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摘要： 从柳穿鱼全草中分离到一神经酰胺成分 ,通过化学方法和1H NMR ,13 C NMR ,1H 1HCOSY ,HMQC ,HMBC及MS波谱分析 ,确定其结构为 (2S ,3S ,4R ,8E) 8,9 二脱氢植物鞘氨醇(2′R) 2′ 羟基脂肪酰胺 ,其中脂肪酸链主要由二十二 ,二十三 ,二十四和二十五烷酸组成 .
关键词: 柳穿鱼 ；神经酰胺 ；植物鞘氨醇 ；中药 ；化学成分
被引量
26
摘要： 该研究运用硅胶柱层析法,结合超高效液相色谱-高分辨串联质谱联用技术以及核磁共振氢谱/碳谱等鉴定方法,从密生波罗花中分离鉴定了一组以神经酰胺为主的混合物,其中,神经酰胺类成分含量为81.53%,并对其抗炎作用进行了初步评价。噻唑蓝(MTT)检测结果显示低浓度的密生波罗花神经酰胺(6.25~50μg/mL)对RAW264.7的细胞活性没有显著影响。密生波罗花神经酰胺能显著减少脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞一氧化氮(NO)的释放量,且当浓度为100μg/mL时,对NO释放的抑制率最高,为91.07%±0.11%。密生波罗花神经酰胺能高效抑制LPS诱导RAW264.7细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及一氧化氮合酶(iNOS)等炎症因子的mRNA表达水平,显著降低LPS诱导RAW264.7细胞中核因子κB抑制蛋白α(IκBα)、丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)及AKT蛋白的表达及磷酸化水平。结果表明密生波罗花神经酰胺具有显著的抗炎活性,并可通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路发挥其抗炎作用,可为相关保健食品开发和该植物资源的合理利用提供一定的科学依据和数据支撑。
关键词: 密生波罗花 ；神经酰胺 ；细胞因子 ；抗炎 ；PI3K/AKT信号通路
被引量
3
摘要： 目的优化银柴胡脂质成分超临界CO_(2)萃取工艺并分析萃取物成分。方法采用Box-Behnken响应面法优化银柴胡脂质成分超临界CO_(2)萃取工艺,确定最佳工艺参数,并应用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS对萃取物进行分析。结果经优化后最佳萃取条件:萃取压力35 MPa,萃取温度47℃,萃取时间3 h,在此条件下萃取得率为(0.332±1.31)%。鉴定分析结果显示银柴胡脂质成分含有甘油磷脂、鞘脂、甘油酯、固醇类、孕烯醇酮脂、脂肪酰、糖脂7大类,29亚类,2542个脂质分子,其中固醇类相对含量最高为88.29%,并首次发现银柴胡中含有植物甾醇酯、酵母甾醇及神经酰胺类成分。结论优化后的萃取工艺和成分分析结果可为银柴胡药效物质研究及其进一步开发利用奠定基础。
关键词: 银柴胡 ；超临界CO_(2)萃取 ；Box-Behnken响应面法 ；脂质 ；UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS
被引量
8
摘要： 烟草中的糖苷化合物是非常重要的香气前体物质,了解糖苷化合物的种类和结构对于烟草的种植和加工均有重要意义。该文基于糖苷化合物在质谱分析中的特征中性丢失和非靶向液相色谱-质谱分析技术,建立了一种对烟草中糖苷化合物进行筛选和鉴别的方法。共筛选出60种糖苷化合物,其中糖元部分主要由己糖、脱氧己糖或两者的二糖或三糖组成。对苷元的二级质谱碎片离子进行了详细的结构解析,结合文献资料和现有数据库共鉴定出酚酸类、黄酮类、生物碱类、萜烯类、固醇脂类及神经酰胺类苷元共23种结合态糖苷化合物。所发现的糖苷化合物种类丰富,为后续研究烟草的香气成分及其影响因素提供了重要的物质基础。
