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【期刊论文】 • 姚永鹏张子昌许可朱慧 +4位作者 • 《中国生物制品学杂志》 • 2024年第7期 795 - 800，共6页

摘要：目的 制备新型ACYW135群脑膜炎球菌-白喉毒素无毒变异体(cross-reacting material 197,CRM197)结合疫苗,并评价其免疫原性,以期为流行性脑脊髓膜炎的防控奠定基础。方法用1-氰基-4-(二甲氨基)吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)分别将A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖羟基活化为氰基,并以己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)作为连接剂与活化多糖通过氰酸酯连接,生成裸露酰肼基的多糖-ADH衍生物,再通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐[4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl morpholinium chloride,DMTMM]与CRM197生成酰胺键偶联,得到各单价结合物原液,并进行相关检测。将单价结合物原液按一定比例混合后,分别加入3种冻干保护剂(蔗糖溶液、乳糖溶液及蔗糖+甘露醇溶液),经冻干,制备3种ACYW135-CRM197结合疫苗。将制备的疫苗于0、14 d经雄性NIH小鼠背部皮下注射,0.2 mL/只,每组10只,并于初次免疫后21 d,经小鼠颌下静脉采血,分离血清,ELISA法检测特异性抗体水平。结果 A、C、Y、W135-CRM197单价结合物原液的检测结果均符合质量标准。ACYW135-CRM197疫苗成品可与各群多糖抗血清形成明显沉淀线;平均分子量均在1 680 000~5 230 000范围内。3种ACYW135-CRM197结合疫苗的抗A、C、Y、W135群多糖IgG抗体阳转率均为100%;ACYW135-CRM197(蔗糖)、ACYW135-CRM197(乳糖)和ACYW135-CRM197(蔗糖+甘露醇)组比较,差异均无统计学意义(t=0.249~1.157,P均> 0.05)。结论本研究制备了新型ACYW135-CRM197结合疫苗,且该疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性。

摘要译文

关键词: 脑膜炎球菌 ；白喉毒素无毒变异体 ；结合疫苗 ；免疫原性

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【期刊论文】 • 张营营蔡路奎姜博毕研伟 +5位作者 • 《中国生物制品学杂志》 • 2012年第10期 1248 - 1253，共6页

机构： [1] 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所

摘要：目的制备A群膜炎球菌多糖(Group A meningococcal polysaccharide,GAMP)-白喉毒素无毒变异体CRM197(Cross-reactive material 197)结合物,并分析其理化性质及免疫学特性。方法白喉棒状杆菌C7 M1菌株经发酵培养表达CRM197,表达产物经DEAE-4FF层析柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。用溴化氰(CNBr)活化GAMP,己二酰肼(ADH)为连接剂,在碳二亚胺(EDAC)催化下将GAMP与CRM197共价结合,制备GAMP-ADH-CRM197结合物,经Sepharose 4FF层析柱纯化后,进行各项生化检测,采用免疫双扩散检测结合物的抗原性,将结合物皮下注射ICR小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMP的抗体滴度,分析其免疫原性。结果发酵培养20 h时,菌液上清中的CRM197蛋白表达量最高;CRM197以分泌形式表达,纯化后纯度达95%以上,可与白喉类毒素单抗发生特异性反应;GAMP-ADH-CRM197结合物各项生化指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求,与A群流脑诊断血清形成明显的沉淀线,结合物诱生的多糖特异性抗体滴度显著高于多糖组和混合物组。结论成功制备了GAMP-ADH-CRM197结合物,其具有良好的抗原性和免疫原性,为以CRM197为蛋白载体制备脑膜炎球菌结合疫苗奠定了基础。

摘要译文

关键词: A群脑膜炎球菌 ；多糖；白喉毒素 ；CRM197 ；变异体 ；结合物；载体蛋白

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被引量 3

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【期刊论文】 • 陈玉秋张梦霏何建东陶佳明 +4位作者 • 《中国生物制品学杂志》 • 2014年第4期 441 - 443，共4页

机构： [1] 云南沃森生物技术股份有限公司

摘要：目的探讨以天然白喉毒素无毒变异体蛋白CRM197和破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)为载体的Y群脑膜炎球菌多糖(group Y meningococcal polysaccharide,MenYPS)结合蛋白对小鼠的免疫原性。方法将MenYPS用1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)进行衍生,制备MenYps-ADH衍生物,将MenYPS-ADH衍生物在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的作用下,分别与CRM197和TT共价结合,制备3批MenYPS-CRM197和MenYPS-TT结合物,采用琼脂双扩散法检测结合物中多糖抗原的血清型特异性。经BALB/c小鼠大腿内侧皮下注射制备的衍生物及结合物,2.5μg/只,0、14、28 d各免疫1次,分别于第7、21和35天经小鼠眼眶采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清GMT。参考《中国生物制品规程》(2000版)进行无菌试验及异常毒性试验。结果制备的3批MenYPS-CRM197和MenYPS-TT结合物可与MenYPS诊断血清产生沉淀线。MenYPSTT和MenYPS-CRM197免疫小鼠3次后,均产生较高的滴度,MenYPS-TT和MenYPS-CRM197结合物第2、3次免疫小鼠后产生的GMT均明显高于MenYPS-ADH衍生物,差异有统计学意义(P均<0.05),而两种结合物GMT差异无统计学意义(P均>0.05);MenYPS-TT和MenYPS-CRM197结合物第2次免疫后产生的GMT均明显高于第1次免疫后,第3次免疫后明显高于第2次免疫后,差异均有统计学意义(P均<0.01)。无菌试验符合《中国生物制品规程》(2000版)相关要求;异常毒性试验中,豚鼠和小鼠观察7 d后,均无异常反应,体重增加,无死亡。结论 MenYPS与CRM197和TT的结合物均能诱导BALB/c小鼠产生较高的抗体水平,且产生了免疫记忆。

