息传递。研究表明，循环中的miRNAs有助于细胞间通信，可靶向mRNAs调控生物体行为，是潜在的治疗因子。深入研究心肌缺血损伤这一病理条件下miRNAs的生物学效能，为心肌损伤修复和改善预后提供了一种新的视角。 第一部分 AMI恢复期血浆外泌体中miR-99b-5p表达显著上调 目的: 收集AMI恢复期患者及健康人的血浆，用ExoQuick-TC试剂盒提取外泌体,并对其进行表征鉴定;并通过外泌体miRNAs高通量测序以及H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化损伤模型的建立，明确起关键作用的因子。 方法: 1.透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)鉴定血浆外泌体的形态学，纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术分析血浆外泌体的粒径分布和浓度，Western blot检测血浆外泌体标记性蛋白的表达;2.采用高通量测序技术对Nor-Exo和AMI-Exo两组外泌体包含的miRNAs进行测序;建立H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤模型，在模型中根据测序结果对差异变化较大的miRNAs进行qRT-PCR验证，结合相关文献，从而初步确定发挥作用的关键分子。 结果: 1.经检测外泌体形态呈典型的囊泡状结构，粒径在50-150nm之间，并且高表达外泌体特异性标志蛋白。 2. miR-99b-5p在Nor-Exo和AMI-Exo两组循环外泌体中的表达具有显著差异,并且在AMI-Exo中表达显著上调;qRT-PCR显示miR-99b-5p在心肌细胞氧化损伤模型中差异最为显著。 结论: 本部分提取的血浆外泌体具有外泌体典型特征，且miR-99b-5p可能是AMI患者恢复期循环外泌体中起关键作用的因子。 第二部分 miR-99b-5p失调对心肌缺血损伤及修复的影响 目的: 在体外细胞实验中，进一步探究miR-99b-5p对心肌缺血损伤及修复的具体作用。 方法: 1.将关键miRNAinhibior及其阴性对照转染入H9c2心肌细胞中,后加入H2O2诱导心肌细胞氧化损伤，处理4h后用CCK-8法检测心肌细胞活力，Western blot及流式细胞术检测心肌细胞凋亡水平;2.将关键miRNA mimics及其阴性对照转染入H9c2心肌细胞中，后加入H2O2诱导心肌细胞氧化损伤，处理4h后用CCK-8法检测心肌细胞活力，Western blot及流式细胞术检测心肌细胞凋亡水平。 结果: 1.与阴性对照相比，向心肌细胞中转染miR-99b-5p inhibitor,可在H2O2处理条件下降低细胞活力、增加细胞凋亡。 2. 与阴性对照相比，向心肌细胞中转染miR-99b-5p mimics,可在H2O2处理条件下增强细胞活力、减少细胞凋亡。 结论: MiR-99b-5p可减轻H2O2诱导的心肌细胞（H9c2）氧化损伤，增强心肌细胞抗凋亡能力。 第三部分 miR-99b-5p调控靶基因mTOR在心肌细胞凋亡中的作用研究 目的: 对miR-99b-5p的靶基因进行预测，并进行靶向验证;探讨miR-99b-5p对心肌细胞凋亡的靶向调控作用。 方法: 1.使用miRNAs靶基因数据库TargetScan、miRDB和microRNA对miR-99b-5p的靶基因进行预测。根据预测结果并结合相关文献，选取候选靶基因mTOR;2. 利用Western blot及双荧光素酶报告基因实验对miR-99b-5p与mTOR的靶向关系进行验证;3. 将靶基因过表达质粒pcDNA3.1-mTOR或空载对照质粒pcDNA3.1与miR-99b-5p mimics或其阴性对照mimics-NC共转染到H9c2心肌细胞中，然后H2O2诱导细胞氧化损伤。4h后用Western blot检测mTOR的蛋白表达水平，CCK-8法检测心肌细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡水平。 结果: 1、MiR-99b-5p直接靶向 mTOR;2、在H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤模型中，过表达mTOR逆转了同时转染miR-99b-5p mimics对心肌的保护作用。 结论: MiR-99b-5p通过靶向抑制mTOR减少了心肌细胞的凋亡，对心肌氧化损伤有保护作用。
关键词: 急性心肌梗死 ；心肌氧化损伤 ；微小RNA-99b-5p ；雷帕霉素靶蛋白 ；细胞凋亡
摘要： 研究背景动脉粥样硬化(AS)斑块破裂继发血栓形成是引发急性心血管事件的主要病理基础,直接影响本病的疗效及预后。AS斑块内血管新生与斑块失稳密切相关,抑制斑块内血管新生已成为稳定斑块的治疗策略之一。本课题组在继承陈可冀院士“活血化瘀”学术思想基础上,结合现代研究结果,提出AS病变过程中“因瘀而血气不通”,“因瘀而气机郁遏成毒”,因此破血逐瘀是解决瘀毒互结的关键。莪术奥酮二醇(Zedoarondiol)是从破血逐瘀中药莪术中提取的单体成分,前期研究结果证实Zedoarondiol在保护内皮细胞功能、抑制平滑肌细胞异常增殖、减轻斑块内炎症负荷方面作用确切。然而Zedoarondiol能否调控内皮细胞血管新生,稳定AS斑块,目前尚无报道。现有研究中发现,外泌体在AS细胞间信号传导途径中发挥重要作用,可通过递送microRNA调控斑块内血管新生。本文的研究目的,旨在前期研究成果的基础上,进一步验证Zedoarondiol干预外泌体与内皮细胞之间串扰机制,明确Zedoarondiol抑制AS斑块血管新生效应。因此,我们提出Zedoarondiol调节外泌体microRNA这一关键机制。本文从临床、动物、细胞三个方面展开研究,首先通过小样本临床对照研究,探索外泌体miR-let-7a与急性心肌梗死之间相关性;其次利用高脂饲养ApoE-/-鼠建立AS模型,观察Zedoarondiol抑制斑块内血管新生作用,以及对外泌体miR-let-7a及其下游蛋白的影响;最后通过血小板体外活化实验及管腔生成实验验证Zedoarondiol调控血小板外泌体(Pexo)介导的miR-let-7a抑制血管新生的分子机理。研究一外泌体microRNA与急性心肌梗死相关性临床研究目的:基于临床样本,探索外泌体miR-let-7a与急性心肌梗死间的相关性。方法:从中国中医科学院西苑医院和中国中医科学院望京医院招募急性心肌梗死患者(MI组)和健康志愿者(健康组)各15人,收集其人口学资料、病史信息,检查血常规、心肌酶检测、血生化以及凝血检测。超速离心法提取两组人员血浆外泌体并检测外泌体内血管新生相关基因miR-let-7a,miR-210和miR-126,探索影响AS斑稳定性的关键外泌体microRNA。结果:与健康组比较,MI组中血浆外泌体miR-let-7a水平升高(P<0.05),miR-210以及miR-126无明显变化(P>0.05),血浆中促血管生成因子VEGF和MMP-9表达水平上调(P<0.01),APTT缩短、血小板活化相关因子CD62P和5-TH水平提高(P<0.01);两组间cGMP无明显差异(P>0.05)。结论:MI组患者血浆外泌体miR-let-7a水平升高,促血管新生蛋白水平上调,血小板活化水平增加。外泌体介导的miR-let-7a可能是调节AS斑块稳定性的关键基因。研究二Zedoarondiol对ApoE-/-小鼠斑块内血管新生的影响目的:探讨Zedoarondiol对小鼠AS斑块内血管新生的影响,并通过外泌体miR-let-7a/THBS-1途径探讨其相关机制。方法:ApoE-/-小鼠随机分为4组持续高脂饮食饲养建立AS模型,model组:等体积生理盐水,ZEL 组:Zedoarondiol 5mg/kg/d,ZEH 组:Zedoarondiol 10mg/kg/d,atorvastatin组:阿托伐他汀钙10mg/kg/d,同时以C57BL/6J小鼠为control组:等体积生理盐水。小鼠给药与高脂饲养同时进行,持续14周。全长主动脉以及主动脉根部切片进行油红O染色,观察斑块生成情况。免疫组化染色检测斑块内新生血管密度。蛋白免疫印迹(WB)检测主动脉内血管新生有关蛋白THBS-1、CD36、VEGF以及CD34表达情况。生化法检测血脂水平。Elisa检测血浆TNF-α、MMP-9、LDL以及HDL含量。qPCR检测外泌体miR-let-7a水平。流式细胞技术检测血小板活化率。结果:14周后与control组比较,model组全长主动脉及主动脉根部有明显斑块生成,小鼠主动脉根部斑块内新生血管密度明显增加(P<0.01),主动脉组织中抗血管新生蛋白THBS-1及其受体CD36含量下降(P<0.01),促血管新生蛋白VEGF水平升高(P<0.01),血浆中TG、TC、LDL、TNF-α以及MMP-9浓度增加(P<0.01),HDL水平下调(P<0.01),血小板活化率及外泌体衍生的miR-let-7a水平上升(P<0.01)。与model组相比,Zedoarondiol干预后,ZEH组小鼠主动脉根部斑块面积比减小(P<0.05),斑块内新生血管密度下降(P<0.01),主动脉中 THBS-1、CD36 表达量增加(P<0.01,P<0.05),VEGF 减少(P<0.01,P<0.05),血浆中TC、LDL、TNF-α以及MMP-9浓度下降(P<0.05),而TG以及HDL水平无明显变化(P>0.05),小鼠血小板活化率及血浆外泌体miR-let-7a水平下降(P<0.01)。结论:Zedoarondiol抑制AS小鼠主动脉斑块生成,减少斑块内血管新生,上调主动脉组织中血管新生抑制蛋白THBS-1,下调血管新生促进蛋白VEGF,降低血浆TC、LDL、MMP-9和TNF-α浓度,同时抑制小鼠体内血小板活化并降低血浆外泌体miR-let-7a水平。表明Zedoarondiol抗血管新生作用与调控外泌体miR-let-7a和血小板活化相关。研究三Zedoarondiol调控Pexo衍生的miR-let-7a影响内皮细胞管腔生成的体外研究目的:观察Zedoarondiol抑制血小板体外活化、下调PexomiR-let-7a水平的效应。并通过Pexo/miR-let-7a/THBS-1信号途径,探讨Zedoarondiol抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管新生的机制。方法:(1)血小板体外活化实验:获取健康志愿者血小板,分为rest组、model组和Zedoarondiol组。rest组:等体积PBS孵育,不加激活剂;Zedoarondiol组:Zedoarondiol 15μg/mL 孵育 10min 后加入 ADP 激活;model 组:等体积 PBS 孵育10min后加入ADP激活。干预结束后用多聚甲醛固定血小板,采用FITC-CD61和PE-CD62P标记血小板,流式细胞仪检测血小板活化率。qPCR检测各组Pexo中 miR-let-7a 水平。(2)细胞转染:HUVEC 转染 miR-let-7a minics 建立 miR-let-7a过表达细胞模型,并以无效的NC转染作为阴性对照,qPCR及WB验证转染模型。(3)HUVEC管腔生成实验:转染成功后用富含miR-let-7a的Pexo干预,细胞分组:HU 组:正常 HUVEC,HU+Pexo 组:正常 HUVEC+Pexo 100μg/mL,HU+Pexo+minics组:转染 miR-let-7a minics的 HUVEC+Pexo 100μg/mL,HU+Pexo+NC组:转染NC的HUVEC+Pexo 100μg/mL,24h后收集各组细胞进行管腔生成实验观察其成管能力。