关键词: 糖苷 ；烟草 ；液相色谱-质谱联用 ；特征中性丢失
被引量
2
摘要： 目的:探索链脲佐菌素(STZ)复合光化学法诱导脑梗死气阴两虚证小鼠模型的制备方法,并对所建立的模型进行生物学基础评价。方法:将40只C57BL6/J小鼠随机分为正常组和模型组,每组20只。正常组不予处理,模型组腹腔注射STZ(55 mg·kg^(-1)),每日1次,连续5 d。STZ诱导结束14 d后,随机取10只正常组小鼠分为光化学组,随机取10只模型组小鼠分为STZ+光化学组。采用玫瑰红溶液注射(125 mg·kg^(-1))结合520 nm激光照射,造成小鼠血栓并诱发小鼠脑梗死。通过一般状态观察及体质量,抓力,肛温,行为学实验,能量代谢笼,舌象红(R)、蓝(B)、绿(G)值,三磷酸腺苷(ATP)含量,促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、三碘甲状腺原氨酸(T3)水平等方法评价小鼠气阴两虚证的证候指标变化;通过检测小鼠血清氧化应激超氧化物歧化酶(SOD)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,结合Bederson评分评价小鼠的脑梗死病理变化。最后采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)检测小鼠内源性代谢物,通过最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)进行多元统计分析,设定数据筛选标准为变量重要性投影(VIP)值>1、差异倍数(FC)<0.8或>1.2、P<0.05,获取差异代谢物,利用Metabo Analyst 3.0网站进行差异代谢物的通路富集,探究脑梗死气阴两虚证小鼠的代谢轮廓变化及生物学基础。结果:证候指标方面,与正常组比较,模型组小鼠体质量降低,肛温升高,肢体运动能力和能量代谢效率降低,ATP含量降低,舌面R、G、B值降低,血糖回调速度降低(P<0.05,P<0.01)。疾病指标方面,与正常组比较,光化学组和STZ+光化学组Bederson评分升高、抓力降低、SOD水平降低、炎症因子水平升高(P<0.05)。代谢组学检测结果显示,各组小鼠间成分分离模式良好,成分存在明显差异,对质谱数据进行鉴定,共得到脑梗死气阴两虚证小鼠差异代谢物44个,其中上调的代谢物32个,主要为甘油三酯类、甘油二脂类、磷脂类和神经酰胺类代谢物;下降的代谢物有12个,主要为氨基酸类和磷酸类代谢物。对上述差异代谢物进行通路富集,发现其代谢通路主要富集于叶酸生物合成、萜类骨架生物合成、甘油磷脂代谢、维生素B6代谢、甘油脂类代谢和鞘脂类代谢通路,上述通路涉及脂质转运、胰岛素抵抗和能量代谢等多个过程。结论:STZ注射复合光化学诱导法能够成功建立脑梗死气阴两虚证小鼠模型,并干预叶酸生物合成、萜类骨架生物合成、甘油磷脂代谢、维生素B6代谢和甘油脂类代谢通路等体内过程。
关键词: 光化学法 ；脑梗死 ；气阴两虚证 ；病证结合 ；代谢组学 ；链脲佐菌素(STZ)
被引量
2
摘要： 基于细胞代谢组学技术研究竹节参总皂苷改善HepG2细胞脂质代谢的机制。应用棕榈酸和油酸诱导HepG2细胞脂质沉积模型,竹节参总皂苷干预24 h后进行油红O染色和甘油三酯分析。采用改良的Bligh-Dy⁃er法将细胞内源性代谢物分为极性和非极性部位,运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF MS)技术检测代谢物,结合多元统计分析和火山图筛选差异代谢物,并富集代谢通路。结果显示,竹节参总皂苷可显著改善HepG2细胞脂质沉积模型的脂质代谢。从极性部位鉴定了34个差异代谢物,主要为脂肪酸和氨基酸类成分;从非极性部位鉴定了28个差异代谢物,主要为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、神经酰胺类成分。差异代谢物在竹节参总皂苷干预后均有恢复至正常水平的趋势。该研究提示竹节参总皂苷改善HepG2细胞脂质沉积模型的脂质代谢与调控鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢、炎症反应密切相关。
