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1. 认领

【期刊论文】 • 胡媛媛 ¹刘子琦 ¹乔子祺 ¹陈欣 ¹ +2位作者 • 《中国生物制品学杂志》 • 2022年第2期 150 - 158，共9页

机构： [1] 重庆科技学院化学化工学院[2] 工业发酵微生物重庆市重点实验室

摘要：目的对斑马鱼Hepcidin-2基因结构进行生物信息学分析,并设计优化其抗菌活性。方法选取斑马鱼Hepcidin-2作为目的基因,通过Tblastn进行多序列同源性比对得到Hepcidin基因家族的核苷酸和氨基酸序列,利用生物信息学方法分析其进化关系、理化性质、信号肽、跨膜结构、二级结构、三级结构等;收集和筛选多个物种的Hepcidin序列152条,计算成熟肽各个位置最大频率的氨基酸,得到序列模板,并对序列模板进行预测。结果抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)活性中心空间结构高度保守,C-末端及信号肽区域形成跨膜螺旋结构,成熟肽部分存在β-折叠,得到的序列模板预测具有抗真菌活性,对肺炎克雷伯菌有抗菌活性,对人红细胞有溶血活性。结论建立了序列模板法优化AMP序列和预测其抗菌活性的技术路线,为改造天然AMP,扩大其在临床和生产中的应用提供了理论支持和技术支撑。

摘要译文

关键词: Hepcidin ；斑马鱼 ；基因结构 ；生物信息学 ；抗菌活性 ；优化设计

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被引量 3

2. 认领

【学位/硕士】 • 邢介婷 • 厦门大学 • 导师：王克坚 • 2022年

摘要：拟穴青蟹(Scylla paramamosain)简称青蟹,属于热带亚热带种类,分布广泛。因味道鲜美、营养价值丰富,目前已成为我国重要经济海水养殖蟹类之一。拟穴青蟹是开放循环系统且经过多次蜕皮阶段,易受到海水中病原微生物的威胁,其主要依靠先天免疫因子来抵御外界环境胁迫。抗菌肽作为重要先天性免疫因子对多种病原菌具有较强的抑杀作用且不易产生耐药性,具有良好的稳定性和生物友好性,在抵御外来病原入侵和免疫调节中发挥关键作用。因此,在拟穴青蟹中筛选新型抗菌肽,探究其抗菌机制,可为阐明拟穴青蟹先天免疫机制和疾病防治及抗菌肽的应用提供参考。本研究对课题组前期建立的转录组数据库进行深入分析,筛选得到3条在性腺中高表达且能响应病原刺激的基因,推测其可能参与青蟹的免疫过程。利用分子克隆技术获得了 3条基因的cDNA全长序列,分别命名为Scyrepsin(Genbank登录号:ON297679)、Scyrephemin(Genbank 登录号:ON297680)、Sparepcin(Genbank登录号:ON297681);用qPCR技术检测了各基因在青蟹体内的表达特性及对病原菌的响应模式。此外,根据生物信息学分析以及抗菌肽预测软件筛选活性肽段,通过化学合成法得到3条截短多肽:Scyrepsin(34-55)、Scyrephemin(60-81)、Sparepcin(173-194),并对其体外抗菌活性和抗菌机制进行了研究,结果如下: 1.筛选获得3条未见报道的拟穴青蟹免疫相关新基因。对前期本实验室构建的转录组数据库进行细致分析,筛查到3条在雌性成蟹性腺中表达量高且响应溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染的基因。通过RACE-PCR技术获得了 3条基因的全长cDNA序列。Scyrepsin基因的全长cDNA序列为786 bp,其中5'非编码区(untranslatedregion,UTR)为 118 bp,3' UTR 为 491 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 77 bp,编码 58个氨基酸;Scyrephemin 基因 cDNA 全长为1276 bp,其中5'UTR为122 bp,3'UTR为146 bp,ORF为 1008 bp,编码335个氨基酸;Sparepcin基因cDNA全长为 1855bp,其中5'UTR为 785 bp,3'UTR为425 bp,ORF为645 bp,编码214个氨基酸。Scyrepsin成熟肽二级结构主要由β-折叠组成,而Scyrephemin和Sparepcin成熟肽二级结构主要由α-螺旋和β-折叠组成。 2.分析了 3条基因在青蟹不同发育阶段、成蟹各组织的分布特性。Scyrepsin基因在胚胎发育Ⅰ、Ⅱ期高表达,但在胚胎发育其它时期及幼体发育阶段表达量很低;在正常成蟹中,Scyrepsin主要在卵巢和纳精囊及精巢中表达。