实验结束后qPCR检测细胞中miR-let-7a以及THBS-1 mRNA 水平,WB 检测 THBS-1、CD36 水平。结果:(1)血小板活化实验中,与rest组比较,model组血小板活化率以及Pexo 衍生的 miR-let-7a 水平均升高(P<0.01);相较于 model 组,Zedoarondiol 干预后血小板活化率降低(P<0.01)且Pexo miR-let-7a减少(P<0.01)。(2)细胞转染实验中,与正常HUVEC相比,miR-let-7a minics转染后细胞中miR-let-7a表达量升高、THBS-1蛋白含量下降(P<0.01,P<0.05),而NC转染的细胞较之无显著差异(P>0.05),表明成功建立miR-let-7a过表达细胞模型。(3)管腔生成实验中,与HU组比较,HU+Pexo组和HU+Pexo+NC组中管腔长度增加(P<0.01),miR-let-7a 水平升高(P<0.01),THBS-1 mRNA 降低(P<0.01),THBS-1 和 CD36蛋白表达量下降(P<0.01,P<0.05),HU+Pexo组和HU+Pexo+NC组无明显差异(P>0.05),与HU+Pexo组相比,HU+Pexo+minics组中各项指标较进一步改变(P<0.05)。结论:Zedoarondiol可抑制血小板体外活化,下调PexomiR-let-7a水平。Pexo miR-let-7a能够抑制THBS-1 mRNA表达,促进HUVEC管腔生成。表明Zedoarondiol可通过抑制血小板活化,下调Pexo miR-let-7a水平,减轻其对THBS-1 mRNA的干扰,促进THBS-1蛋白表达,从而抑制血管新生。
关键词: 莪术奥酮二醇 ；动脉粥样硬化 ；血管新生 ；血小板外泌体 ；miR-let-7a
被引量
2
摘要： 下尿路症状(LUTS)是一种常见的泌尿系统疾病,其患病率随着年龄的增长而增加。传统认为,男性LUTS通常被认为是良性前列腺增大而引起的膀胱出口梗阻,后来发现在许多病例中,男性的LUTS与膀胱出口梗阻无关。越来越多的证据表明慢性膀胱缺血在男性和女性的非梗阻性膀胱功能障碍和下尿路症状的发生发展中起着重要作用。然而,慢性缺血引发的LUTS和膀胱功能障碍的分子机制尚未完全清楚。蛋白质是生命活动的执行者和体现者,蛋白组学技术能直接从蛋白的整体水平反应蛋白质的动态变化。通常情况下,蛋白质是根据基因组编码序列直接翻译确定的。然而,由于翻译后修饰,氨基酸替换以及RNA编辑等原因,许多氨基酸残基往往会发生改变,它们的相对分子质量不同于基因组中的编码氨基酸,从而改变了蛋白质的结构与功能,这类氨基酸我们称之为非编码氨基酸(ncAAs)。近年来,许多缺血再灌注损伤相关疾病与蛋白质翻译后修饰密切相关,探究膀胱缺血的分子机制有望从蛋白质翻译后修饰水平上开辟新的道路。本文运用了基于质谱的蛋白质组学相关技术,研究大鼠慢性膀胱缺血中非编码氨基酸的差异,进一步阐明了慢性膀胱缺血可能的发病机制,为人类下尿路症状的早期诊断和药物靶向治疗提供了理论依据。研究目的:探讨慢性膀胱缺血对膀胱蛋白质组中非编码氨基酸的变化以及缺血相关修饰蛋白信号通路的特征。研究方法:本研究随机选取三对雄性大鼠进行双侧髂动脉阻塞模拟动脉粥样硬化和慢性膀胱缺血,8周后称取膀胱组织并进行胶内酶解,利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)反复测定获得高质量的质谱数据。通过Byonic软件进行相关的匹配计算得到所有非编码氨基酸信息,利用PANTHER、STRING和DAVID数据库进行生物信息学的分析。最后通过缺血性疾病患者的血液样本进行质谱分析,验证缺血相关蛋白修饰的差异,为找到人类下尿路症状临床诊断和治疗的分子标志物提供理论基础。实验结果:1.大鼠慢性膀胱缺血对不同类型蛋白质修饰的影响根据定义,实际蛋白质氨基酸残基的质量与标准编码氨基酸的质量不同的氨基酸残基为非编码氨基酸,这些非编码氨基酸可能是由基因组点突变、RNA编辑、翻译后修饰甚至还可能存在其他机制。在大鼠慢性膀胱缺血组织中,这些氨基酸上的非零质量差改变大部分稳定地发生在缺血和对照组织中,表明在大鼠膀胱蛋白质组中存在系统发生的非编码氨基酸。这些大量非编码氨基酸(13039)存在于1549个不同的蛋白质位点并分为52种修饰聚类簇。其中,70个蛋白质的171个修饰位点上调或下调2倍以上(p<0.05),这些蛋白称之为缺血相关蛋白。在缺血组织中,有17个修饰聚类簇发生显著性失调(R2>0.2,ratio>2倍,p<0.05),被认为是潜在的缺血相关蛋白修饰。在这些修饰中,根据它们质量差大小通过相关数据库分析得出其中9个与氨基酸的替换有关。提示这些ncAA的改变可能与缺血密切相关。2.缺血相关蛋白的生物信息学分析通过对缺血相关修饰蛋白的PANTHER功能注释,这些差异修饰所涉及的蛋白质主要有细胞骨架蛋白、结合蛋白和具有催化功能酶类。STRING预测了上调或下调相关修饰蛋白的相互作用网络图。DAVID分析相关蛋白参与的信号通路表明,这些缺血相关蛋白主要参与了血浆血红素的清除,平滑肌收缩,HSF1依赖的反式激活,血小板胞浆Ca2+升高对血小板脱颗粒反应,四氢生物蝶呤的合成、回收和调节等通路。其中一些通路中的蛋白非编码氨基酸的改变可能在缺血过程中具有重要的作用。3.缺血过程中上调和下调最多的非编码氨基酸经统计分析,在慢性膀胱缺血中共有148个蛋白质修饰位点发生下调,其中下调倍数变化最多的为分子量增加14.017 Da的修饰。Val+14.017修饰在慢性膀胱缺血中下调9倍,且主要发生在血清白蛋白的431位点。对于膀胱缺血上调修饰中,上调倍数最明显的蛋白质修饰是在血红蛋白21位点,分子量增加为26.022 Da,根据它们改变的质量差推断发生了Ala>Pro替换。4.慢性膀胱缺血中发生修饰种类最多的蛋白质在慢性膀胱缺血过程中发现了大量的非编码氨基酸,它们分布于366个不同的蛋白质中,血清白蛋白是发生频率最多的差异修饰蛋白。在白蛋白中发现了30种不同的ncAAs,存在于12种不同类型的非零质量差且发生在26个蛋白质位点上,其中发生的许多修饰都与白蛋白的氧化有关。5.人类缺血性疾病中缺血相关修饰蛋白验证为了验证大鼠慢性膀胱缺血中白蛋白相关的氧化修饰是否同样存在于其他缺血模型中。本文各选取了三名急性心肌梗死患者与健康人的血液进行了质谱分析。通过对固定修饰进行搜索,比较了在血清中白蛋白谷胱甘肽化修饰变化。我们的数据表明,在人急性心肌梗死疾病中同样发生了在白蛋白591位点谷胱甘肽修饰的上调(ratio>2,p<0.05),表明了该位点的谷胱甘肽修饰变化与缺血再灌注损伤有关。结论:本研究中首次发现了大量未报道的大鼠慢性膀胱缺血非编码氨基酸,膀胱蛋白修饰谱在缺血时的改变可能会提供新的线索来了解潜在的分子通路。因此,本文对于了解人下尿路症状发病机制以及靶向药物的治疗具有重要的意义。
关键词: 慢性膀胱缺血 ；蛋白质组学 ；翻译后修饰 ；非编码氨基酸 ；质谱分析
摘要： 脂肪异位过度沉积是糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy,DCM）发生的主要病因。糖尿病能导致多种并发症,其中在心血管系统常会引起发DCM,这也是糖尿病引起病患死亡的关键因素之一。时至今日,对于DCM的发生发展机理尚未研究透彻,有研究表明脂毒性、糖代谢紊乱、OS、心肌钙化、线粒体功能障碍以及心肌功能变化等都是导致DCM发生的因素。脂毒性心肌损伤常引起严重的心肌功能不全,影响心肌的正常收缩功能,严重危害患者的生命健康。调节脂质代谢平衡,改善心功能,成为预防治疗DCM的重要手段。脂毒性是由于人体外周血中FFA含量增加,超过机体正常利用范围,引起FFA在肝脏、肌肉等组织中以TG模式过量累积,损伤组织器官。长期处于高脂环境中的机体,其脂质以及中间产物积累过剩,会导致机体细胞功能障碍、代谢异常以及相关病理改变。心肌内过多的脂质累积,激发ERS,引起OS,使得心肌细胞大量凋亡,最终对心肌功能产生了很大的影响。脂代谢紊乱可激发OS和线粒体功能异常,从而使得机体心脏结构和机能发生异常,如导致心肌肥大、心肌梗死,乃至心力衰竭及死亡。由此可知,脂毒性心肌损伤在DCM的病程进展中起到至关重要的作用。众人熟知的青蒿素是中药青蒿的提取物,青蒿素及其衍生物对多种原因所致心律失常、心肌缺血及动脉粥样硬化及斑块稳定性等均有较好的治疗作用。活化NF-κB途径能够增加TF、MMP以及CF的表达,进而促使炎症以及纤维化发生,最终引发左室重构;研究发现,青篙素可以抑制NF-κB通路以减轻心肌重构。青蒿素类药物抗心律失常机制是通过对离子通道的阻断、对心肌细胞间连接蛋白表达的促进等实现的,青蒿素类药物抑制动脉粥样硬化的作用主要体现在抵抗炎症和抗氧化以及抑制血管内皮细胞运动分裂和抑制巨噬细胞表型转化等方面。青蒿素在对抗脂毒性引起的心脏、肾脏和肝脏等重要器官的并发症方面亦疗效显著。其能够抑制炎性反应从而保护胰岛β细胞,提高其存活率,改善胰岛素抵抗,诱导胰岛α细胞转化为β细胞,减轻肾脏和心脏纤维化进程,降低尿蛋白排出。microRNAs是一类在真核生物中被发现一类呈现类似发夹结构的短链非编码RNA,具有转录调控功能,这类短链非编码RNA具有分布广泛的特点,能通过调控多种多样的靶基因而发挥生物学作用。已有报道表明microRNAs不仅仅能够参与到心脏发育过程中,而且在心血管类疾病发生过程中亦扮演着十分重要的角色。伴随着日渐增高的心血管疾病发病率及病死率,miRNA对心血管疾病发生的病理生理调控机制也成为热点研究。miRNA-133b参与多个生理过程的调控,包括心肌细胞对抗缺氧和梗死。研究报道miRNA-133b能够抑制心肌成纤维细胞的活化增殖,在急性心肌梗死患者循环血浆中表达水平也显著增高。但关于miR-133b在心肌脂毒性损伤中的作用研究却未见报道。本研究以心肌细胞HHHM2为研究对象,通过PAL诱导心肌脂毒性损伤细胞模型,通过转染miR-133b inhibitor处理,采用MTT分析法和实时荧光定量PCR分析miR-133b在PAL诱导的心肌脂毒性损伤中的作用。通过双荧光素报告实验,揭示Sirt1是否为miR-133b的靶向基因,通过Westernblot分析miR-133b对HHHM2细胞中沉默信息转录调控因子1表达量的影响,构建Sirt1过表达质粒（pcDNA3.1-Sirt1）,并将过表达质粒与miR-133b mimic或inhibitor单独或同时转染心肌细胞,通过挽救实验验证miR-133b是否通过调控Sirt1发挥着PAL处理后心肌细胞损伤的作用。利用DHA挽救PAL处理后心肌细胞,MTT观察细胞活力变化,qRT-PCR检测miR-133b的表达,应用qRT-PCR检测DHA改善（减轻）PAL处理后心肌细胞凋亡因子的转录水平,采用荧光素酶报告基因系统进行检测DHA通过影响miR-133b调控Sirt1的转录。主要目的是研究microRNA-133b（miR-133b）在心肌细胞脂毒性环境中的作用,并探究其下游分子机制,以及双氢青蒿素通过调控MiR-133b保护心肌细胞的作用机制,为肥胖、高血脂及DCM的诊治提供新的策略。第一部分 miRNA-133b在PAL诱导的心肌脂毒性损伤中的作用目的:建立体外高脂刺激模型,探讨PAL对HHHM2心肌细胞的毒性机制及在PAL诱导的脂毒性心肌损伤中miRNA-133b的作用。方法:1、体外培养心肌细胞HHHM2,应用棕榈酸盐诱导建立体外高脂刺激模型（Lipid toxicity）,MTT(3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)分析法检测抑制miR-133b前后心肌细胞在PAL处理后对细胞活力的影响。。