关键词: 竹节参总皂苷 ；HepG2细胞 ；脂质代谢 ；细胞代谢组学 ；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱
被引量
4
摘要： 目的:运用分子对接技术筛选金银花抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)潜在活性成分,为发现抗SARS-CoV-2先导化合物以及揭示金银花抗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的物质基础提供参考。方法:在文献总结并结合中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库检索的基础上,建立涵盖金银花中382个化合物的化学成分库,以SARS-CoV-23CL水解酶(3CL Protease,Mpro)以及SARS-CoV-2与血管紧张素转换酶2(ACE2)复合物为分子对接靶标,利用Discovery Studio软件进行分子对接,以打分值大小筛选抗SARS-CoV-2潜在活性成分。结果:金银花中三萜皂苷类成分与SARS-CoV-2 Mpro有较强的结合力,以SARS-CoV-2 Mpro晶体结构复合的原抑制剂N3为阳性对照,7个化合物为其潜在抑制剂;环烯醚萜类和神经酰胺类成分对SARS-CoV-S/ACE2复合物的阻断较好,保留打分值前3%的化合物,10个化合物可作为SARS-CoV-S/ACE2复合物的潜在阻断剂。结论:从金银花中发现16个潜在抗SARS-CoV-2活性成分。本研究为阐明金银花抗击COVID-19的药效物质基础提供参考,同时为发现新的抗SARS-CoV-2先导化合物指明方向。
关键词: 金银花 ；新型冠状病毒肺炎 ；分子对接 ；新型冠状病毒Mpro ；SARS-CoV-S/ACE2复合物 ；三萜皂苷 ；环烯醚萜 ；神经酰胺
被引量
15
摘要： 目的对芫花Daphne genkwa的花蕾进行化学成分研究。方法应用乙醇加热回流提取芫花,采用硅胶柱色谱、大孔吸附树脂以及制备液相等技术分离并纯化化合物,根据理化性质及波谱数据进行结构鉴定。结果从芫花中共分离鉴定了23个化合物,其中神经酰胺类1个:(2S,3S,4R,8E)-2-[(2′R)-2′-羟基二十二烷酸酰胺]-十八烷-1,3,4-三醇(1);三萜类2个:木栓酮(2)、δ-香树酯酮(3);甾体类2个:5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(4)、7α-羟基谷甾醇(5);黄酮类12个:洋芹素-7,4′-二甲醚(6)、金合欢素(7)、芫花素(8)、芹菜素(9)、3′-羟基芫花素(10)、椴苷(11)、3,7-二甲氧基-5,4′-二羟基黄酮(12)、7-甲氧基-木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(13)、芫花素-4′-O-β-D-芸香糖苷(14)、芫花素-5-O-β-D-葡萄糖苷(15)、木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(16)、芫花素-5-O-β-D-茜黄樱草糖苷(17);苯丙素类3个:西瑞香素(18)、丁香树脂醇(19)、浙贝素(20);二芳基戊烷类2个:瑞香醇酮(21)、瑞香烯酮(22);叶绿素类1个:173-脱镁叶绿素乙酯(23)。结论化合物1～5、12～14、20～23为首次从芫花中分离得到,并首次从该植物中分离得到神经酰胺类、三萜类、二芳基戊烷类和叶绿素类化合物。
关键词: 芫花 ；芫花素-4’-O-β-D-芸香糖苷 ；3,7-二甲氧基-5,4’-二羟基黄酮 ；浙贝素 ；瑞香烯酮