Scyrephemin基因在胚胎发育Ⅰ期转录水平最高,在其它发育阶段也有表达;在正常成蟹各组织中广泛分布,在雌性卵巢和纳精囊以及雄性血细胞和精巢中显著表达。Sparepcin基因仅在胚胎早期阶段转录水平较高,在正常成蟹组织中,仅在雌性卵巢和纳精囊及雄性精巢中特异性高表达,在其它组织中转录水平很低。 3.揭示了溶藻弧菌感染下3条基因的诱导表达模式。溶藻弧菌感染成蟹12 h后,Scyrepsin基因在雌蟹纳精囊中的表达量被显著诱导上调表达:溶藻弧菌感染雄蟹3 h、6 h、48 h后,Scyrephemin基因在精巢中的表达量均被显著诱导上调表达,血细胞中的表达量也在感染后的3 h、6 h显著增加,还发现Scyrephemin基因在溶藻弧菌感染大眼幼体12 h后被显著诱导上调表达;溶藻弧菌感染青蟹3h后Sparepcin基因在精巢中的表达量显著增加。 4.筛选得到了 3条具有抗菌活性的新型抗菌多肽。基于3条基因编码的氨基酸序列,对蛋白进行分段设计,通过化学固相合成法合成纯度大于95%的Scyrepsin(34-55)、Scyrephemin(60-81)、Sparepcin(173-194)三条短肽,并进行抗菌活性检测。结果发现,它们对细菌、酵母真菌和丝状真菌等微生物具有广谱抗菌活性。3条抗菌多肽对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)两种常见临床致病菌具有较好的杀灭效果,其中Scyrepsin(34-55)、Scyrephemin(60-81)和 Sparepcin(173-194)对金黄色葡萄球菌的 MBC值分别为12～24 μM、12～24 μM、24～48 μM;而对鲍曼不动杆菌的MBC值分别为6～12 μM、12～24 μM、24～48 μM。1倍MBC的抗菌多肽与金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌共孵测定杀菌动力学,结果表明3条抗菌多肽在30 min内可有效杀灭金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌。高温处理不会影响抗菌多肽对金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的抗菌活性;外源添加低浓度Na+不会影响抗菌多肽的抗菌活性,当Na+浓度达到160 mM时,其抗菌活性受到影响。结晶紫染色实验表明,3条抗菌多肽能显著抑制金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌生物膜的形成。此外,3条抗菌多肽对拟穴青蟹血淋巴细胞、斑马鱼胚胎细胞及人肾上皮细胞无细胞毒性,对人宫颈癌细胞也无明显抑杀效果。 5.初步揭示了 3条抗菌多肽的抗菌机制。扫描电子显微镜观察抗菌多肽处理后细菌的形态变化,发现菌体表面出现褶皱,细胞破碎,内容物流出。外源添加细胞壁组分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)能显著影响抗菌多肽对金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的抗菌活性,说明3种抗菌多肽可能具有结合细胞壁组分的特性。N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,NPN)摄取实验表明,Scyrepsin(34-55)、Scyrephemin(60-81)、Sparepcin(173-194)在浓度分别为6μM、6μM、12 μM时对鲍曼不动杆菌的外膜造成明显的损伤效果。用SYTO9/PI染色法分析抗菌多肽对细菌内膜的影响,发现多肽处理后金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌胞内PI强度增加,说明内膜通透性增强。ATP(adenosine triphosphate,ATP)释放实验显示,抗菌多肽作用后,细菌胞外环境ATP浓度较对照组显著增加,说明胞内物质外流。利用流式细胞分选技术探究抗菌多肽对细菌胞内 ROS(reactive oxygenspecies,ROS)的影响,发现 Scyrepsin(34-55)处理后金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌胞内ROS含量均增加,Sparepcin(173-194)能使金黄色葡萄球菌胞内ROS含量升高,但对鲍曼不动杆菌胞内ROS的影响较小,而Scyrephemin(60-81)对细菌胞内ROS水平无明显影响。