2、qRT-PCR 检测 Caspase3、Bax、Bcl-2 以及 miR-133b 在正常心肌细胞与 PAL处理后心肌细胞与中的表达差异。3、Western blot实验探究PAL处理后心肌细胞中的Caspase3、Bax和Bcl-2与正常心肌细胞中的表达差异性。4、实时荧光定量PCR分析转染miR-133b inhibitor前后miR-133b在高脂刺激模型细胞内的表达差异。结果:1、心肌细胞HHHM2能够成功进行体外培养,MTT结果显示,PAL处理24h后,心肌细胞活力较正常细胞显著下降（p<0.05）,PAL处理72h后,心肌细胞活力下降显著（p<0.01）。2、qRT-PCR检测显示,PAL处理12h后,Caspase 3的表达水平较正常对照组显著上升（p<0.05）;PAL 孵育48h后,Caspase3蛋白表达水平上升极显著（p<0.01）;Bcl-2含量未见显著差异（p>0.05）;Bax在PAL处理12h后表达量显著提升（p<0.05）,在48h提升更显著（p<0.01）。3、Western blot方法检测结果显示,Caspase3表达在PAL处理后12h略有升高（p<0.05）,24h开始急剧上升（p<0.001）,并且持续增加到72h（p<0.001）。Bax的表达与Caspase3类似,也随着PAL处理时间的增加而升高。Bcl-2含量在PAL孵育前期（12h）其表达量显著增加,并随着时间的延长而逐步降低。4、利用实时荧光定量PCR分析经PAL处理的心肌细胞中miR-133b的表达变化,结果显示,经PAL处理后,心肌细胞中miR-133b的表达明显上升。与对照组比较,PAL处理6h后,miR-133b的表达水平略有上升（p>0.05）,经PAL处理12h和24h后,miR-133b的表达水平显著上升,分别上升了 60%和80%（p<0.05,p<0.01）;在PAL处理48h时显著升高（p<0.01）,处理72h后,miR-133b表达开始下降,但仍显著高于对照组（p<0.01）。5、miR-133b inhibitor转染心肌细胞后,孵育PAL,随后用qRT-PCR检测,结果表明:转染miR-133b inhibitor的心肌细胞组中miR-133b的表达水平较Scramble组和Blank组显著下降（p<0.001）;表达miR-133b inhibitor心肌细胞在PAL孵育后,细胞中miR-133b的表达水平显著低于对照组（p<0.001）,其表达水平下降了约50%。6、MTT实验检测的结果发现,Blank组以及Scramble组细胞活力与对照组相比显著降低（p<0.01）,miR-133b inhibitor转染组中的心肌细胞活力较对照组心肌细胞也显著下降（p<0.05）;但同Blank组以及Scramble组比较,miR-133b inhibitor转染组的细胞活力显著上升（p<0.05）。结论:心肌细胞HHHM2经PAL处理能够抑制的增殖,导致细胞凋亡相关基因及蛋白表达量的增加,从而促进细胞凋亡。PAL刺激可以诱导心肌细胞中miR-133b表达增加,抑制miR-133b表达可以减轻PAL诱导的心肌细胞脂毒性损伤。第二部分 miR-133b调控心肌脂毒性损伤的机制研究目的:探讨miR-133b调控心肌脂毒性损伤的机制方法:1、课题组使用在线版本软件（网址:http://www.targetscan.org/）搜索及分析miR-133b可能存在的候选靶基因集合。2、开展双荧光素酶报告基因系统（Luciferase）来验证miR-133b序列调控靶基因Sirt1（Sirtuin 1）的转录活性。3、蛋白免疫印迹法检测miR-133b分子影响心肌细胞中Sirt1蛋白的表达水平。4、构建Sirt1过表达质粒（pcDNA3.1-Sirt1）,并将过表达质粒与miR-133b mimic或inhibitor单独或同时转染心肌细胞,通过挽救实验观察miR-133b是否通过调控Sirt1发挥PAL处理后保护心肌细胞的生物学作用。结果:1、在线版本软件（网址:http://www.targetscan.org）筛查出Sirt1是miR-133b的候选靶基因之一。2、双荧光素酶活性数据显示,在转染过miR-133b mimic并囊括了 Sirt1基因的3'UTR（Wild type-野生型）荧光素酶质粒组中读取的相对荧光素酶活性数值显著低于对照组（p<0.01）,表明miR-133b能够作用在Sirt1 3'-UTR的预测靶位点上。3、蛋白免疫印迹实验结果显示,跟对照组（Scramble组）相比较,Sirt1蛋白含量在miR-133b mimic转染组中显著降低（p<0.01）,提示过表达miR-133b抑制了 Sirt1蛋白的表达。4、实时荧光PCR检测转染Sirt1质粒后各组细胞中的其mRNA表达水平,结果提示,对比空载体（Backbonevector）转染对照组（pcDNA3.1组）,转染pcDNA3.1-Sirt1（过表达组）的心肌细胞中Sirt1表达含量显著升高（p<0.01）;然而,pcDNA3.1-Sirt1+miR-133b mimic转染组（抑制组）的Sirt1表达显著低于pcDNA3.1-Sirt1过表达组（p<0.01）,但与空载体转染组（Backbonevector）无显著差异（p>0.05）。同样,转染pcDNA3.1-Sirt1后Sirt1表达显著升高,而同时加入miR-133b后其表达量下降。5、MTT法检测PAL诱导后细胞活力的变化,结果显示细胞活力在pcDNA3.1-Sirt1转染组显著高于空载体对照组（pcDNA3.1组）(p<0.01),而在miR-133b mimic+pcDNA3.1-Sirt1转染组显著低于pcDNA3.1-Sirt1转染组（p<0.01）,与空载体对照组（Backbone vector组）对比未见显著差异（p>0.05）。结论:miR-133b抑制了 Sirt1对心肌细胞的保护,Sirt1是miR-133b的靶基因,PAL处理后的心肌细胞由于miR-133b对Sirt1的调控作用发生损伤。第三部分 DHA调控MiR-133b保护心肌细胞的作用机制研究目的:探索DHA调控miR-133b保全心肌细胞的作用机制。方法:1、应用MTT法观察DHA对PAL处理后心肌细胞活力的影响,qRT-PCR检测miR-133b的表达变化。2、应用qRT-PCR检测DHA对PAL处理后心肌细胞凋亡因子转录水平的作用。3、采用荧光素酶报告基因系统检测DHA是否通过影响miR-133b调控Sirt1的转录。结果:1、心肌细胞接种后,待其汇合率达到80%,加入浓度为0.5mM的PAL作为PAL组。DHA组在PAL处理的同时,加入终浓度为10μM的DHA,随后在处理12h、24h、48h及72h进行检测,其细胞存活率在12h并未检测到差异,而DHA组在24h略有升高,但未能检测到显著差异。48h时DHA组细胞存活率显著高于PAL组（p<0.05）,这种差异显著性在72h进一步增加（p<0.01）。2、与模型组比较,DHA显著提升了心肌细胞的存活率,
关键词: 棕榈酸 ；miR-133b ；心肌细胞脂毒性 ；miR-133b ；双氢青蒿素 ；调控 ；保护作用
摘要： 背景:人口老龄化导致心血管疾病(CVD)死亡率快速增加,使之成为危害人类健康的最主要疾病。冠心病(CHD)急性心肌梗死(AMI)又是心血管疾病中最常见和最易致死的疾病之一。心电图和心肌损伤标志物是诊断急性心肌梗死最重要的两项特异性检查和指标之一,尽管临床已有这些心肌梗死的敏感诊断手段,但基础与临床研究仍未停止探索更简便有效的诊断冠心病新手段的脚步,如一些血浆microRNA和长链非编码RNA(lncRNA)可能为心肌梗死的损伤标志物。研究表明长链非编码RNA可以调节多种心血管疾病的病理过程,包括冠状动脉粥样硬化、急性心肌梗死、心力衰竭和先天性心脏病等。INK4位点反义非编码RNA(ANRIL)和钾离子电压门控通道亚家族q成员1重叠转录1(KCNQ1OT1)是新发现的长链非编码RNA成员之一。已有基础研究提示,ANRIL和KCNQ1OT1可能与冠心病和急性心肌梗死疾病有一定相关性,但在人体方面的研究仍处于起步阶段,因此,推测ANRIL和KCNQ1OT1与冠心病及急性心肌梗死疾病可能有一定相关性,血清ANRIL和KCNQ1OT1水平变化可能在冠心病及急性心肌梗死患者的识别和诊断中具有重要意义。目的:本研究旨在探讨外周血ANRIL和KCNQ1OT1的表达水平与冠心病急性心肌梗死的关系,从而为冠心病的发病机制和诊治提供提供新的可能思路与策略。方法:按照本研究的纳入标准和排除标准收集2019年06月至2019年12月期间在遵义医科大学附属医院心内科住院的124例患者的血标本,包括男性75例,女性49例,平均年龄(58.12±9.4)岁。所有纳入者根据临床诊断分为CHD组(n=70)70例和非CHD组(n=54),CHD组进一步分为急性心肌梗死(AMI)组(n=33)、不稳定型心绞痛(UA)组(n=37)。入院后24小时内在行冠状动脉造影术时采集患者桡动脉血3～5mL,采用EDTA抗凝,分离血清中的总RNA,采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测各样本ANRIL和KCNQ1OT1表达水平。收集所有纳入的超敏肌钙蛋白T(TNT-hs)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、脂蛋白a等指标的实验室检查结果。所有数据采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。结果:1.CHD组、AMI组的CK、CK-MB、TNT-hs水平显著高于非CHD组,差异有统计学意义(P<0.05)。AMI组的CK、CK-MB、TNT-hs水平显著高于UA组,差异有统计学意义(P<0.05)。UA组的CK水平与非CHD组比较稍降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。UA组的CK-MB、TNT-hs水平与非CHD组比较差异无统计学意义。CHD组、UA组、AMI组的性别、年龄、吸烟史、高血压病史、糖尿病史、心率、收缩压、舒张压、TG、TC、HDL-C、LDL-C、脂蛋白a与非CHD组比较差异也无统计学意义。2.与非CHD组比较,CHD组的KCNQ1OT1表达水平显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);与非CHD组比较,而CHD组的ANRIL表达水平明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。与非CHD组比较,KCNQ1OT1在UA组、AMI组患者血清中的表达水平均显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。与非CHD组比较,AMI组血清中ANRIL的表达水平明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);与UA组比较,AMI组血清中ANRIL的表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.血清中KCNQ1OT1的表达水平与CK-MB(r=0.3693)、TNT-hs(r=0.3473)呈正相关,差异有统计学意义(P<0.05),而ANRIL与CK-MB、TNT-hs相关分析差异无统计学意义。4.预测KCNQ1OT1对CHD及AMI的诊断价值,对于CHD,KCNQ1OT1的ROC曲线下面积为0.749(95%置信区间:0.639～0.838,P<0.05),截断点位置敏感度和特异度分别为61.2%、86.5%;而对于AMI,ROC曲线下面积0.880(95%置信区间:0.803～0.957,P<0.05),截断点位置敏感度和特异度分别为73.1%、88.5%。联合KCNQ1OT1和TNT-hs对CHD和AMI的诊断价值进行预测,结果显示,对于CHD,ROC曲线下面积、敏感度、特异度和95%置信区间分别为0.843、84.8%、81.4%、(95%置信区间:0.773～0.913,P<0.05);而对于AMI而言,ROC曲线下面积、敏感度、特异度和95%置信区间分别为0.986、97%、95.3%、(95%置信区间:0.968～0.996,P<0.05)。ANRIL对CHD和AMI诊断的ROC曲线面积都低于0.5,提示对CHD及AMI两者诊断无明显意义。结论:1.CHD和AMI患者血清中KCNQ1OT1的表达水平明显高于非CHD组,CHD组和AMI组的ANRIL表达水平明显低于非CHD组,KCNQ1OT1和ANRIL可能为CHD或AMI的生物标志物。2.KCNQ1OT1用于诊断CHD和AMI有一定价值,联合多项生物标志物可能会增加CHD、AMI诊断效率。