被引量
31
摘要： 金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)为我国传统名贵中药材,具有多种药理活性。为系统揭示其乙醇提取物的化学成分谱,本文采用乙醇回流提取工艺结合超高效液相色谱-高分辨质谱(UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS)技术,对金钗石斛乙醇提取物进行了成分分析。结果共鉴定出23种主要化学成分,涵盖酰胺类、生物碱、酚类、萜类、糖苷类等多种结构类型。部分成分已被报道具有抗氧化、抗炎、神经保护等药理活性。本研究为金钗石斛药用物质基础的深入阐释及其资源的高值化开发提供了理论依据。
关键词: 金钗石斛 ；乙醇提取物 ；高效液相色谱-质谱联用 ；化学成分分析 ；药用物质基础
【会议论文】 • 宋肖炜 1
会议时间： 2018-11-24
摘要： 本研究建立了一种针对超微量体液样本的导电聚合物喷雾电离(Conductive polymer spray ionization,CPSI)-质谱分析方法。首先以滤纸(filter paper)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氯乙烯(PVC)为载体,通过表面涂渍、掺杂与化学交联等方法,制备了以石墨(Graphite)、碳纳米管(CNT)、氧化铟锡(ITO)、聚苯胺(PANI)等作为导电介质的导电复合物。将上述导电复合物加工为高10 mm、底边8mm的等腰三角形喷雾电离探针,尖端置于与距质谱锥孔8.0mm处,将1.0μL样品加载于距三角形喷针尖端1.0 mm处,待样本充分沉积干燥后,加3.0μL甲醇-水(8:2,v/v)作为萃取与喷雾溶剂,在导电聚合物三角形底边施加±4.0 kV直流电压后,即刻观察到Taylor锥形成及高强度的质谱峰信号。选取三聚氰胺、唾液酸、花生四烯酸、舒尼替尼、阿卡波糖、链霉素、血管紧张素II、羟丙基-β-环糊精、细胞色素C、血红蛋白等不同结构、极性、水溶性与分子量的化合物作为考察对象,最终确定CNT/PMMA导电复合物对有机合成药物、内源性代谢物、寡糖、多肽、蛋白等各类化合物均具有最佳的离子化响应。相比于纸喷雾离子化,上述化合物的导电聚合物喷雾离子化信号强度提高10～100倍,尤其针对强极性、水溶性化合物,由于导电聚合物表面不具有纸纤维表面的微孔结构及羟基基团,极大降低了介质表面对强极性、水溶性化合物的吸附保留,提高了上述化合物的解吸效果;其次,由于导电聚合物表面疏水,降低了带电荷微液滴形成过程中需要克服的表面张力,因此提高了电离效率。以舒尼替尼作为考察CPSI方法灵敏度,绝对检出量为100.0 fg。该方法对喷雾溶剂以及样本的消耗量极少,仅1～3μL的萃取溶剂,即可对100nL血清或穿刺采集的10μg肝组织样本进行充分的解吸及喷雾离子化,利用轨道阱质谱进行数据采集,在正负离子模式下可以检测到氨基酸、糖类、脂酰肉碱、脂肪酸、核苷、多元有机酸、多胺、甘油酯类、磷脂类、鞘脂类、神经酰胺类、胆固醇酯、胆酸等不同结构类别600多个内源性代谢物。此外,利用离子淌度质谱,可以对缬氨酸/甜菜碱、柠檬酸/异柠檬酸、丙氨酸/肌氨酸、富马酸/马来酸等异构体,以及不同脂肪链组成的磷脂类成分进行精细区分与识别,进一步拓展了CPSI-MS分析方法的分子覆盖范围。综上,CPSI-MS具有耗样量少、免样本前处理、快速、灵敏、检测分子类型高覆盖等优点,在血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、组织间液等生物体液样本的代谢组、脂质组分析、治疗药物监测以及蛋白质分析中具有重要的应用价值。
关键词: 导电聚合物喷雾离子化 ；原位电离质谱分析 ；超微量生物样本
【会议论文】 •
会议时间： 2019-08-16