摘要译文

关键词: 拟穴青蟹；新型抗菌多肽；抗菌活性 ；抗菌机制

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被引量 1

3. 认领

【学位/硕士】 • 张恩鹏 • 江苏大学 • 导师：王亮 • 2019年

摘要：牛乳铁蛋白肽（LFcinB,Bovine Lactoferricin）是酸性环境下,经胃蛋白酶水解,从天然牛乳铁蛋白（BLf,Bovine Lactoferrin）N末端释放的一段含25个氨基酸残基的阳离子肽,其氨基酸序列为:Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe。目前已经证实LFcinB具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫和抗氧化等生物活性。此外,其良好的耐热性和无抗原性有利于在食品工业的应用,尤其是婴幼儿奶粉的生产。研究发现不同来源的乳铁蛋白肽中,LFcinB的抗菌活性最高,因此,LFcinB及其衍生肽的研究成为近年来的研究热点之一。巴斯德毕赤酵母表达系统是一种高效的异源蛋白表达系统,迄今为止,已有数百种异源蛋白在巴斯德毕赤酵母中成功表达。相对于其他表达系统,巴斯德毕赤酵母可以对表达的异源蛋白进行翻译后糖基化修饰和加工。其外泌型表达载体线性化后,整合入毕赤酵母基因组DNA中,可将目的蛋白分泌至发酵液中,简化了下游纯化工艺,降低生产成本。本文利用生物信息学工具,以LFcinB为模板,设计得到具有高抗菌活性的衍生肽序列。将衍生肽基因构建至表达载体,线性化后将衍生肽基因整合到巴斯德毕赤酵母基因组DNA中,通过基因工程菌外泌表达衍生肽。1、本文对LFcinB不同位点的氨基酸进行替换,设计得到5条衍生肽,利用生物信息学工具对衍生肽的理化参数、疏水残基比例、电荷数、两亲性分布、二级结构及空间结构进行预测和对比分析,然后利用抗菌肽数据库预测工具对衍生肽抗菌活性进行评价。得到一条最优化衍生肽序列L3,其疏水性为52%,电荷数为+7,两亲性分布及空间结构模拟与LFcinB相似,综合分析结果表明,衍生肽L3理论上具有比LFcinB更高的抗菌活性。2、将优化设计的衍生肽基因克隆至扩增质粒pUC-SP上,将pUC-SP-L3转化至感受态大肠杆菌DH5α中,经扩增后提取质粒,用EcoR I和Not I进行双酶切获取L3目的基因;使用T4 DNA连接酶将目的基因连接至同样经EcoR I和Not I双酶切的外泌型穿梭表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-L3;将重组表达载体pPIC9K-L3转化至感受态大肠杆菌DH5α进行扩增,提取扩增后的重组表达载体,经双酶切、PCR扩增及基因测序验证,证明衍生肽基因插入到经酶切后的pPIC9K多克隆位点,且构建的重组表达载体pPIC9K-L3基因序列准确。3、使用限制性内切酶Sac I将重组表达载体pPIC9K-L3线性化,电转化至感受态毕赤酵母GS115细胞中,涂布至最小葡萄糖培养基（MD,Minimal Dextrose Medium）平板,于30℃恒温静置培养72 h;利用选择性培养基最小甲醇培养基（MM,Minimal Methanol Medium）和MD平板筛选得到41个表型为His+Mut+,4个表型为His+Muts的阳性转化子;PCR扩增鉴定表明,目的基因已正确整合入GS115基因组DNA中。4、使用BMGY/BMMY培养基对得到的45个阳性转化子进行筛选,设置甲醇浓度梯度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%,筛选得到5个具有抑菌活性的阳性转化子,其中一个抑菌活性最强,甲醇诱导浓度为2.5%。5、使用500 mL锥形瓶对筛选得到最优阳性转化子进行摇瓶发酵,验证并优化其表达条件,抑菌实验结果进一步确定,最佳甲醇诱导浓度为2.5%,最佳发酵时间为96 h;经平行试验对比分析,与天然LFcinB抑菌活性相比,衍生肽抗菌活性优于LFcinB,证明了衍生肽分子设计的合理性;Tricine-SDS-PAGE检测表明,衍生肽基因已得到了有效表达;将发酵上清液进行冷冻干燥,制备含有衍生肽成分的发酵上清液冻干粉。复水后抑菌实验表明,10×浓缩液的抑菌圈直径为同体积氨苄青霉素溶液（50 mg/mL）的2.5倍,证明浓缩液抑菌活性为氨苄青霉素的2.5倍。本研究基于抗菌肽结构-功能的关系,利用生物信息学工具设计LFcinB衍生肽,并对其抗菌活性进行了分析预测,实验结果证明了衍生肽设计的合理性,衍生肽基因得到了有效的表达,研究结果为进一步扩大生产衍生肽奠定了理论基础。