摘要译文

关键词: 脑膜炎球菌多糖；CRM197 ；破伤风类毒素；结合物；免疫原性

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【期刊论文】 • 王春娥

叶强李凤祥 • 《中国生物制品学杂志》 • 2008年第8期 687 - 691，共5页

机构： [1] 中国药品生物制品检定所菌种室

摘要：目的表达白喉毒素无毒变异体CRM197,并考察其载体作用。方法利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达CRM197,用金属镍离子亲和层析纯化;以重组CRM197为蛋白载体,在EDAC的作用下,与活化的A群脑膜炎球菌荚膜多糖(GAMP)结合,制备GAMP-rCRM197结合物,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法测定血清中A群脑膜炎球菌多糖特异性IgG抗体,并分析其免疫原性。结果重组CRM197在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的25%左右;Western blot证明重组CRM197具有良好的反应原性;各针接种后,结合物诱生的多糖特异性IgG水平均显著高于GAMP组和GAMP+rCRM197混合物组,具有较强的免疫原性;多次接种产生了免疫增强效应,重组CRM197具有载体蛋白的作用。结论已在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组CRM197,以纯化的重组CRM197作为载体制备的GAMP-rCRM197结合物具有良好的免疫原性,为以重组CRM197为蛋白载体制备其他结合疫苗奠定了实验基础。

摘要译文

关键词: 白喉毒素 ；无毒变异体 ；CRM197 ；载体蛋白；结合疫苗 ；A群脑膜炎球菌

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【学位/硕士】 • 王春娥 • 中国药品生物制品检定所 • 导师：李凤祥 • 2007年

摘要： 脑膜炎奈瑟菌是儿童细菌性脑膜炎和败血症的重要病原体。用安全有效的疫苗免疫接种是主要的预防措施，以荚膜多糖为抗原成分的多糖疫苗在2岁以下婴幼儿中免疫效果不理想，即使在成人中也仅能产生短期、中等强度的保护作用。研究证明将多糖与蛋白质载体共价偶联形成结合疫苗，使多糖由T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原，能够增强多糖的免疫原性。国内研制结合疫苗多采用破伤风类毒素，为破伤风毒素经甲醛处理得到，制备时需要处理大量的毒素上清液，而且类毒素存在毒性回复的危险。使用无毒性的蛋白是十分有必要的。CRM197为白喉毒素的无毒变异体，具有良好的免疫原性和安全性，作为蛋白载体在国外得到广泛应用。目前，国内尚无以CRM197为载体的结合疫苗的研制。本实验利用基因工程技术在大肠杆菌中对CRM197进行了表达，将重组CRM197作为蛋白载体，制备了A群脑膜炎球菌多糖结合物，并对其免疫原性进行了初步研究。第一部分：以C7／β197株的基因组DNA为模板，根据GenBank中白喉毒素的基因序列（K01722）设计引物，运用PCR技术扩增crm197基因。构建PCR2.1-TOPO／crm197重组克隆质粒，双酶切鉴定后，筛选阳性克隆进行基因测序分析，然后将序列正确的crm197基因克隆入表达载体pET28a中，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。结果显示重组CRM197主要以包涵体形式表达，表达量占全菌体蛋白的25％左右。用金属镍离子亲和层析进行纯化，重组CRM197纯度达到95％以上，产量约为50mg／L工程菌培养物。免疫印迹法证明重组CRM197具有良好的抗原性。第二部分：用溴化氰活化A群脑膜炎球菌荚膜多糖，以ADH作为连接剂，以重组CRM197为蛋白载体，在EDAC的作用下制备GAMP-rCRM197结合物；结合物经凝胶过滤层析纯化后，收集结合物组份分别测定多糖和蛋白质含量，计算得出结合物产率为26.9％，多糖／蛋白质比值为0.31；免疫双扩散试验证明结合物能够分别与A群流脑诊断血清和白喉抗毒素产生沉淀线，说明结合物偶联成功，并具有良好的抗原性。将GAMP、GAMP+rCRM197混合物和GAMP-rCRM197结合物分别经皮下免疫接种Balb／c小鼠（18-20g），免疫剂量为2.5μg多糖／只。间接ELISA法测定血清中A群脑膜炎球菌多糖特异的IgG抗体。结果表明各针接种后结合物诱生的多糖特异性IgG水平显著高于两对照组，具有较强的免疫原性；而且，多次接种产生了免疫增强效应，说明能够激发免疫记忆，使多糖实现了由T细胞非依赖性抗原向T细胞依赖性抗原的转变，初步证明重组CRM197在结合物中能够起到载体蛋白的作用。本研究应用基因工程技术获得了能够产生重组CRM197的工程菌菌株，并将纯化的目的蛋白作为载体与A群脑膜炎球菌多糖偶联制成了GAMP-rCRM197结合物，动物实验证明具有良好的免疫原性。为进一步以重组CRM197为载体制备其它结合疫苗奠定了基础。

摘要译文

关键词: ARM197 ；白喉毒素 ；克隆和表达；蛋白载体；结合疫苗 ；A群脑膜炎球菌疫苗

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