摘要： 目的:脂质组学(Lipidomics)作为代谢组学的重要分支之一,是近几年的研究热点。研究表明,脂质具有多种重要的生理功能,不仅参与调节能量转换、物质运输、信息识别与传递、细胞发育和分化以及细胞凋亡等多种生命活动过程,而且脂质的异常代谢还与包括肿瘤在内的多种疾病的发生、发展密切相关。本研究采用基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)的脂质代谢组学方法研究急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)患儿和正常健康儿童血清脂质代谢物水平的差异,结合多变量及单变量统计分析方法,寻找与ALL发生相关的内源性潜在脂质标志物,并采用生物信息学方法研究相关脂质代谢通路,阐释儿童ALL发生、发展的作用机制。方法:收集28例正常健康对照儿童以及33例初诊未经任何治疗的ALL患儿血清,采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS进行脂质组学检测。采用Proteo Wizard软件将原始数据转换成mz ML格式,采用XCMS进行数据前处理,之后采用多变量统计软件SIMCA-P 14.1进行多元统计分析。采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP值结合单维Welch和Wilcoxon检验寻找可以用于鉴别和诊断ALL的差异性表达脂质代谢物。同时满足VIP>1.0和p <0.05的脂质代谢物被认定为差异代谢物。采用自建数据库对差异脂质进行鉴定,采用R软件进行皮尔森相关性(Pearson Correlation)分析和热图(Heatmap)分析,并利用在线Chem RICH软件(http://chemrich.fiehnlab.ucdavis.edu)进行pathway分析,研究差异脂质的代谢路径并探讨其在ALL发生、发展过程中的作用机制。结果:在正、负离子模式下共筛选并鉴别到140个差异性脂质。其中,与正常对照组相比,ALL患儿血清中77个脂质代谢物浓度发生显著下调,63个脂质代谢物浓度显著上调。通过相关性分析、热图分析及pathway分析,显示ALL患儿脂质代谢出现明显异常。与对照组比较,16条相关代谢路径发生显著改变。具体表现为磷脂酰乙醇胺、甘油三酯类、鞘磷脂类、磷脂酰胆碱类、溶血磷脂酰胆碱类、神经酰胺类、二酯类、胆固醇酯类、半乳糖神经酰胺类、肉碱、磷脂醚类的代谢异常。结论:ALL能够引发机体血清中脂质代谢紊乱。本研究可以为ALL的脂质研究提供理论依据,同时筛选出的差异脂质可作为鉴别ALL的脂质标记物。
关键词: 脂质组学 ；急性淋巴细胞白血病 ；超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱 ；多元统计分析
摘要： 用硅胶,重结晶等手段进行分离纯化,根据化合物的理化性质和光谱数据鉴定结构,来研究毛杜仲藤的化学成分。结果分离得到一个神经酰胺类混合物(化合物1～4),即N-(2'-羟基二十一碳酰基)-1,3,4-三羟基-2-氨基-△8,9(E)-十八碳烯,N-(2'-羟基二十二碳酰基)-1,3,4-三羟基-2-氨基-△8,9(E)-十八碳烯,N-(2'-羟基二十三碳酰基)-1,3,4-三羟基-2-氨基-△8,9(E)-十八碳烯,N-(2'-羟基二十四碳酰基)-1,3,4-三羟基-2-氨基-△8,9(E)-十八碳烯,所有化合物均首次从该植物中分离得到。
关键词: 毛杜仲藤 ；神经酰胺
被引量
4