摘要译文

关键词: 牛乳铁蛋白肽；毕赤酵母；衍生肽设计；抗菌肽

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被引量 4

4. 认领

【学位/硕士】 • 张娜 • 电子科技大学 • 导师：汪新艳 • 2020年

摘要：白细胞介素-15(interleukin 15,IL-15)是一种T细胞生长因子,主要在除T细胞以外的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、上皮细胞及肥大细胞等多种细胞中表达。作为一种多效细胞因子,IL-15可促进NK细胞(natural killer cells,NK)和T细胞的增殖,维持NK细胞的生存,诱导细胞毒性T淋巴细胞的产生以及刺激B细胞合成免疫球蛋白。研究者发现,在类风湿关节炎、肿瘤、炎性肠病等多种免疫相关疾病中,IL-15的表达都出现异常,提示它在人类免疫系统中发挥了重要作用。在硬骨鱼中,现有的研究主要集中在IL-15基因的克隆及其表达特征的分析,但对它的免疫调节功能还知之甚少。首先,本论文运用分子克隆技术获得草鱼IL-15(grass carp IL-15,gcIL-15)的编码序列。该序列由576个核苷酸组成,共编码191个氨基酸,其N端67个氨基酸为信号肽。生物信息学分析显示得到的gcIL-15与鱼类IL-15基因结构保守,含有6个外显子和5个内含子,其氨基酸序列上的6个半胱氨酸能够形成两对二硫键,并且gcIL-15具有典型的4个?-螺旋结构。将草鱼IL-15与斑马鱼、虹鳟、青鳉、鸡、小鼠和人等物种的IL-15进行氨基酸序列比对,其一致性在12.86%到57.14%之间,并且,系统发育树结果显示草鱼IL-15与其他鱼类IL-15聚为一枝,表明所得序列为草鱼IL-15编码序列。接下来,为研究草鱼IL-15的免疫调节功能,我们尝试用多种表达方法以期获得具有生物学活性的重组草鱼IL-15蛋白(recombinant gcIL-15,rgcIL-15)。起初,我们利用酵母表达系统表达并纯化了rgcIL-15,发现该蛋白被高度糖基化,并且与其他鱼类的IL-15不同,该种方法获得的重组蛋白不能上调草鱼头肾白细胞(head kidney leucocytes,HKLs)中IFN-?mRNA的表达,提示它不具有生物学活性。考虑可能是高度糖基化影响了rgcIL-15的活性,我们改用pET-32a(+)质粒表达系统获得了可溶形式的Trx(硫氧化还原蛋白)-rgcIL-15融合蛋白,但使用该蛋白处理草鱼HKLs时同样对IFN-?mRNA的表达无影响,说明该蛋白也无生物学活性。究其原因,猜测可能是Trx蛋白影响了rgcIL-15的活性,于是我们又使用pET-30a(+)表达系统结合变复性的方法获得了可溶形式的rgcIL-15。随后的活性验证实验结果显示该方法所获rgcIL-15能以剂量依赖的方式上调草鱼HKLs中IFN-?mRNA的表达,这与虹鳟中IL-15对IFN-?的调控是一致的,说明该方法所得的重组蛋白具有生物学活性,同时也暗示gcIL-15可能参与了由IFN-?介导的抗菌防御机制。为进一步探究IL-15在草鱼HKLs中扮演的角色,使用rgcIL-15处理草鱼HKLs 3 h和24 h后,发现gcIL-15能够显著上调HKLs中IL-6、IL-1?、IL-8、IL-10等炎症相关因子的mRNA水平,同时gcIL-15还能上调HKLs中穿孔素和颗粒酶的基因表达。以上结果首次证明了gcIL-15可诱导头肾中细胞因子的基因表达,暗示gcIL-15可能通过调控炎症相关因子的表达以及影响细胞杀伤过程等途径来发挥其免疫调节功能。本论文通过对rgcIL-15蛋白表达方式的不断优化,首次成功得到了具有生物学活性的rgcIL-15,并初步探究了它在草鱼免疫器官头肾中的作用,为后续深入研究草鱼IL-15的免疫功能打下了基础。