关键词: 心血管疾病 ；冠心病 ；急性心肌梗死 ；ANRIL ；KCNQ1OT1
被引量
2
摘要： 目的:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是目前世界范围内致死率及致残率很高的一种疾病,早期快速的诊断急性心肌梗死对改善患者症状及预后至关重要。目前临床上常用的心梗标志物如肌钙蛋白(c Tn)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等仍存在一定不足,容易受其他疾病(心衰、炎症、恶病质、周围器官梗死等)的干扰。Micro-RNAs(mi R-RNAs mi RNAs)是一类保守的短链非编码RNA,其中一些参与调控心血管疾病的发生发展,特点是稳定、易测,可作为潜在的心梗标志物。研究发现mi R-542-5p通过参与氧化应激、心肌细胞的衰老及重塑,从而可能在心血管系统发挥作用,同时基因芯片研究发现mi R-542-5p在心梗患者中表达升高,但无相关实验进一步支持。我们通过实验检测mi R-542-5p是否可作为预测急性心肌梗死的标志物。同时进一步研究mi R-542-5p在急性心梗中潜在作用,我们通过基因检测发现mi R-542-5p特异性靶向调控热休克蛋白B7(HSPB7),HSPB7为心血管系统特异性蛋白。有研究发现HSPB7在急性心梗发作时表达升高并发挥心肌保护作用。本实验通过测定急性心肌梗死及健康受试者外周血浆中mi R-542-5p及HSPB7水平变化,评估mi R-542-5p及HSPB7在急性心梗患者血浆中变化趋势及两者相关性,并分析mi R-542-5p和HSPB7在急性心肌梗死患者中诊断及治疗的潜在作用。方法:选择77例AMI患者和47例健康体检受试者,AMI患者均来自2017年10月至2018年1月期间在吉林大学第二医院心血管内科住院的患者。我们通过实时聚合酶链式反应(q RT-PCR)及酶联免疫吸附测定法(Elisa)分别测定AMI患者及健康受试者血浆中mi R-542-5p和HSPB7的水平,并用Spearman相关性检验评估血浆mi R-542-5p和HSPB7之间的关系。建立受试者工作特征曲线(ROC),以评估循环mi R-542-5p和HSPB7对AMI患者的预测能力。ROC曲线下面积(AUC)被用来评估所选变量的预测能力和最佳截止点。结果:1、对AMI患者和健康受试者中mi R-542-5p的外周血浆水平进行测定,结果显示,与对照组相比,AMI患者mi R-542-5p血浆水平明显升高(13.05±12.33倍)(P<0.01)。2、AMI患者血浆中的HSPB7浓度为76.80±40.99ng/ml,健康对照组血浆中的HSPB7浓度为60.97±37.08ng/ml,与对照组相比AMI患者血浆中HSPB7水平升高,P<0.05,有统计学意义。3、对急性心梗患者血浆中mi R-542-5p和HSPB7行Spearman相关性分析。结果表明,mi R-542-5p与HSPB7呈正相关(r=0.237,P<0.01)。4、我们通过对mi R-542-5p和HSPB7进行ROC分析,评价循环mi R-542-5p和HSPB7对AMI的预测能力。结果显示mi R-542-5p的AUC为0.935(95%CI:0.895-0.975;P<0.01),最佳临界值为1.755,灵敏度和特异度分别为89.6%和83.0%;我们使用HSPB7预测AMI,HSPB7的AUC为0.615(95%CI:0.514-0.716;P<0.05),最佳临界值为52.453,灵敏度和特异度分别为63.6%和51.1%。5、进一步分析mi R-542-5p在AMI组不同时间段表达改变并与对照组对比,结果显示:心梗发作4小时以内表达改变明显高于对照组,P<0.05,差异具有统计学意义,同时4-6、6-24、>24小时组结果与对照组相比差异明显,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:1、AMI患者血浆中的mi R-542-5p明显升高,HSPB7与对照组相比升高,有统计学意义,mi R-542-5p与HSPB7表达呈正相关。2、血浆中mi R-542-5p可以作为辅助诊断AMI的标志物。
关键词: 急性心肌梗死 ；微小RNA-542-5p ；热休克蛋白B7 ；生物标志物
摘要： 急性心肌梗死是指因冠状动脉出现急性阻塞，心脏肌肉因缺乏血液供应出现坏死，使得心脏功能受损的一种可能危及生命的急性病症。microRNAs对于心血管疾病的发展起到了至关重要的作用，包括心肌再灌注损伤，它们还参与了心肌细胞的分化、生长、凋亡、纤维化以及血管再生。目前miR-135a-5p在急性心肌梗死中的报道较少，猜测miR-135a-5p可能作为诊断及治疗的靶点。因此提出本研究科学假说miR-135a-5p可能通过ATG14调控自噬在急性心肌梗死发病机制中起保护作用。 第一部分血浆中miR-135a-5p水平变化与冠脉病变严重程度相关性研究 目的：以AMI(AcuteMyocardialinfarction，急性心肌梗死)患者为研究对象，观察健康对照组及心梗组PCI（PercutaneousCoronaryIntervention，经皮冠状动脉介入治疗）术前血浆miR-135a-5p的表达水平情况，探讨血浆miR-135a-5p水平与AMI患者血浆指标、冠脉病变严重程度、Killip分级的关系。 方法：在2021年6月到2022年12月期间，收集了69例急性心肌梗死患者和45例健康人的血清样本，并对其基本临床资料进行了分析。同时还收集了心梗组患者PCI术前的静脉血，以及健康对照组人群的空腹静脉血。使用qPCR（QuantitativeReal-timePCR，实时荧光定量PCR）检测来比较两组血浆miR-135a-5p表达水平的差异，并与临床基线数据进行了比较。使用GeneCarD和UCSC技术，可以查询miR-135a-5p基因的位置和亚细胞表达情况，并确定它们的表达种类。根据血管病变的程度，将患者分为对照组、单组、双组和多组，并比较四组血浆miR-135a-5p水平的差异。同时将患者血浆miR-135a-5p表达的中位数分为两组：一组表达水平较高（n=36）和一组表达水平较低（n=33）。通过比较miR-135a-5p高表达组与低表达组的冠脉Gensini评分，以探究差异。同样将患者根据Killip分级分为四组，比较四组间的血浆miR-135a-5p水平的差异情况。通过Spearman分析探究心梗组miR-135a-5p表达水平与Killip分级、Gensini评分、冠脉血管病变支数进行相关性分析。 结果：与对照组相比，心梗组病人血浆miR-135a-5p相对表达水平明显降低（p＜0.05）。心梗组患者血浆miR-135a-5p表达情况与Killip分级、冠脉病变支数、Gensini评分相关，心梗患者血浆miR-135a-5p表达水平越低，Killip分级越高（p＜0.001）、冠脉病变支数越多（p＜0.05）、冠脉Gensini评分越高（p＜0.05）。 小结：与对照组相比较，心梗组病人血浆miR-135a-5p相对表达水平较对照组明显降低;且心梗组病人血浆中miR-135a-5p相对表达水平愈低，冠脉动脉病变支数愈多、Killip分级越高，冠脉Gensini评分越高。 第二部分miR-135a-5p及ATG14在急性心肌梗死大鼠心肌组织中表达变化及其潜在作用的研究 目的：通过生物信息技术Targetscan筛选出miR-135a-5p下游靶蛋白ATG14;通过构建大鼠心梗模型组和假手术组，两组对照观察miR-135a-5p、ATG14及自噬相关蛋白在梗死心肌组织中的表达情况，初步探究其可能的分子机制。 方法：通过Targetscan生信技术筛选出miR-135a-5p下游靶蛋白ATG14。在8周龄的15只SPF级别的雄性SD大鼠中，随机地将它们分成了两组：一组是心梗组（n=9），另一组是假手术组（n=6）。心梗组大鼠接受接受麻醉、开胸、结扎冠状动脉左前降支，而假手术组接受麻醉、开胸、穿线不结扎，术前术后开展心电图检查。于术后第4周取心梗组大鼠心脏组织完善TTC染色检测梗死面积（n=3），同时完善假手术组、心梗组大鼠心脏超声心动图，之后灌流取材后TTC染色整体心脏拍照检测心肌梗死面积、qPCR检测心脏组织miR-135a-5p表达水平、HE染色检测心肌细胞形态结构、Masson染色检测心肌组织胶原纤维水平、免疫细胞荧光检测ATG14的表达、Westernblot检测心肌梗死区域的蛋白ATG14及自噬相关蛋白表达水平，透视电镜下观察自噬小体数量。 结果：与术前心电图相比，心梗组大鼠术后心电图Ⅱ导联ST段上抬明显，术后第4周心梗组大鼠（n=3）TTC染色梗死面积增加（p＜0.05），综合心脏彩超、TTC染色结果，大鼠心肌梗死模型建造成功。与假手术组大鼠对比，心梗组术后心脏功能减退（p＜0.05），梗死区域纤维增生明显，miR-135a-5p表达水平下降（p＜0.05），蛋白ATG14及自噬相关蛋白表达水平增加（p＜0.05），透视电镜下观察自噬小体数目增多。 小结：与假手术组大鼠相比，心梗组大鼠心肌梗死区域miR-135a-5p表达水平降低、蛋白ATG14及自噬相关蛋白表达水平增加，透视电镜下观察自噬小体数目增多，提示自噬水平提升。可能是miR-135a-5p通过ATG14调控自噬相关蛋白表达水平参与了心肌梗死的自噬过程。 结论： miR-135a-5p在急性心肌梗死患者血浆中水平显著降低，在急性心肌梗死大鼠梗死区域心肌组织中其表达下降，预测的下游靶蛋白ATG14表达上调，心肌细胞自噬水平提高，提示miR-135a-5p可能参与急性心肌梗死后的心肌细胞损伤。
关键词: 急性心肌梗死 ；miR-135a-5p ；经皮冠状动脉介入治疗
摘要： 细胞凋亡在急性心肌梗死后的左心室重构中发挥重要作用。颗粒酶B是丝氨酸酯酶家族的一个成员，在细胞凋亡和细胞外基质降解中具有重要作用。日本自治医科大学的Kondo等的研究发现，急性心肌梗死患者血浆颗粒酶B水平升高，并可能在晚期左室重构中起重要作用。研究结果全文刊登在3月的Circ J上。
关键词: 急性心肌梗死后 ；颗粒酶B ；患者血浆 ；细胞外基质降解 ；水 ；细胞凋亡 ；左心室重构 ；医科大学