摘要： 荭草Persicaria orientalis(L.)Spach是蓼属草本植物,其药用部位为干燥果穗及带叶茎枝,在中医药及蒙、藏、苗、彝等少数民族医药体系中有着大量疾病防治的应用。据已有研究表明,荭草中主要含有黄酮类、羧酸类、酚酸类、烷烃类、木脂素类、酰胺类、挥发油和其他不规则杂环类成分,分布于果实、花、叶、茎和根等药用部位,具有肝损伤保护、抗氧化、抗衰老、神经保护、抗炎、镇痛、抗心肌缺血和抗肿瘤的药理作用。目的:本课题研究的出发点是为了系统地探讨荭草的潜在药用价值。采用“药效-成分”进行共现分析比较荭草与其他蓼属药用植物之间的联系与区别。通过检测荭草不同生长期和药用部位中的次级代谢产物的分布特征,筛选差异性次级代谢产物。据此分析指标性成分具有的构效关系可能在荭草用药过程中发挥的作用,以期为荭草的用药方法提供参考依据。方法:检索有关荭草及蓼属植物的文献,将化学成分和药理活性的信息进行整理,建立荭草化学成分的筛查数据库。利用液质联用的方法对荭草样品进行分析,采集正、负离子全扫描模式下荭草全株、果实、叶、茎和根的高分辨质谱总离子流图结果。提取扫描范围在m/z 50-1000的离子,对荭草成分数据库及化合物裂解规律与SciFinder、PubChem和ChemSpider等数据库逐一比对。基于Analyst 1.6.1工作站将荭草中鉴定的成分进行整理。导入化合物名称、分子式、分子质量、结构式、一级质谱和二级质谱数据到LibraryView程序库,标注对应的结构类型和离子化模式作为补充参数。依据荭草成分鉴定的方法,将5-10月不同生长期和不同药用部位的荭草样品分别进行检测,通过PCA、OPLS-DA、S-plot、VIP等代谢组学的方法对组间差异性是否显著进行评估,筛选荭草中主要差异性次级代谢产物;进一步剔除加合离子、同位素离子获得荭草不同药用部位间主要的差异性成分,并对潜在的差异变量进行识别和分析。提取主要差异性成分对应的峰面积为参数值,绘制荭草各药用部位中标志性次级代谢产物相对含量的热力图,用以分析果实、叶、茎和根之间主要次级代谢产物的变化特征。结合荭草中化学结构类似的主要次级代谢产物,检索与之相关的药理研究。通过多种方法对荭草标志性次级代谢产物与药理活性之间的构效相关性交叉验证,并进行网络共现与量化分析。结果:蓼属药用植物与荭草类似,主要以黄酮类成分为主,其次还存在着大量的苯丙素类、皂苷类、醚类、甾醇类、生物碱类、酚酸类、萜类、醌类和烃类化合物。该属药用植物在抗氧化、抗炎、止痛、抗菌和杀虫等方面具有良好的活性,并且对抑制肿瘤细胞增殖、降低血糖、改善体内微循环和促进血小板凝聚也有一定的作用。基于液质联用的方法从荭草全株样品中共鉴定55个化合物,按结构骨架和取代基类型分类,包括25个黄酮类、4个醌类、1个木脂素类、6个生物碱类、8个酰胺类、5个有机酸类、1个甾体类和5个包括含氧原子杂环等内酯结构的其他类成分。其中,果实中有19个黄酮类、2个醌类、1个木脂素类、4个生物碱类、3个酰胺类和3个有机酸类成分;叶中有24个黄酮类、2个醌类、1个木脂素类、5个生物碱类、7个酰胺类、1个甾体类和3个有机酸类成分;茎中有14个黄酮类、2个生物碱类、3个酰胺类和2个有机酸类成分;根中有14个黄酮类、2个醌类、1个木脂素类、4个酰胺类和1个有机酸类成分。荭草不同生长期样品组间的PCA和Dot plot分析结果显示:10月份样品组与5-9月份样品组明显分离;8月份与9月份组样品较为接近;5-7月份样品组按采收时间的变化呈现较一致的离散趋势,但各样品之间未显示出明显的差异。荭草果实、叶、茎和根等不同药用部位样品组间的代谢组学结果显示:PCA和OPLS-DA模式中荭草各药用部位能明显分开并分别聚为一类;柱形载荷图、VIP预测模式、结合组间t检验结果交叉筛选后确定12个潜在的指标性差异成分,即具备构效关系分析的标志性次级代谢产物。标志性次级代谢产物构效相关的比对结果显示,化学结构接近的成分在生物利用度、药理活性、吸收代谢途径和结构稳定性等方面会随着取代基的种类、数量和结合位点产生比较明显的差异。荭草标志性次级代谢产物在各药用部位的量化分析表明,异鼠李素、异荭草苷、儿茶素、商陆苷、山柰酚、槲皮素-3-甲基醚、槲皮素3-O-葡糖苷酸、羟基大黄素、荭草苷和二氢槲皮素在叶中含量较高;异鼠李素和牡荆素在果实中含量较高;茎和根中各成分含量均低于果实和叶。结论:从荭草次级代谢产物的比较分析显示,果实、叶、茎和根中黄酮类、生物碱类的种类和数目有逐渐减少的趋势;而酰胺类、有机酸类、醌类和木脂素类化合物在各药用部位中均有分布,但并不完全一致。