摘要译文

关键词: 草鱼；IL-15 ；基因克隆；真核表达；原核表达；变复性；生物学活性

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被引量 1

5. 认领

【学位/硕士】 • 胡媛媛 • 重庆科技学院 • 导师：陈波 • 2021年

摘要：由于传统抗生素的过度使用和滥用,细菌耐药性在世界范围内引起严重的健康问题,使寻找新的有效抗菌药物变得困难。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)因可以直接作为抗菌剂,又可以作为天然免疫系统的重要调节因子,无疑成为了一种很有前景的对抗多种病原微生物的抗菌药物。Hepcidin是一种抗菌肽和铁调节激素,主要是由肝脏产生并释放到血清中,在宿主的先天免疫和铁代谢中起双重作用。Hepcidin生物活性广泛,对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌均有活性,同时还具有抗病毒、抗寄生虫、抑制真菌生长等作用。但是,天然抗菌肽的稳定性差、半衰期短、毒副作用强,尤其可能具有严重的溶血活性,限制了开发利用。本课题主要开展了鱼类抗菌肽Hepcidin基因克隆,生物信息学分析,序列模板法优化设计抗菌肽以及抗菌肽在毕赤酵母中的诱导表达等研究,包括以下四个部分:第一部分是银鲫抗菌肽Hepcidin基因克隆。基于鱼类抗菌肽Hepcidin的氨基酸序列比对结果,设计简并引物。抽提银鲫组织总RNA,反转录合成c DNA;经PCR扩增后克隆至T载体,转化至感受态大肠杆菌DH5α培养,经菌落PCR及测序鉴定,成功克隆抗菌肽Hepcidin。通过NCBI的Blast在线分析工具进行多序列同源性比对,验证其序列属于鱼类Hepcidin抗菌肽,与斑马鱼序列相似性为100%。第二部分是对抗菌肽Hepcidin进行生物信息学分析。鱼类抗菌肽Hepcidin基因家族进化分析发现,Hepcidin的系统发育树主要分为三大支;其中斑马鱼与大西洋鲱鱼Hepcidin的进化关系最远,序列相似性为46.15%,与南亚野鲮Hepcidin相似性最高,为72.22%。采用ExPASy、InterPro、TMHMM2.0、TMpred、Signal P-5.0 Server和Phyre等软件和数据库对Hepcidin进行分析发现,抗菌肽Hepcidin氨基酸序列中1-24位为信号肽,25-64位为前肽,67-91位为活性肽;其信号肽位于Hepcidin抗菌肽N端并具有疏水性;在跨膜区域中,跨膜螺旋方向为膜内到膜外,由6-28位氨基酸形成螺旋,中心位点为第18位氨基酸;Hep cidin N端主要为α-螺旋,C端集中为β-折叠;成熟肽三级结构预测的置信度为98.6%,一致性为70%。第三部分是序列模板法优化设计抗菌肽Hepcidin。在Gen Bank检索抗菌肽Hepcidin序列,收集鱼类Hepcidin多肽序列,通过对天然的Hepcidin抗菌肽的比对与分析,确定结构域序列。计算结构域序列中每种氨基酸在每一位置的频率,优化得到序列模板。以得到的序列模板为基序,进行抗癌指数、溶血活性、半衰期以及细胞穿透性等参数优化。预测模板序列的抗菌活性,其具有抗肺炎克雷伯菌和抗真菌活性以及对人类红细胞具有毒性。经实验测定,优化设计筛选的多肽Hepcidin-M2R抑菌效果最佳,可降低菌液OD值93.5%。模板序列肽能有效降低菌液OD值67.9%,天然抗菌肽Hepcidin可降低菌液OD值72.2%。经SPSS分析,P<0.01,具有极显著性差异,说明优化设计的多肽抑菌效果明显。第四部分是抗菌肽在毕赤酵母中的诱导表达。利用Codon Usage Database分析并设计毕赤酵母偏好密码子序列,对银鲫抗菌肽Hepcidin的基因编码序列进行优化。将定向改造前后的抗菌肽编码序列插入毕赤酵母表达载体p PIC9K,转入酵母细胞KM71。通过缺陷型和抗性筛选,挑取高拷贝转化子,经甲醇诱导表达获得重组抗菌肽;通过抑菌实验测得的OD值比较优化前后序列的抑菌效果,发现序列优化后的多肽抑菌活性明显高于优化前,菌液OD值比优化前低27%,且G418浓度越高,筛选出的转化子抑菌活性越强。本研究克隆了银鲫抗菌肽Hepcidin基因,运用生物信息学技术分析其结构和理化性质。创新点为采用序列模板法和氨基酸突变法对抗菌肽Hepcidin进行优化和突变。实验结果表明,优化设计的抗菌肽抑菌活性增强。本研究可望为定向改造鱼类抗菌肽,并将其应用于养殖防病治病提供技术参考。