摘要： 研究背景随着中国社会经济的快速发展,国民生活方式发生了巨大的改变。特别是人口老龄化及城镇化进程不断加快,急性心肌梗死发病的危险因素逐渐凸显,导致了我国心血管病的发病人数呈逐年上升趋势。根据《2016年中国卫生和计划生育统计年鉴》,从2005年开始,急性心肌梗死(AMI)死亡率呈现快速上升趋势,给国民经济带来严重负担,有较高的死亡率和致残率。据统计在2015年其医疗费用达到了 153.40亿元,给患者、家庭和社会造成了巨大的经济负担,已成为影响我国经济发展的重大的公共卫生问题,AMI的防治已刻不容缓。急性心肌梗死的基本病因为动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As),粥样斑块造成管腔严重狭窄和心肌血供不足,而侧支循环未充分建立,在此基础上,一旦血供进一步急剧减少或中断,使心肌严重而持久地急性缺血达半小时以上即可发生心肌梗死。血管内皮功能损伤是动脉粥样硬化发生的关键因素和始动环节。内皮细胞不仅是血液与组织间进行物质交换的屏障,而且也是机体最大的内分泌器官,它通过产生生物活性物质,来维持正常的血管壁通透性,血管的功能状态,纤溶活性及炎症反应。当内皮细胞的正常代谢发生改变可导致血管的损伤。内皮细胞微颗粒(Endothelial Microparticles,EMPs)是指血管内皮细胞在受到各种物理、化学因素刺激后引起的胞膜以出芽形成的直径约0.05-1.0μm的超微小泡。近年来大量研究表明,内皮细胞微颗粒参与炎症反应、凝血、细胞增殖、凋亡、血管再生等多个病理生理过程。EMPs参与心血管事件的发生、发展,主要与其促炎、促凝、加重血管内皮功能障碍作用有关。EMPs通过以下三个方面影响血管的收缩和舒张功能。1)、减少NO生成、降低NO利用度、增加紧张性血管活性物质的表达来影响血管收缩及舒张功能。据文献报道,代谢综合征患者的血液的EMPs能够降低NO及O2-的产生,从而影响血管收缩及舒张功能。2)、促进内皮细胞相关蛋白的硝基化。BoulangerCM等通过对急性心肌梗死模型的小鼠的血管内皮微颗粒发现其引起血管收缩作用并非减少NO生成或者增加NO降解,而是通过影响NO生物利用率来减少NO的作用,这可能与微颗粒促进血管内皮上NO受体硝基化,减少其与NO相结合,从而减轻NO的舒血管作用。另外也有研究发现,EMPs通过eNOS/caveolin-1的途径抑制内皮依赖性血管舒张。另外,淋巴源性EMPs还可通过抑制黄嘌呤氧化酶受体途径增加血液中活性氧的生成而减少NO的利用度。此外淋巴细胞源性的微颗粒不仅能够减少NO利用度,还可通过降低前列环素降利用率,进而导致血管呈持续低反应性。3)、上调紧张性血管活性物质。一般在某种病理状态下,内皮细胞在能够将花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA)传递给细胞微颗粒,由其分解生成血栓素A2(Thromboxane,TXA2),可引起血管强烈收缩。内皮细胞微颗粒区别于其他微颗粒的主要标志是其膜表面镶嵌的特异性糖蛋白,而这种糖蛋白主要来源于其原细胞。在正常状态下,细胞表面是没有或者仅仅含有少量的粘附蛋白,但是在病理状态下,细胞受到刺激发生崩解时,其表面的粘附蛋白水平也明显上升,最终脱落微颗粒包含有特定的标志蛋白。近年来大量研究表明,内皮细胞微颗粒与冠心病、呼吸睡眠暂停综合征、高血压、肾病综合症、强直性脊柱炎等多种疾病相关。Fan等人研究发现,在糖尿病、高脂血症、冠心病、癌症、代谢综合征患者的血液中EMPs显著升高。Abbas M等研究认为,不同表型EMPs在不同疾病中所参与的功能不一样。在以往的研究中运用炎症因子(如补体、脂质过氧化物和TNF-α)等对体外培养的内皮细胞进行刺激发现,活化的内皮细胞能够释放为CD62E(+)的EMPs,而应用丝裂霉素C来诱导内皮细胞凋亡后产生的内皮细胞表面表达为CD31(+)EMPs,因此认为不同类型的刺激可引起的内皮细胞释放不同类型的微颗粒。一般而言,CD31(+)EMPs被认为内皮细胞凋亡的产物,可作为内皮损害的标志物。Bernal-Mizrachi等在急性冠脉综合征患者中发现,在冠心病患者外周血中的CD31(+)EMPs明显高于健康人,急性心肌梗死患者外周血中CD31(+)EMPs明显高于不稳定型心绞痛患者,不稳定型绞痛患者的CD31(+)EMPs水平明显高于稳定型心绞痛患者,故认为CD31(+)EMPs有可能是导致斑块不稳定重要因素,提示CD31(+)EMPs与冠心病严重程度密切相关,并认为CD31(+)EMPs可以作为冠心病高危患者血管事件发生率的独立预测因子。C-反应蛋白(CRP)是炎症敏感指标,作为炎症过程中最具标志性的因子,近年来已成为研究热点。Thomas A等指出高敏C-反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)是最佳的炎症标志物,是预测心血管疾病最有力的因子。血浆中的CRP浓度无显著的时间及季节周期性变化,健康个体昼夜无显著的差异,不受饮食影响,故任何时间CRP测定值均有临床参考价值。动脉粥样硬化斑块的炎症反应是斑块破裂和不稳定的重要原因。Biasucci等认为在动脉粥样硬化斑块的形成过程中,CRP和泡沫细胞等沉积在动脉壁内,其中CRP可与脂蛋白结合,激活补体系统,产生大量炎症介质,释放氧自由基,造成血管内膜损伤、血管痉挛及不稳定斑块脱落,加重动脉粥样硬化所致的管腔狭窄以及心肌梗死的发生。因此,CRP是急性心肌梗死的重要标记物。然而有文献报道,冠状动脉轻中度狭窄患者CRP水平要高于重度狭窄患者,冠脉次全闭塞患者CRP水平比前两者低。因此认为CRP与冠脉狭窄程度无明显相关性,可能的原因:1.因为这些炎症指标反应的是整个全身动脉硬化的情况,不能反应冠状动脉病变严重程度;2.CRP可能与慢性的稳定的动脉粥样硬化到不稳定状态(UA、AMI)转变有关;3.引起心肌细胞缺血、缺氧、甚至坏死的病理生理机制除了动脉粥样硬化以外,还包括冠脉痉挛及冠脉微循环病变。目前急性心肌梗死冠脉病变严重程度和hs-CRP、CD31(+)/CD42(-)EMPs计数的相关研究未见有报道。既往文献中多采用Genesini积分来作为评估冠脉病变程度的指标,而使用TIMI血流分级作为评估急性心肌梗死冠脉病变程度的指标,探讨与外周血中CD31(+)/CD42(-)EMPs、hs-CRP水平变化规律亦未见有报道。CD31(+)/CD42(-)EMPs、hs-CRP与急性心肌梗死冠脉病变严重程度是否存在相关性需我们进一步明确及深入研究。研究目的为了解急性心肌梗死患者的内皮细胞是否参与疾病的发生与发展中,观察急性心肌梗死患者冠脉病变与内皮细胞微颗粒(CD31(+)/CD42(-)EMPs)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)的水平变化趋势,以明确急性心肌梗死患者冠脉病变与内皮细胞微颗粒(CD31(+)/CD42(-)EMPs)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)的关系,观察CD31(+)/CD42(-)EMPs、hs-CRP与疾病严重程度是否相关,是否能够通过对内皮细胞微颗粒检测来评估患者急性心肌梗死冠脉病变和病情的严重程度,以及进行危险分层,为临床提供理论支持。研究对象在知情同意及自由的原则下,前瞻性纳入我院心血管介入中心从2014年9月至2016年11月收治的160例12小时内初次发病的急性心肌梗死患者为研究对象。AMI诊断标准按中华医学会心血管病学分会制定标准执行,其中STEMI为99例,NSTEMI为61例,男性为92例,女性为68例。根据患者的临床资料和入院后的冠状动脉造影结果,罪犯血管血流按TIMI血流分级,将患者分为三组(组1为TIMI血流0级;组2为TIMI血流1-2级;组3为TIMI血流3级),其中组1为69例,组2为46例,组3为45例,其中同期选择52例疑似冠心病的患者作为对照组,其冠脉造影结果显示各冠脉狭窄<50%,且冠脉血流均为TIMI血流3级。研究方法所有患者入院均行冠脉造影并记录冠脉TIMI血流情况。根据冠脉造影结果统计四组患者冠脉病变支数和病变位置,计算Genesini积分。四组患者均在入院后收集血清,采用流式细胞仪测量内皮细胞微颗粒:CD31(+)/CD42(-)细胞微颗粒(CD31(+)/CD42(-)EMPs),并在入院后24h内进行超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、心肌肌钙蛋白I(cTNI)、肌酸激酶(CK-MB)、N末端B型钠尿肽原(NT-proBNP)的检测。应用SPSS 20.0统计软件对检测数据进行统计分析,所有数据都需要经正态性检验及方差齐性的检验,计量资料都采用均数±标准差(x±s)表示,组间差异比较采用单因素方差分析或秩和检验,变量间相关性采用直线相关分析,非正态分布资料用等级相关分析。计数资料以例数和百分率(%)表示,采用χ2检验。对四组CD31(+)/CD42(-)EMPs与Genesini积分、hs-CRP、cTNI、CK-MB、NT-proBNP之间的相关性采用一元线性相关分析的方法,当资料不符合正态分布时采用Spearman相关分析,P<0.05提示差异具有统计学意义。研究结果1.根据冠脉病变TIMI血流不同显示:急性心肌梗死冠脉血流与CD31(+)/CD42(-)EMPs、hs-CRP 相关:四组患者 CD31(+)/CD42(-)EMPs 和hs-CRP水平随着TIMI血流分级的级别呈逐步递减趋势,其中组1患者血清CD31(+)/CD42(-)EMPs和hs-CRP的表达水平最高,而组2低于组1,组3低于组2,对照组最低。而且四组之间进行两两比较均有显著差异(P值均小于0.05),差异有统计学意义。结果显示:急性心肌梗死冠脉病变血流与CD31(+)/CD42(-)EMPs、hs-CRP 相关。2.根据冠脉病变的狭窄程度显示:急性心肌梗死患者冠脉Genesini积分与CD31(+)/CD42(-)EMPs、hs-CRP 不相关..四组患者 Genesini 积分组 1 最高,组2、组3无明显差异(P=0.143),与组1均有明显差异(P<0.0001),组4最低,且与其他三组均有明显差异(P<0.0001)。四组患者Genesini积分与CD31(+)/CD42(-)EMPs 的 r 值及 p 值依次为:组 1:r=0.011、p=0.9286;组 2:r=0.1604、p=0.2868;组 3:r=0.009、p=0.9431;组 4:r=0.1183、p=0.4035。四组患者Genesini积分与hs-CRP的r值及p值依次为:组1:r=0.062、p=0.6129;组 2:r=0.091、p=0.5495;组 3:r=0.2052、p=0.1763;组 4:r=0.001、p=0.7143。结果显示:四组患者冠脉Genesini积分与CD31(+)/CD42(-)EMPs和hs-CRP无明显相关性。3.急性心肌梗死 CD31(+)/CD42(-)EMPs 与 hs-CRP、cTnI、CK-MB、NT-proBNP 呈正相关:四组患者 CD31(+)/CD42(-)EMPs 计数、hs-CRP、cTNI、CK-MB、NT-proBNP水平呈逐步递减趋势,而且四组之间进行两两比较均有显著差异(P值均小于0.05),差异有统计学意义。四组患者CD31(+)/CD42(-)EMPs与 hs-CRP 的 r 值及 p 值依次为:组 1:r=0.7284、p<0.001;组 2:r=0.9319、p<0.001;组 3:r=0.8540、p<0.001;组 4:r=0.031、p=0.8274。四组患者 CD31(+)/CD42(-)EMPs与 cTnI 的 r 值及 p 值依次为:组 1:r=0.8361、p<0.001;组 2:r=0.8939、p<0.001;组 3:r=0.9304、p<0.001;组 4:r=0.1580、p=0.2634。四组患者CD31(+)/CD42(-)EMPs 与 CK-MB 的 r 值及 p 值依次为:组 1:r=0.8782、p<0.