在整个荭草不同药用部位样品的组间分析中,果实、叶、茎和根分别聚为一组,而茎和根之间的成分较为接近,分别与果实和叶有明显的离散趋势。各组间样品聚集和离散形成的主要原因是荭草在不同时间段生成的次级代谢产物随着生长过程发生了变化。而且采收时间越接近,样品组之间的变化越不明显。这种变化趋势可能与收集过程中的植物形态有关,即是否有花、果实等药用部位的存在。研究结果充分表明荭草在生长过程中次级代谢产物的生成存在一定规律,是导致荭草果实、叶、茎和根有着不同药效的重要因素之一。然而,仅通过成分的鉴定并不能全面地阐释荭草中具有药效的物质基础。结合指标性次级代谢产物的筛选及其构效关系的补充能够阐明该类成分在荭草整体作用中可能发挥的作用。进一步为荭草的采收时间、药用部位的选择和活性成分的深入发掘提供参考依据。
关键词: 荭草 ；次级代谢产物 ；代谢组学 ；构效关系
摘要： 寄生植物菟丝草为旋花科植物菟丝子Cuscuta chinensis Lam.的干燥地上部分,多寄生缠绕在豆科、胡麻科等植物上,以带花果的全草入药,具有补肝肾、益精髓等功效,在抗炎、抗氧化、降脂等方面应用广泛,表现出了良好的临床利用前景。菟丝草中含黄酮、生物碱等多种活性成分。目前,在国内外对菟丝子的研究较为深入,而对其全草的化学成分和生物活性研究较为少见。本课题选取新疆地区药用植物菟丝草为研究对象,重点研究全草的化学成分并进行生物活性筛选。主要研究内容如下:第一部分对有关菟丝草植物化学成分、生物活性、寄生特性、质量标准等研究进行了综述分析。菟丝草植物中存在黄酮、甾醇、多糖、木脂素、生物碱、萜类等多种成分,有抗氧化、抗炎、免疫调节、保肝、抗癌、保护神经、降脂等多种作用,关于其质量标准研究目前还是停留在相对较为简单的性状、薄层、显微等简单标准方法;此外,由于菟丝草具寄生性,其化学成分也会受到寄主植物、产地、气候等的直接影响,进而影响其生物活性,因此有必要对其进行生药鉴别,确定基源,确保药材药效发挥安全、稳定。第二部分对不同极性的菟丝草提取物做了抗炎、抗菌、降血脂、降糖等生物活性筛选,并对不同产地的菟丝草药材进行了抗氧化测定。结果表明,菟丝草中存在抗氧化活性成分;菟丝草各部位对15-LOX酶抑制率不太明显,但对COX-2酶有较强的抑制活性,其中石油醚部位活性最强;二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位对白色链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌存在不同程度的抑制效果,也表现出较强的体外降脂活性;菟丝草各部位对PTP1B的抑制率都比较低,降糖活性不高。第三部分对菟丝草石油醚部位进行了气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析,初步鉴定其中的化学成分。经质谱检索软件检索,并核对标准图谱,结果显示从菟丝草石油醚部位鉴定出47种成分,包括烷烃类、脂肪酸类、酯类及甾类等成分,其中γ-谷甾醇（13.85%）,棕榈酸（9.72%）,邻苯二甲酸二丁酯（7.97%）,菜油甾醇（6.88%）等成分含量较高。第四部分中采用硅胶柱色谱、薄层色谱、中压快速制备色谱、高效液相、半制备液相等多种分离手段在菟丝草二氯甲烷及乙酸乙酯部位中分离出32个单体化合物,并结合核磁共振波谱（1DNMR、2DNMR）、高分辨质谱（ESI-MS）、紫外（UV）等波谱色谱技术鉴定了其中30种单体结构,包括10个黄酮类,5个木脂素类,1个生物碱类,8个酚类化合物,3个单萜,1个酰胺类成分,1个甾醇,1个螺环化合物。