摘要译文

关键词: 抗菌肽；Hepcidin ；鱼类；生物信息学 ；序列模板法

引用

6. 认领

【学位/博士】 • Sayed Saleh（萨义德） • 中南大学 • 导师：张树冰 • 2024年

摘要：背景:乳酸脱氢酶（LDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）是氧化还原酶/脱氢酶家族的成员,主要存在于细胞质中,在微生物、植物和动物等各种生物体中发挥重要的生理功能。LDH作为无氧呼吸的终端酶,催化丙酮酸向乳酸的转化,糖酵解和LDH活性在癌症、心血管疾病和神经退行性疾病多种疾病中上调,表明LDH是治疗和干预这些疾病的潜在靶点。MDH在三羧酸循环中也扮演重要角色,使用NAD+或NADP+作为辅助因子,催化苹果酸氧化脱氢生成草酰乙酸的可逆反应。MDH也能通过与自由基结合并将促氧化剂NADH转化为抗氧化剂NADPH来抵御氧化应激反应,同时MDH与基因表达调控、细胞凋亡和细胞增殖等多种生理过程密切相关。LDH和MDH均具有高度保守的三级结构和特异性结合配体的活性位点,其功能在细胞内具有一定的互补作用,同时探索两种酶的生物学特性和干预策略具有非常重要的意义。酶的纯化在生物医学分析中十分重要,可以用于制作酶活性测量的校准曲线、动力学分析和稳定性研究以及结构分析。阴离子交换色谱、阳离子交换色谱和凝胶过滤色谱等多种方法均可用来纯化乳酸脱氢酶（LDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）并鉴定其同工酶。LDH和MDH高度保守的三级结构与其关键活性位点密切相关。研究并揭示决定各种生物体LDH和MDH结构和功能的关键保守区,以其为作用靶点,发现并鉴定新的抑制性化合物具有非常重要的应用价值。因此,亟需开发能够选择性结合LDH和MDH活性位点,进而特异性抑制酶活的生物活性物质。 Warburg效应是一种代谢重编程,是指癌细胞即使在氧气不足的情况下也偏好使用糖酵解作为能量产生的主要途径,这与正常细胞主要依赖氧化磷酸化产生能量有所不同。在这种缺氧的代谢状态下,LDH和MDH在维持癌细胞生长和增殖所必需的快速糖酵解中扮演着关键角色:LDH有助于再生NAD,而MDH产生的苹果酸有助于补充胞质NAD。但是目前有关LDH和MDH在癌细胞代谢中的研究相对较少,为探索癌症治疗和干预提供了新的方向。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一,约占原发性肝癌病例的75%。多激酶抑制剂（multikinase inhibitors,MKIs）如索拉非尼和利凡替尼是目前广泛使用的HCC治疗药物,但其治疗效果有限,许多患者会产生耐药性。而天然化合物在靶向参与HCC进展的多条信号通路中发挥功能,而且产生耐药性的风险较低,同时比合成替代品产生更少的副作用。特别是芒果苷和木犀草素已经成为具有多方面抗癌活性的天然化合物,它们影响多种癌细胞的生长和信号传导过程,具有进一步研究和应用于癌症的治疗和干预的价值。因此将天然化合物纳入HCC治疗方案是一种创新的治疗策略,可以避免MKI的耐药性、增强疗效、减少副作用,并改善患者预后。在药物发现和化学建模过程中,计算工具,如分子对接和分子动力学模拟,已经变得至关重要。分子对接是探索配体-蛋白质相互作用的有效方式,并基于结合亲和力对化合物进行排名,有助于药物的合理设计。分子动力学（Molecular dynamics,MD）模拟提供了对分子行为的详细分析,提供了原子水平上热力学和动力学的全面理解。当应用于乳酸脱氢酶（LDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）等酶时,MD模拟可以提供有效分析,更深入了解分子水平上的药物相互作用机制。目标:本研究的主要目的是（1）对从细菌菌株中获得的LDH和MDH进行纯化和表征,识别能够有效靶向LDH和MDH的特定抑制剂化合物,重点关注来源于植物的生物活性化合物。（2）评估这些抑制剂的治疗潜力,判断它们抑制LDH和MDH的效力,评估它们作为潜在抑制剂的抗菌效果。（3）探究细菌LDH和MDH的结构和功能特性,与人类LDHA和MDH1酶进行比较,分析不同物种间活性位点的保守性,并评估潜在抑制剂在靶向肝癌细胞代谢相关的LDHA和MDH1酶中的作用,特别是它们在糖酵解和能量产生中的作用。实验设计:该研究首先从埃及开罗卡卢比亚不同地点采集1克土壤样本用于培养不同的微生物,从中分离出细菌菌株NRC1-NRC11。然后使用Gene JET基因组DNA纯化试剂盒进行基因组DNA的提取,以确保DNA样本的完整性和纯度。随后利用引物8F和1492R在优化条件下对16S rRNA基因进行扩增,并对PCR产物进行测序。通过Finch TV进行数据调整,使用BLASTN进行物种鉴定,利用Clustal W 2.1进行序列比对,并使用MEGA11软件通过邻接法构建系统发育树,重点关注来自B.cereus的LDH和MDH基因。我们将这些基因扩增、纯化、连接到pTZ57R/T质粒载体,转化到大肠杆菌DH5αTM中,通过蓝白筛选和测序证实这些基因成功转化到细菌质粒中,利用BLAST分析进一步阐明其基因结构。使用Modeller v9.20进行同源建模,构建LDH和MDH的三维模型,然后使用AutoDock Vina和AutoDock工具4.2进行分子对接,以评估其与芒果苷和木犀草素的相互作用,阐明其抑制作用的分子机制。通过硫酸铵沉淀和各种色谱技术对Bc-LDH和Bc-MDH酶进行纯化,随后进行酶活性测量,使用凝胶过滤确定分子量和使用SignalP、ExPASy进行理化性质评估,以深入了解酶特性。使用Desmond软件进行分子动力学模拟,以研究蛋白质-配体的相互作用。此外,采用Lineweaver-Burk和Dixon图的动力学研究结果证实芒果苷和木犀草素的抑制潜力。该研究通过使用肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞模型进行细胞水平的研究,以探索抑制剂的效果。HepG2和Huh7铺板后,使用CCK-8和克隆形成实验评估抑制剂对细胞活力和增殖的影响。