关键词: 急性心肌梗死 ；内皮细胞微颗粒 ；冠状动脉造影 ；TIMI血流分级 ；高敏C-反应蛋白 ；Genesini积分
被引量
2
摘要： 研究背景流行病学研究和动物实验表明,血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平与冠心病(CAD)风险呈高度负相关关系,HDL-C每下降1mg/dl心血管疾病风险可升高2%-3%。HDL是一个复杂的多功能蛋白复合体,可通过其促进胆固醇逆转运(Reverse Cholesterol Transport, RCT))、抗炎、抗氧化及抗血栓形成等多种功能发挥抗动脉粥样硬化(AS)作用,其中,促胆固醇逆转运(RCT)功能最为关键。然而,现已有大量研究证实HDL-C水平高低并不能准确代表HDL的整体功能,HDL-C水平检测作为HDL功能的度量标准以及预测冠心病发病风险的生物指标存在明显的局限性：研究发现,用CETP抑制剂torcetrapib治疗冠心病患者,虽然使HDL-C水平升高了72%,但冠心病事件的发生率却随之升高；与之相反的是,载脂蛋白AI(Apo-AI)自然变异为Apo-AIMilano的人群,虽然血浆HDL-C水平低,但冠心病事件的发生率也低。可见,对HDL质(HDL功能)的关汁较HDL量(HDL-C水平)的关注更为重要。2011年Amit V.Khera等在新英格兰杂志上发表了一篇文章：他们通过检测203例正常人群(已进行颈动脉内膜中层厚度(IMT)评估)、442例患者(冠状动脉血管造影证实有冠心病者)及351例病例对照患者(冠状动脉血管造影证实无冠心病但不排除有其他基础疾病者)的巨噬细胞胆固醇转出率,并以心血管疾病危险因子、HDL-C及载脂蛋白A-I水平作为协变量对胆固醇转出率与IMT进行线性回归分析发现：HDL-C与IMT之间不存在显著的相关关系；巨噬细胞胆固醇转出率与IMT和CAD风险高度负相关,此相关关系独立于HDL-C水平；HDL介导的巨噬细胞胆固醇转出率功能与AS的发生发展独立相关。这些发现提示HDL功能评估较HDL-C水平更有助于我们理解HDL的抗AS作用,预测AS及冠心病的发病风险。此外,关于HDL颗粒组成及生物特性存在异质性的一些报道的出现进一步强化了对HDL功能进行评估的需要。最新的基础和临床研究发现,在急性期反应、慢性炎症以及一些代谢性疾病中,高密度脂蛋白(HDL)的抗动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)减弱,甚至出现致AS作用,其机制可能与各种疾病状态下HDL结构及组成成分的改变导致HDL失功能有关。Shao等研究证实,氧化损伤可损害HDL主要组成蛋白载脂蛋白A-I (apolipoprotein A-I, apoA-I)促胆固醇逆转运功能,其机制可能与HDL发生氧化修饰有关。Heinecke发现,从冠心病患者血浆分离出的HDL中髓过氧化物酶的两种产物(氯酪氨酸和硝基酪氨酸)均明显升高,推测冠心病患者HDL抗氧化功能可能受到了损害。急性冠脉综合征(acute coronary syndromes,ACS)发生时,患者机体处于一种特殊炎症及氧化应激环境中,如急性心肌梗死患者体内促炎因子趋化因子配体-16(Cxc Chemokine Ligand, CXCL16)较慢性动脉粥样硬化患者明显升高,这种微环境的改变可能导致HDL中蛋白及磷脂组成成分的改变,进而使HDL功能发生改变。动物研究证实即使在血浆HDL-C水平升高情况下,与HDL代谢相关蛋白的改变仍可促进AS的发生。几个小规模研究发现,在炎性条件下HDL抗炎功能减弱。因而,我们推测ACS可能通过其独有的炎症反应改变HDL的组成成分进而使HDL发生失功能转变。蛋白质的结构决定其功能。蛋白质组学技术的应用为HDL功能学的研究提供了新的方法和思路。最近的一些研究显示HDL蛋白质组学与HDL功能密切相关,已发现组成HDL的蛋白主要涉及以下四方面作用：脂质代谢、补体激活、急性期反应、蛋白质水解调节,提示HDL蛋白质组学的改变可能在HDL功能变化中扮演着至关重要的作用。应用密度梯度超速离心技术,可将HDL颗粒按其密度大小分为HDL1、HDL2和HDL3三种亚类,血浆中以HDL2和HDL3为主(各占1/3和2/3)。HDL3为小的、密度较大、未成熟的颗粒,HDL2为大的、密度较小、成熟的颗粒。多数流行病学研究显示成熟的HDL2的动脉保护作用强于HDL3(Miller NE. Am Heart J,1987 113,589-597),但亦有报道认为二者具有同等强弱的动脉保护作用。近来对关于HDL亚组分的蛋白组学研究,主要集中在HDL3中特殊蛋白的水平,尤其是apoL-1、PON1、PON3与HDL3阻止LDL氧化的能力有关,实验表明HDL亚组分蛋白质组成是决定HDL功能的基础[22]。目前,国内外对于不同人群中HDL亚组分(HDL2,HDL3)不同蛋白组成与HDL功能(逆胆固醇转运,抗炎,抗氧化)的关系尚无报道；ACS的发生是否可导致HDL亚组分蛋白质组学的改变进而改变HDL亚组分功能国内外亦未见报道。目的通过评估健康人群及急性冠脉综合征(ACS)患者高密度脂蛋白(HDL)亚组分(HDL2和HDL3)的促胆固醇逆转运、抗炎、抗氧化功能,明确ACS是否可损害HDL亚组分的功能使其发生失功能改变。同时利用蛋白质组学相关技术分析健康人群与ACS患者HDL亚组分的蛋白质组学差异,探讨ACS导致HDL亚组分失功能改变的可能蛋白质组学机制。方法纳入2011年1月-2012年1月在南方医院心内科住院的ACS患者(ACS组)及同期在我院体检的健康体检者(对照组)各40例。分别检测两组血脂四项、超敏C反应蛋白(hsCRP)、HDL亚组分(HDL2和HDL3)介导的J774巨噬细胞[3H]胆固醇转出率、HDL亚组分屏氧酶-1(PON1)活性、脂氢过氧化物(LOOH)水平及炎症指数(HII)。血浆HDL亚组分的分离采用超高速密度梯度离心法,HDL亚组分组成蛋白的分离采用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术,差异蛋白的鉴定采用质谱分析。1、测定ACS患者及对照人群的基本指标(1)采用酶法在全自动生化仪上测定血脂四项(TC、TG、HDL-C、LDL-C);(2)采用透射比浊法测定血清hs-CRP；2、测定ACS患者及对照人群的HDL2及HDL3功能指标(1)抽取空腹血并抗凝,采用超速离心法分离并提取HDL2及HDL3；(2)利用乙酸苯酯法检测HDL2及HDL3颗粒上抗氧化酶PON1活性；(3)利用液闪计数仪检测HDL2及HDL3介导的巨噬细胞[3H]]胆固醇转出率；(4)非细胞学法测定HDL2及HDL3的炎症指数(inflammatory index);(5)采用改进的二甲苯酚橙显色实验法测定HDL2及HDL3颗粒中LOOH的水平。3、分析ACS患者及对照人群的HDL2及HDL3蛋白质组学差异(1)采用双向荧光差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)寻找不同HDL2或HDL3样本的差异蛋白点；(2)采用质谱分析法技术获得蛋白样品的肽质量指纹图谱和肽序列标签后,通过查询Swissprot蛋白数据库获得蛋白质的相关信息,选择可能具有重要意义的差异蛋白；(3)采用western-blot、酶联免疫吸附法(ELISA)技术验证不同HDL2或HDL3样本中某些有重要意义的差异蛋白。结果1、ACS组与对照组基本临床资料比较：与对照组比较,ACS组血清LDL-C水平及hs-CRP浓度均明显升高(t=2.972,P=0.004或t=9.175,P<0.001),差异具有统计学意义；而两组年龄、TC、TG及HDL-C水平比较,无明显差异,差异均无统计学意义(P>0.05)。2、ACS对HDL亚组分功能的影响：ACS组患者VS对照组：HDL2-PON 1活性为(77.58±14.88)U/mg VS (110.00±14.95)U/mg；HDL3-PON 1活性为(75.83±14.97)U/mg VS(104.57±13.16) U/mg；HDL2-胆固醇转出率为(20.6±3.7)%VS(27.7±5.5)%；HDL3-胆固醇转出率：(18.4±3.8)%VS(24.7±6.2%)%；HDL2-炎症指数为(1.25±0.27)VS(0.48±0.12)； HDL3-炎症指数为(1.32±0.27)VS(0.62±0.15)；HDL2-LOOH水平为(18.46±4.70)ngLOOH/(ug.chole)VS(9.09±2.27)ngLOOH/(ug.chole)；HDL3-LOOH水平为(21.30±5.64)ngLOOH/(ug.chole)VS(11.4±2.81)ngLOOH/(ug.chole)。统计学结果表明,与对照组比较,ACS组HDL亚组分PON1活性及其介导的巨噬细胞[3H]胆固醇转出率均明显下降(P<0.001),炎症指数及LOOH水平则均较对照组明显升高(P<0.001)。3、同一组内HDL2和HDL3功能比较:同组内HDL2和HDL3介导的胆固醇转出率比较,无论是在对照组或是ACS组,HDL3介导的胆固醇转出率均低于HDL2[正常组HDL2 VS HDL3:(27.7±5.5)% VS(24.7±6.2)%,P=0.027；ACS组HDL2 VS HDL3:(20.6±3.7)%VS(18.4±3.8)%, P=0.012]；而HDL3-LOOH水平则高于HDL2[正常组HDL2 VS HDL3:(9.09±2.27) ngLOOH/(ug.chole)VS(11.44±2.81)ngLOOH/(ug.chole),P<0.001；ACS组：(18.46±4.7)ngLOOH/(ug.chole)VS(21.3±5.64)ngLOOH,(ug.chole),P=0.017]。4、ACS对高密度脂蛋白亚组分蛋白质组学的影响：利用蛋白质组学技术比较ACS组与对照组HDL亚组分蛋白质组学差异,我们发现了48个差异蛋白点。通过质谱分析,本研究证实：与对照组比较,ACS患者HDL3中有9个蛋白表达上调,包括载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白E、载脂蛋白L1、屏氧酶、a-1B-糖蛋白、血清淀粉样蛋白P物质、维生素D结合蛋白、纤维蛋白原Y链；而ras-related protein Rab-7b蛋白则表达下调；同时与对照组比较,HDL2中有12个蛋白表达下调,包括载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白E、载脂蛋白L1、屏氧酶、触珠蛋白、血色素结合蛋白、转铁蛋白、补体因子B、ras-related protein Rab-7b、纤维蛋白原γ链、免疫球蛋白γ-1链C区域；4个蛋白表达上调,包括血清淀粉样蛋白P物质、a-1-抗胰蛋白酶、酸性酰胺酶、维生素D结合蛋白。此外,我们还利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了两组人群血清中血清淀粉样P物质(SAP)的浓度,发现ACS患者血清中SAP浓度较对照组明显升高[(3.53±0.41)lg (ng/ml) VS (3.11±0.48) (1g ng/ml),P< 0.001],差异具有统计学意义。结论1、ACS可损害HDL亚组分的功能,使具有抗动脉粥样硬化作用的功能性HDL亚组分转变为具有促动脉粥样硬化作用的失功能HDL亚组分。2、成熟的HDL2较未成熟的HDL3具有更强的促胆固醇逆转运及抗氧化功能,提示HDL2可能较HDL3具有更强的心血管保护作用。3、ACS可改变HDL亚组分的蛋白组成,重塑HDL亚组分蛋白质组学,而这种蛋白质组学的改变可能是ACS导致失功能HDL亚组分发生的一重要机制。此外,我们还发现2个新的存在于HDL2及HDL3中的蛋白：SAP及Rab7b。
关键词: 急性冠脉综合征 ；高密度脂蛋白亚组分 ；动脉粥样硬化 ；功能 ；蛋白质组学