此外,利用流式细胞仪分析细胞周期和凋亡,使用Western Blot检查蛋白表达水平的变化。结果:本研究从土壤中分离出NRC1-NRC11细菌菌株,不同菌株之间LDH和MDH活性表现出显著差异。其中,NRC1的酶活性最高,LDH为1.1 U/mg/ml,MDH为0.96 U/mg/ml。使用通用引物对其16S r DNA基因的片段进行测序后发现,NRC1为枯草芽孢杆菌（Bacillus cereus）,该序列与已知的枯草芽孢杆菌菌株B.cereus ATCC和B.cereus菌株CCM 201的同源匹配度分别达到了99.04%和99.33%。NRC1的DNA序列在Gen Bank的编号为ON231812。紧接着,编码枯草芽孢杆菌乳酸脱氢酶（Bc-LDH）和苹果酸脱氢酶（Bc-MDH）的基因被成功扩增、克隆进p TZ57R/T质粒。 Bc-LDH酶的纯化过程包括硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素、CM-纤维素色谱,以及Sephacryl S-300色谱,最终纯化提高25.5倍,得到22.7单位/毫克蛋白的比活性。Bc-MDH也采用了类似的纯化步骤,但没有进行CM-纤维素色谱纯化,最终纯化提高30.2倍,得到33.3单位/毫克蛋白的比活性。SDS-PAGE表明Bc-LDH和Bc-MDH的分子量分别为35 kDa和37 kDa。Bc-LDH在pH 8.0时显示出最佳活性,以丙酮酸钠和NADH作为首选底物;相比之下,Bc-MDH在pH 9.5时最为理想,偏好苹果酸和NAD作为底物。本研究还探讨了二价阳离子和抑制剂对酶活性的影响。二价阳离子如CoCl2和MgCl2激活了Bc-LDH,而各种抑制剂对两种酶均有不同的影响。其中,重铬酸钾和叠氮化钠显著抑制了Bc-LDH的酶活性,过氧化氢和碘乙酰胺对抑制Bc-MDH的酶活性最有效。此外,本研究发现芒果苷是Bc-LDH的有效抑制剂,而木犀草素对Bc-MDH有效。这些发现证实利用特定抑制剂靶向LDH和MDH的治疗潜力。本研究检测了芒果苷和木犀草素抑制枯草芽孢杆菌生长的能力。结果显示,芒果苷和木犀草素对枯草芽孢杆菌的生长均表现出明显的抑制作用,随着浓度的增加,抗菌活性增强,呈剂量依赖性。这些发现表明,芒果苷和木犀草素对枯草芽孢杆菌具有潜在的抗菌活性,可以作为治疗该细菌引起的感染的候选药物。值得注意的是,人类乳酸脱氢酶（LDHA）和枯草芽孢杆菌乳酸脱氢酶（Bc-LDH）之间,以及人类苹果酸脱氢酶（MDH1）和枯草芽孢杆菌苹果酸脱氢酶（Bc-MDH）之间虽然在整体结构上存在差异,但这些酶展现出相似的活性位点结构,可以执行类似的生化反应。这种显著的相似性表明不同物种之间共享了同一个保守的作用机制,突出了这些酶在代谢途径中的进化意义。通过高级对接分析发现,芒果苷和木犀草素分别对LDH和MDH展示出较强的结合亲和力,这种结合主要通过与对酶功能至关重要的特定氨基酸形成氢键来实现。此外,分子动力学模拟（MD）也证实这些化合物与酶之间相互作用的稳定性,这些发现表明,芒果苷和木犀草素可以有效地抑制LDH和MDH,破坏癌症进展中的代谢途径。此外,芒果苷表现出剂量依赖的细胞毒性效应,其中Huh7细胞比HepG2细胞更加敏感。芒果苷还诱导细胞凋亡,特别是在HepG2细胞中,导致细胞周期阻滞在G0/G1期。Western blotting证实芒果苷与凋亡标志物和细胞周期蛋白的表达变化相关联。木犀草素对Huh7和HepG2细胞展示了剂量和时间依赖的细胞毒性效应,并在克隆形成实验中表现出抗增殖效果。木犀草素还具有诱导凋亡和阻遏细胞周期的潜在能力,暗示其具备治疗肝癌的潜力。Kaplan-Meier生存分析发现,LDHA或MDH1高表达的患者死亡率增加了50%,说明患者LDHA和MDH1高表达与生存率的显著降低正相关,是重要的预后指标。讨论:本研究克隆到埃及土壤中不同的菌株,并鉴定其LDH活性,发现其中一个菌株表现出最高的LDH活性,命名为NRC1。我们利用包括16s r DNA测序在内的分子分析手段确认了NRC1是B.cereus的一员,并在分类上与芽孢杆菌属存在密切联系。生物信息学分析将Bc-LDH-NRC1划分为已知的L-LDH蛋白家族成员,并发现其与芽孢杆菌LDH蛋白具有很高的序列相似性。从B.cereus中纯化得到的LDH具有四聚体结构,在pH 5.5～9.0具有稳定性。此外,芒果苷在体外对Bc-LDH-NRC1表现出显著的抑制潜力,表明其作为治疗性抑制剂的实用性。这些发现为深入了解LDH生物学意义、开发新型抗菌药物和酶抑制剂提供理论依据。对Bacillus cereus NRC1中MDH基因进行克隆和生物信息学分析,发现Bc-MDH与同源蛋白之间的高度序列相似性和系统发育关系,为了解其功能特性和进化起源提供了帮助。结构预测和分子建模技术进一步阐明了Bc-MDH的三维结构,有助于木犀草素等潜在抑制分子的鉴定。从Bacillus cereus NRC1中纯化和表征的MDH,显示其四聚体结构、最佳pH和金属离子敏感性,为其酶性质和潜在调控机制提供了宝贵的见解。此外,通过分子对接和动力学模拟证明了木犀草素对Bc-MDH-NRC1的抑制潜力,突显了其作为治疗性抑制剂的前景。这些发现有助于我们了解MDH生物学意义,并为开发针对Bacillus cereus等致病菌的MDH新型抗菌药物和酶抑制剂奠定了基础。该研究深入探讨了天然化合物,特别是芒果苷和木犀草素对癌细胞代谢中关键酶（LDHA和MDH1）的抑制潜力。分子对接研究揭示了芒果苷与LDHA、木犀草素与MDH1之间的特异性相互作用,提示它们成为抑制剂的潜力。分子动力学模拟进一步证实其相互作用的稳定性和亲和力。随后细胞实验表明,芒果苷和木犀草素能够调节LDHA和MDH1的活性,从而影响肝癌细胞生长,并诱导凋亡和阻滞细胞周期,不同细胞系中反应的差异性体现了这些化合物抑制效应的细胞类型依赖性。此外,该研究阐明癌细胞中较高的LDHA和MDH1活性与糖酵解途径相关,暗示了以其为靶点破坏癌细胞代谢的潜在治疗策略。本研究为了解芒果苷和木犀草素的抗癌机制提供了宝贵的见解,强调了它们通过影响代谢途径发挥癌症治疗作用的潜力。结论:本论文重点从Bacillus cereus中进行Bc-LDH和Bc-MDH酶的分离、纯化、克隆及特性分析,