被引量
1
摘要： 研究背景
心力衰竭是发达国家导致住院和死亡的主要病因,它是以左心室重塑、扩张为特点,同时伴随着胚胎基因的激活所导致的一系列病理学改变,是各种心脏疾病发展的终末阶段。随着我国人口老龄化、急性心肌梗死(AMI)诊疗方式的提高令生存率的增加和心衰患者寿命的延长,以致心衰患病率逐年增加。心衰的治疗策略虽然在近十余年里发生了根本性变化,从关注短期血流动力学改善转而针对心肌重构机制,防止和延缓重构的发展,取得了明显的成效,明显降低了心衰的死亡率和住院率,但由于心脏病及相并危险因素的不断增加,其5年病死率仍与恶性肿瘤相仿,因此,探索寻找新的治疗靶点,进一步减少患者病死率,成为心衰治疗的主要研究方向。
MicroRNA (miRNA)是近年来发现的小分子调节RNA,由约22个内源性非编码的核苷酸组成,可以和与之互补的信使RNA (mRNA)结合抑制其翻译或促进其降解,对mRNA的稳定及翻译效率起到重要的调控作用,从而实现对基因表达的负性调节效果。1993年Lee等在新小杆线虫和果蝇中发现了第一个miRNA并命名为lin-4；2000年Reomhart等在对线虫发育调控的研究中发现了let-7从而拉开了miRNA的研究序幕。MiRNA不仅参与调控机体的多种生理过程,如细胞的新陈代谢、增殖分化、生长凋亡等,而且在众多疾病的发生发展中起重要的调控作用。2006年Van Rooij E等首次观察到miRNA在心脏疾病的发生发展过程中有着重要调节作用,近年来miRNA在心血管疾病中的心肌肥厚与纤维化、心力衰竭、心律失常、心肌细胞凋亡和血管再生等研究领域均取得了一些重要进展,使得miRNA成为国际心血管研究领域的一个热点。
尤其值得注意的是,几乎所有关于人类心脏疾病miRNA功能的研究均来自心力衰竭患者。冠心病心力衰竭是由于泵功能的衰竭导致心脏不能够提供足够的器官血流灌注,经常是病理性心肌肥厚或扩张和致命性终末阶段。心肌细胞肥大是心肌细胞对于各种形式的血流压力超负荷、内分泌紊乱、心肌损伤及心肌结构或收缩蛋白遗传突变的主要反应；病理性心肌肥厚导致心功能受损是心力衰竭及心源性猝死的主要预测因子：所以研究其潜在的分子学机制及寻求新的治疗靶点十分重要。心肌肥厚表现为细胞内信号转导和转录调节激活所引起的心肌细胞的增大和间质蛋白合成的增加。2006年至今越来越多的研究关注miRNA与心肌肥厚-心力衰竭的关系。细胞培养实验通过过表达或敲除细胞中某些miRNA未影响心衰的发生发展,证实了多种miRNA参与心肌肥厚的病理过程。例如,发现MiR-21在心脏压力负荷增加时持续表达,体外细胞培养显示其调节心肌生长以及主要心肌细胞胚胎基因激活的作用；而心肌纤维化也是心脏对于损伤的反应,表现为miRNA对肌细胞外基质的调节。压力超负荷或心肌梗死后心脏成纤维细胞将会分泌更多的细胞外基质蛋白,从而导致心肌纤维化,心肌收缩力下降,心室壁顺应性减退、而出现心力衰竭；同时研究发现心肌梗死后组织miR-21升高并证实miR-21可以促进成纤维细胞分泌胶原纤维,相反心肌梗死后miR-29表达明显下调,因此抑制miR-21或上调miR-29的表达均会抑制心肌纤维化,改善心功能。这些研究显示了miRNA在调节心肌肥厚、纤维化和心力衰竭过程中起着重要作用,提示了miRNA表达谱的差异亦可以预测疾病和疾病所处的发展阶段,同时也提示miRNA很可能成为心脏疾病潜在的治疗靶点。显然,我们很难在人类心力衰竭的起始阶段取得患者的心肌组织进行研究,而已有的研究几乎都是小样本量的研究,在动物心肌组织进行取样分析并不能推广到临床用途,所以探求miRNA新的研究途径显得十分必要。
2008年Mitchell PS等的一项关于癌症标志物的研究中发现,血浆中miRNA能以稳定的形式存在,避免内源性RNA酶的降解,同年Shlomit G等同样观察到miRNA可以在血浆和其他体液中稳定存在,并且表达谱随不同病理生理状态而改变。正是由于这些非细胞性miRNA在循环中的稳定性,我们可以十分简便地获得外周静脉血并提取血浆来代替心肌组织研究心力衰竭时特异性表达的miRNA。由于外周静脉血的获取十分简便而且病人的接受性较好,使得miRNA在心力衰竭乃至整个心血管疾病的研究可以获得足够的样本量,突破样本量不足导致的假阳性,而且更符合真是世界的情况。
众所周知,心肌梗死不仅导致心肌细胞坏死、凋亡,还累及血管床和心肌外胶原组织,复杂的病理生理、病理解剖而导致心室重构,引起心功能不全：目前与缺血性心肌损伤、心肌保护及修复相关的miRNA表达及功能的研究主要集中在心肌梗死后不同阶段心力衰竭的动物模型上,而较少关于心力衰竭患者中miRNA表达的相关研究。针对上述情况,本研究将入选心肌梗死引起的不同类型心力衰竭患者,包括急性心肌梗死引起的急性心力衰竭患者,陈旧性心肌梗死伴发的慢性心力衰竭患者,以及冠状动脉造影显示冠脉正常的正常者,分别抽取其外周静脉血,通过miRNA array分析各组间miRNA表达谱的差异,筛选出差异显著的几种miRNA,进而筛选不同类型急性心力衰竭可能的特异性血清miRNA,探索新的心力衰竭标志物,并筛选出一些新的心力衰竭miRNA调控通路,为心力衰竭寻找到新的治疗靶点。
心肌梗死作为冠心病的一种,近年来发病率呈逐年上升趋势,随着急性心肌梗死治疗手段的进步,尤其是再灌注治疗方法的应用使其早期死亡率不断降低,但转而变成了越来越多急性心肌梗死患者发展为不同程度的心力衰竭。众所周知,血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)能阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS),从而抑制心肌重构,有效地提高心力衰竭患者的生存率、改善症状、降低再住院率。心肌梗死后心力衰竭患者血压往往不高或偏低,培哚普利因其降压作用相对较温和,是临床上应用较为广泛的一种ACEI类药物,多项大规模临床试验均证实其在抑制心肌重构、降低远期死亡率方面作用显著。多数研究均从阻断RAAS系统、抑制心肌重构方面研究培哚普利对于心肌梗死后心力衰竭患者预后的影响,但目前尚无从心肌能量消耗方面研究其对心力衰竭患者的影响。2003年Vittorio Palmieri等提出心肌能量消耗全新的的超声指标MEE(myocardial energy expenditure).因其无创、临床易操作、易广泛推广、价格相对低廉,多普勒超声心动图方法评估心肌能量消耗近来得到了深入的研究。本研究将从基于ECHO的心肌能量消耗指标出发,观察不同时期心肌梗死患者及不同剂量培哚普利治疗12个月对心肌梗死后心力衰竭患者超声心动图各指标的变化,并探讨其临床意义。同时,由于心肌梗死后出现了心肌收缩力下降,心室顺应性降低,而陈旧性心肌梗死所致心室重塑等因素,心肌能量消耗水平存在差异,通过无并发心衰的急性心梗,陈旧性心梗与冠脉正常患者的超声心电图各指标及MEE的水平探讨心梗患者的心肌能量消耗情况,为针对缺血心肌能量代谢治疗提供依据。
第一部分心肌梗死后心力衰竭患者血浆中miRNA表达差异
目的采用血浆miRNA array方法分析心肌梗死不同阶段心力衰竭组患者与正常对照组间miRNA表达谱的差异,筛选出与心衰有关的外周血miRNA谱为探索新的心力衰竭标志物及进一步寻找心力衰竭的治疗靶点提供基础。
方法选择急性心肌梗死患者25例,其中合并心力衰竭患者15例做为AMHF组,心功能正常患者10例做为AMNHF组,陈旧性心肌梗死后心力衰竭患者10例做为OMHF组,行冠脉造影检查结果正常的心功能正常者10例做为NHF组。采集其外周静脉血并离心得到血浆,对分同组别的血浆miRNA Array检测。
结果AMHF组与AMNHF组比较,miRNA上调大于1.5倍的有19种,下调大于1.5倍的有25种。AMHF组与OMHF组比较,miRNA上调大于1.5倍的有13种,下调大于1.5倍的有43种。AMNHF组与NHF组比较,miRNA上调大于1.5倍的有38种,下调大于1.5倍的有48种。
结论基于外周静脉血血浆的miRNA array分析方法可以筛选出心肌梗死引起的心力衰竭患者及正常对照组间的miRNA表达谱的差异,筛选出与心衰有关的外周血miRNA为探索新的心力衰竭标志物及进一步寻找心力衰竭的治疗靶点提供基础。
第二部分心肌梗死后心力衰竭患者经不同剂量培哚普利治疗后其心肌能量消耗水平的变化及其意义
目的探讨心肌梗死后并心力衰竭患者给予不同剂量培哚普利治疗12个月后经无创超声心动图评估的心脏结构指标及心肌能量消耗(MEE)水平变化及其意义。方法选取心肌梗死后不同程度心力衰竭患者63例,分别给予培哚普利治疗,根据长期口服剂量水平分为常规剂量组(N,培哚普利4mg)和靶剂量组(H,培哚普利8mg)。治疗前及治疗12个月后分别用多普勒成像技术测量心脏结构指标、左室收缩功能指标(左室短轴缩短率LVFS,左室射血分数LVEF),计算左室收缩末周向室壁应力(cESS)、MEE。入组前及治疗后分别于清晨采集外周静脉血,检测NT-proBNP及血肌酐。
结果治疗前两组间基线资料各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组间比较,H组心脏结构指标(左室收缩末期内径LVIDs、左室质量指数LVMI)、心肌能量消耗指标(cESS、MEE)及IgNT-proBNP小于N组,收缩功能指标(LVFS、LVEF)高于N组,差异具有统计学意义(P<0.05)。与治疗前比较,H组治疗后心脏结构指标、心肌能量消耗指标及IgNT-proBNP均明显降低,收缩功能指标明显升高；N组除PWTs、LVFS外其他各指标间变化均有统计学意义(P<0.05)。双变量相关分析显示,MEE与IgNT-proBNP呈正相关关系(P<0.01)。
结论心肌梗死后心力衰竭患者经过12个月不同剂量培哚普利治疗,均抑制了心肌重构,改善了左室收缩功能,降低了NT-proBNP及心肌能量消耗水平；高剂量培哚普利治疗较低剂量能更明显地抑制心肌重构,改善左室收缩功能,降低NT-proBNP及心肌能量消耗水平。
第三部分心肌梗死不同时期患者心肌能量消耗变化及意义
目的探讨多普勒超声指标心肌能量消耗(MEE)在心肌梗死不同时期患者中的变化及临床意义。
方法选取经冠状动脉造影确诊为心肌梗死且无心力衰竭患者51例,其中急性心肌梗死(AMI)组28例,陈旧性心肌梗死(OMI)组23例；选取同时期行冠状动脉造影正常的患者30例作为正常对照(NOR)组。所有入选患者均用多普勒超声技术测量心脏结构指标、左心室收缩功能指标LVEF等,应用公式计算左心室收缩末周向室壁应力(cESS)及MEE；检测血浆N端前体脑钠肽(NT-proBNP);探讨MEE与左室收缩功能及NT-proBNP相关性。
结果AMl组1gNT-proBNP. MEE大于OMI组(P<0.05)；与NOR组比较,AMI组和OMI组中cESS.MEE及1gNT-proBNP指标水平均明显升高(P<0.05)。相关性分析示：MEE与LgNT-proBNP间呈正相关关系,与LVFS、LVEF呈负相关关系。
结论心肌梗死组患者MEE均高于正常对照组；急性心肌梗死组患者MEE高于陈旧性心肌梗死组患者；MEE与左室收缩功能指标呈明显负相关关系。MEE能有效地评估不同时期心肌梗患者的心功能状态。
关键词: 心肌梗死 ；心力衰竭 ；血浆 ；miRNA ；miRNA array ；心肌梗死后心力衰竭 ；培哚普利 ；心肌能量消耗 ；超声心动图 ；急性心肌梗死 ；陈旧性心肌梗死 ；心肌能量消耗 ；超声心动图
被引量
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摘要： 研究背景： 冠心病是导致人类死亡的主要病因之一,因为心肌缺血损伤和缺血再灌注损伤导致患者死亡或心力衰竭发生率非常高。对于急性心肌梗死患者,利用溶栓或早期用经皮冠状动脉介入治疗进行有效的心肌再灌注是缩小心肌梗死面积,改善临床转归的有效方法。但是对于心肌缺血后损伤和缺血再灌注损伤对心功能的影响和突发心脏事件的发生如何预测和减低是非常棘手的问题。尽管我们对心肌缺血再灌注损伤的机制目前研究发现主要认为是中性粒细胞聚集、钙超载或钙再分布、线粒体能量合成障碍、氧自由基生成、细胞因子、心肌细胞凋亡等现象所引起的,但是我们是否能对引起这些变化的相关调控物质予以检测和干预来达到理想的效果呢? 缺血是由于供血障碍引起的组织供血不足的病理表现,组织缺血导致的疾病称缺血性疾病,是可以发生在多种组织器官上的常见疾病。再灌注是指组织缺血后恢复供血的过程,缺血再灌注实际上包括缺血和再灌注两个方面,缺血是引起疾病的原因,,也是再灌注的条件。及时的心肌再灌注治疗,如溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(PCD等都可以重建冠状动脉血运,使缺血心肌得到再灌注,从而减少心肌坏死面积,是急性心肌梗死(AMI)治疗的关键。但近来研究发现,冠状动脉的骤然开通与血流恢复,会引起血管内皮细胞功能异常、激活相关炎症因子等,反而会加重缺血心肌的损伤,导致再灌注损伤。AMI的动物研究结果已经表明,40%-50%的坏死心肌为再灌注损伤所引起,这种损伤的存在减弱了积极再灌注治疗所得到的益处。因此,减少再灌注损伤成为AMI防治的非常重要环节之一。 心肌缺血后损伤和缺血再灌注损伤目前主要有以下几种观点：1、自由基损伤学说。当机体损伤产生的自由基超过机体的清除能力时,将对机体产生损伤作用。研究证实缺血再灌注过程中,缺血区有大量的自由基产生,如清除氧自由基能力降低或活性氧自由基(ROI)产生过多,都会导致ROI蓄积,从而引发心肌氧化应激。氧化应激是缺血组织再灌注的特征之一。而且研究证实应用自由基清除剂辅酶Q10可以减轻缺血再灌区细胞的损伤。2、钙超载是造成心肌细胞损伤的重要机制之一,缺血缺氧时心肌细胞内酸中毒,细胞内H+增加,恢复再灌注时细胞内外形成pH梯度差,刺激Na+-H+交换,使Na+大量内流。再灌注后由于能量供应和pH值的恢复,促进Na+-Ca2+交换,,细胞外的Ca2+大量内流,,造成Ca2+超载。从而使细胞膜和细胞器膜受损、促进氧自由基生成而导致心肌损伤。同时由于缺血时血管平滑肌有明显Ca2+内流增加,可致血管收缩痉挛,血管阻力增加对缺血区循环不利,使心肌梗死灶扩大。研究发现,细胞内钙离子浓度的改变是造成再灌注损伤的重要原因之一,钙超载还是多种原因导致的细胞损伤和死亡的共同通路。3、心肌能量代谢障碍。三磷酸腺苷(ATP)是细胞代谢的主要能量来源,细胞所处的生命状态和一切生命活动最终都依赖AT P的水平。如果轻度缺氧或短暂严重缺氧后复氧,细胞仍可生成部分ATP,可为凋亡所需能量提供保障,促使细胞发生凋亡。反之,如果较长时间严重缺氧,细胞由于AT P骤减导致凋亡所需能量不足而发生坏死；当ATP生成被完全抑制后细胞发生坏死,提示ATP在缺氧诱导细胞死亡过程中是细胞死亡方式的决定性因素之一。能量代谢障碍也是自由基产生的基础,自由基损伤又可加重能量代谢障碍,两者也是互为因果的关系。所以说,线粒体损伤和能量代谢障碍是心肌缺血再灌注损伤的重要原因,细胞内的AT P水平是决定细胞发生凋亡或坏死的主要因素。4、内皮细胞抗氧化系统损伤,研究证明内皮细胞的抗氧化活性与其对氧化活性的敏感性之间有一定的关系。心肌缺血再灌注时,内皮细胞不仅产生大量的活性氧,而且其抗氧化活性大大降低,并对外源性的活性氧产生系统有较高的敏感性,从而引起大量活性氧的产生,远远超过了内皮细胞的防御系统,最终引起心肌的损伤。有研究表明,缺血再灌注发生的内皮细胞功能障碍及NO合成的减少,内皮素(ET)心肌缺血时ET释放增加,再灌注时ET释放进一步增加,引起了强烈的血管收缩,可直接引起心肌缺血,加重血管功能障碍,使细胞发生不可逆的损伤。组织缺氧及肾上腺素分泌增加均可导致ET的mRNA表达及ET释放,心肌缺血再灌注还可引起心肌细胞膜ET受体上调,并使冠状血管对ET的敏感性增加,冠脉小分支因而易于痉挛,可导致心肌的无复流现象。内皮细胞与中性粒细胞粘附缺血、再灌注引起中性粒细胞与内皮细胞的粘附增加,中性粒细胞与血管内皮接触时即被激活,释放OFR等毒性产物及破坏性蛋白酶,改变血管的通透性。同时活性氧产生的增加,损伤了内皮细胞和其他细胞,其作用于内皮细胞或粒细胞表面的粘附分子,促进内皮细胞的粘附,而缺氧本身也损伤内皮功能,改变其粘附性,最终导致内皮细胞破损、水肿和功能障碍,毛细血管腔被阻塞,导致虽有大血管的再灌注但局部缺血区仍无复流的现象。5、相关细胞因子作用。由于缺氧复氧的刺激,冠状血管受损,这时肿胀的内皮细胞阻碍了气体交换,而内皮细胞和平滑肌细胞的损伤使血管不能很好扩张,血管腔内中性粒细胞和血小板的聚集通过嵌顿、堵塞毛细血管,使冠脉血流更趋减少；继而血管内皮和中性粒细胞产生细胞因子、粘附因子,使中性粒细胞向血管内皮细胞粘附,并释放颗粒状弹性硬蛋白、活性氧、溶酶体酶、细胞因子和其他炎性介质。这些物质会损伤内皮、血管平滑肌细胞和心肌细胞。6、细胞凋亡参与了这一过程,细胞凋亡是缺血再灌注组织损伤功能丧失的重要原因,它是一个很复杂的过程。细胞凋亡的诱导因素很多,而在心肌缺血再灌注引起的细胞凋亡中主要机制则为自由基增多和细胞内Ca2+水平升高。由于缺血缺氧可使内源性抗氧化剂如SOD失活或耗尽,从而使AT P代谢产物在缺血缺氧心肌组织中堆积,产生大量氧自由基。氧自由基性质极不稳定,一旦形成迅速使肌膜的葡萄糖与脂质过氧化,蛋白质变性,酶失活,并使细胞内的DNA链断裂,从而诱导细胞凋亡。 目前对于微小RNA在心血管系统的作用研究处于热点中。微小RNA(microRNA, miRNA)是近年发现的小的、内源性的单链的非编码RNA,大约由22个核苷酸组成,与基因表达的控制有关。它被认为是基因表达的负面调节器,通过与其目标mRNA分子的3’端非编码区互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到抑制。目前大约有三分之一的基因受miRNA调控。最近的研究表明一些miRNA在心血管高度表达,它们在调控心血管的发育和疾病方面具有重要意义,这给心血管疾病的治疗带来了希望。研究发现大鼠离体和活体的心肌缺血/再灌注模型中miR-320的表达式持续性失调。鉴定热休克蛋白20(一种已知的心肌保护蛋白)是miR-320的靶体。敲除内源性miR-320发现通过热休克蛋白20来保护有心肌缺血再灌注诱导的心肌细胞死亡/凋亡将失去。另外的研究发现大鼠缺血6小时后心脏的缺血区miR-21的表达是明显下降的,而在周围边缘区表达是上升的。在离体转染miR-21通过其靶基因执行激活蛋白1通路来降低边缘区和缺血区细胞的凋亡。在活体中实验表明miR-1和miR-133对细胞的凋亡是起相反作用的。miR-1还通过抑制胰岛素样生长因子1的转运与细胞的死亡是联系在一起的。最近的研究发现在病人的外周循环血中也可检测出miRNAS。因此,我们可以假设外周血中miRNAs反映了组织的损害,基于此miRNAs可以作为急性心肌梗死的血清生物标记物。 miR-126(microRNA-126)作为miRNAs家族中的一员,人们通过对小鼠动脉粥样硬化模型的研究,发现其在其中有调节细胞凋亡的作用。在人的内皮细胞中,对血管的形成起副调节作用,抑制细胞衍生因子1的表达。调节血管的完整性、血管内皮细胞的增值和新生血管的形成。Sun X等研究认为miR-126的下调和上调和冠心病发病无明显相关,只是和胆固醇的代谢有相关性,在高的冠心病伴低密度胆固醇(LDL)的患者中的表达量是减少的。但是Guangwen Long等在急性心肌梗死中测得血浆中的miR-126表达和急性心肌梗死有关,在急性心肌梗死中的miR-126表达是减少的,且其上调和下调与时间相关,其在不同时间的表达曲线基本是和血清肌钙蛋白Ⅰ的时间表达曲线是一致的,但彼此未见明显相关性。miR-92a作为miRNAs家族中的另一员,研究发现在人的内皮细胞中高度表达,控制新的血管生成。体内和体外的研究发现miR-92a在内皮细胞中的过度表达损害血管生成。离体的研究表明诱导缺血后组织中的miR-92a的表达明显上调。在急性心肌梗死模型中抑制miR-92a的表达回促进心脏功能的恢复。实验研究表明miR-92a不仅在内皮细胞中表达,而且在心脏成纤维细胞、心肌细胞中,拮抗niR-92a能明显降低细胞凋亡,但并没有影响细胞的生存。研究还发现miR-92a依赖性调节NO合酶来控制血管张力。研究表明在冠心病患者中的表达偏高,他汀类可以通过减低miR-92a表达来减低血脂。抑制了miR-92a可能会减少心肌梗死面积,改善心肌梗死后重塑和新生血管。在心肌缺血／再灌注中研究表明miR-92a通过促进心脏保护蛋白的合成,起到积极作用。因此,本研究从临床和基础方面对miR-92a和miR-126在心肌缺血再灌注中作用进行研究,为未来冠心病的诊治提供方法和措施。 研究目的： 1、通过对急性心肌梗死患者外周血中的miR-92a和miR-126表达研究,检测miR-92a和miR-126能否进一步早期诊断急性心肌梗死； 2、对急性心肌梗死患者行再灌注治疗前后外周血中miR-92a和miR-126表达来阐述微小RNA在其中的可能作用。 3、通过对急性心肌梗死行再灌注治疗后出现无复流现象时miR-92a和miR-126表达的研究,试图说明miR-92a和miR-126在其中的可能作用。 3、通过建立小鼠的心肌缺血再灌注实验研究来推断miR-92a和miR-126在心肌缺血再灌注损伤中可能的调控机制。 研究方法： 1、临床外周血中微小RNA等相关标本的收集和检测 1.1选择了36例证实为冠心病患者和与之年龄向匹配的3例健康者进入临床研究。分组：稳定性心绞痛组、不稳定性心绞痛组、非ST段抬高性急性心肌梗死组、ST段抬高性急性心肌梗死组、健康对照组。所有冠心病患者均行PCI治疗,AMI患者行急诊PCI治疗。 1.2取冠心病患者PCI术前和PCI术后1、5天的静脉血。健康对照组为匹配的时间。将采集好的全血转移至单独的冻存管,短期保存,放入-70℃冰箱,长期保存,放入液氮中。 1.3采用实时定量荧光PCR (qRT-PCR)来测定miR-92a、miR-126的表达,所有检测过程按照上海康成公司提供的试剂盒说明来进行。同时检测患者血中的相关指标：清肌钙蛋白I (cTNI)、N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、D-D二聚体(D-D)等指标。并分析PCI手术时患者是否有无复流现象。 1.4统计学分析：采用SPSS18.0统计软件。使用t检验或方差分析,参数以x±S表示。相关分析采用Pearson或Spearman相关分析法,P<0.05为差异有统计学意义 2、动物实验中外周血中微小RNA等相关标本的收集和检测 2.1小鼠心肌缺血再灌注模型的建立及分组： 选昆明小鼠结扎其左冠状动脉前降支,以小鼠心肌颜色变白且心电图ST段持续弓背抬高为模型成功标志。结扎30分钟后,撤除结扎线,以心肌恢复红润且ST段下降作为再灌注模型成功标志。目前此动物模型建立是成熟的。分组：假手术组(9只)、模型组(9只)、干预模型组(9只),每组中的3只用制成组织学切片。干预模型组用阿托伐他汀(2mg/kg)每天一次灌胃,其他两组给予等量的生理盐水,共7天。 2.2标本采集和相关指标的完成 各组小鼠分别设计为结扎冠状动脉30分钟后再灌注12h各6只,取部分血用来检测血清中相关指标,另取血400ul,将采集好的全血转移至单独的冻存管,短期保存,放入-70℃冰箱,长期保存,放入液氮中。杀死小鼠后取不同标本(缺血区、边缘区)组织经固定-脱水-石蜡包埋-切片。 2.3检测相关指标 用伊文氏蓝来进行染色。细胞凋亡指数用TUNEL法。全血采用实时定量荧光PCR (qRT-PCR)来测定miR-92a、miR-126的表达。
关键词: 微小RNA ；miR-92a ；miR-126 ；心肌缺血再灌注 ；实时定量荧光PCR ；急性心肌梗死 ；经皮冠脉介入治疗 ；冠心病
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