摘要译文

关键词: 乳酸脱氢酶；苹果酸脱氢酶；芒果苷；木犀草素；肝细胞癌

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7. 认领

【学位/博士】 • 曲海东 • 厦门大学 • 导师：王克坚 • 2012年

摘要： Hepcidin是一类富含半胱氨酸残基的抗菌肽家族，现在已经被证实存在于多种鱼类中并且有多变体现象。Hepcidin具有广谱的抗微生物、抗病毒和肿瘤细胞的活性，还是维持机体铁稳态的重要的调控因子。鱼类Hepcidin在水产养殖中具有较广阔的应用前景。本研究通过分子生物学技术，从我国海水养殖斜带石斑鱼（Epinepheluscoioides）中获得抗菌肽Hepcidin基因，并揭示其表达特性，丰富我们对斜带石斑鱼先天免疫系统和先天免疫机制的认识。在此基础上，利用基因工程表达技术建立斜带石斑鱼Hepcidin的高效表达载体，研究其基因表达产物的抗菌活性，并研究口服灌胃表达产品对斜带石斑鱼的生理影响。主要研究成果如下:　　 1.克隆获得源于斜带石斑鱼Hepcidin基因序列。利用分子生物学技术从海水养殖斜带石斑鱼肝脏RNA中克隆获得3条Hepcidin基因变体，EC-Hepcidin1、EC-Hepcidin2和EC-Hepcidin3。通过RACE技术获得了这3条变体的全长cDNA序列。从斜带石斑鱼肝脏基因组DNA中克隆获得了这3条变体的基因组DNA序列以及EC-Hepcidin1和EC-Hepcidin3基因组DNA上游调控区序列。这3条Hepcidin变体基因序列和基因结构有很高的相似性，均由3个外显子和2个内含子组成。生物信息学分析表明这3条Hepcidin变体编码的多肽均由信号肽、前导肽和成熟肽组成。成熟肽中均含有4个半胱氨酸残基，并且处于保守位点上。　　 2.揭示了EC-HepcidinmRNA的体内组织器官分布和在病原诱导下的表达特性。利用Real-timePCR检测EC-HepcidinmRNA在斜带石斑鱼各组织器官中的分布，结果显示在所有测定的组织器官中均有检测到EC-Hepcidin的表达，其中肝脏的表达量最高，是在其他组织器官中表达量的3000-1000000倍。揭示了EC-Hepcidin是斜带石斑鱼肝脏特异性表达的基因。检测了细菌感染后斜带石斑鱼肝脏中EC-HepcidinmRNA的表达变化。健康的斜带石斑鱼在经过腹腔注射后，在细菌感染、福尔马林灭活菌刺激和生理盐水对照3个处理组中，肝脏EC-HepcidinmRNA均受到细菌和灭活菌不同程度的诱导而上调表达，分别在处理后12-24h及12h达到最高点。说明Hepcidin是斜带石斑鱼先天免疫的重要效应分子，可以在抵抗外界刺激的过程中起到重要作用，对机体起保护作用。　　 3.重组表达获得EC-proHep3原核表达产物，研究其体外抗菌活性和杀菌动力学曲线。优化条件得到pET-28a/EC-proHep3(Rosetta)原核表达体系，可获得可溶性重组蛋白EC-proHep3，经一次亲和纯化后即获得目的蛋白纯品，分子量为12kDa，产量32.4mg/L菌液。体外抗菌实验结果显示，原核表达EC-proHep3能选择性地抑制革兰氏阳性和阴性菌，杀菌动力学曲线显示12μM的纯化重组蛋白EC-proHep3能够在60min杀灭全部金黄色葡萄球菌，30min杀灭全部施氏假单胞菌。　　 4.揭示EC-Hepcidin蛋白体内组织器官分布特点。利用EC-proHep3重组表达纯化产物免疫Balb/c小鼠制备EC-proHep3多克隆抗体。通过间接ELISA法和westernblot法对抗体效价和抗体特异性进行检测，结果显示EC-proHep3多克隆抗体具有较高效价，可特异与EC-proHep3重组表达产物结合，满足后续实验需要。利用EC-proHep3抗体，通过SDS-PAGE、Westernblot检测了EC-Hepcidin蛋白体内组织器官表达情况，发现在肝脏和肠道可检测到Hepcidin蛋白。其中肝脏检测到前多肽原和前体肽蛋白两种形式的Hepcidin，而肠道检测到较多Hepcidin前体蛋白。　　 5.口服EC-proHep3重组纯化产物，分析鱼体免疫基因和铁调节相关基因mRNA表达情况，并揭示单次灌胃EC-proHep3不会对机体造成氧化损伤和组织结构损伤。使用Real-timePCR检测口服灌胃EC-proHep3重组纯化产物0h、3h、6h、12h、24h和48h免疫相关基因TNFα-1、TNFα-2、IL1β、IL8和P65在肠道器官中的表达状况，结果表明所测定的免疫相关基因的口服抗菌肽组与溶剂PBS组没有显著性差异。通过对肝脏和肠道铁代谢相关基因FerroportinmRNA的检测发现，肝脏中Ferroportin在3-24h呈现出先抑制而后逐渐升高的趋势，48h达到最高。肠道Ferroportin基因在3h被显著抑制，并继续呈现基因表达下调的趋势。通过血清MDA的检测和肠道组织切片HE染色观察得到，单次灌胃EC-proHep3蛋白100μg/尾，血清中MDA含量无显著变化，肠道组织结构未受到影响。

摘要译文

关键词: 斜带石斑鱼；抗菌肽；Hepcidin基因 ；重组表达；口服灌胃；口服免疫

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