分别为6-乙氧基-1H-嘧啶-2,4-二酮（CD-1）,对羟基苯甲酸乙酯（CD-2）,莨菪亭（CD-3）,（-）-地芰普内酯（CD-4）,（+）-松脂素（CD-5）,槲皮素（CD-6）,山柰酚（CD-7）,N-反式-阿魏酰酪胺（CD-8）,（+）-丁香脂素（CD-9）,杜仲树脂酚（CD-10）,3,4-脱氢海螺环酮（CD-11）,（+）-松脂素-O-β-D-葡萄吡喃糖苷（CD-14）,单爵麻脂苷（CD-15）,对苯二酚（CD-16）,香草酸（CD-17）,β-胡萝卜苷（CD-18）,2,4,6-三甲基-没食子酸（CD-19）,山柰酚-3-O-β-D-（6″-p-对羟基苯甲酰基）-半乳吡喃糖苷（CD-20）,反式银锻苷（CD-21）,槲皮素-3-O-（6″-阿魏酸）-β-D-吡喃半乳糖苷（CD-22）,山柰酚-3-O-（2′′-O-E-p-香豆酰基）-β-D-吡喃葡萄糖苷（CD-23）,紫云英苷（CD-24）,异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（CD-25）,长寿花糖苷（CD-26）,山柰酚-3-O-(6″-O-E-阿魏酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷（CD-27）,吐叶醇（CD-28）,邻苯二酚（CD-29）,E-对香豆酸（CD-30）,顺式对羟基肉桂酸（CD-31）,金丝桃苷（CD-32）。其中CD-1、CD-3、CD-4、CD-11、CD-15、CD-19、CD-20、CD-21、CD-22、CD-23、CD-26、CD-27、CD-28、CD-29这14个化合物是首次从该植物中分离得到。通过体外酶活性检测来评价分离得到的部分单体化合物的抗炎活性,结果显示化合物CD-22有很好的抗炎活性,对COX-2酶抑制率高达93.86%,测定IC50值为0.32±0.01μM。第五部分建立了十个产地菟丝草药材（S1～S10）的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱,共标定出12个共有色谱峰,采用SPSS 19.0软件等对样品进行相似度分析、主成分分析、聚类分析,鉴别、筛选菟丝草药材的产地来源。相似度结果显示样品S1、S2、S3、S6、S7、S9、S10的相似度高于0.90,而产地S4、S5、S8之间相似度低于0.90。主成分分析和聚类分析结果显示样品分为两类,S1、S2、S3、S6、S7、S9、S10聚为一类,其余产地S4、S5、S8为一类;同时测定了药材中金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素3种黄酮类成分的含量。结果显示,不同产地菟丝草中黄酮类成分含量差异明显,精密度、重复性、稳定性RSD均小于3%,平均加标回收率大于95%,为菟丝草的质量标准研究提供了参考依据。
关键词: 菟丝草 ；化学成分 ；生物活性 ；成分分析 ；分离纯化
被引量
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摘要： 荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)是一类野生食药兼用真菌，含有丰富的化学成分和广泛的生物活性，具有很高的食药用价值。荷叶离褶伞中主要含有甾醇类、神经酰胺类、核苷类等成分，其子实体具有抗肿瘤、抗氧化、降三高、抗辐射、增强免疫、抑菌、治疗特异性皮肤炎等多种生物活性。目前，国内外对荷叶离褶伞真菌化学成分的研究多集中在多糖方面，缺乏对小分子化学成分的深入探索。本文通过查阅国内外的文献，对离褶伞属真菌的化学成分和生物活性进行概括总结，然后对荷叶离褶伞子实体中的化学成分进行了系统的研究，分离纯化了其中的单体化合物，并对其进行结构鉴定，结合荷叶离褶伞挥发性成分的GC-MS分析更为完整的阐明了荷叶离褶伞中的化学成分，为研究荷叶离褶伞中化学成分的药效作用研究提供标准品。 1.荷叶离褶伞子实体的化学成分研究采用薄层色谱法、硅胶柱色谱法、中压柱色谱法、凝胶柱色谱法(SephadexLH-20)及半制备高效液相色谱法等多种色谱分离方法，从荷叶离褶伞子实体中分离鉴定了13个单体化合物的结构，分别为麦角甾醇(1)、啤酒甾醇(2)、(22E, 24R)-麦角甾-7,9(11),22-三烯-3β,5α,6β-三醇(3)、(22E, 24R)-麦角甾-7,22-二烯-3β,5α-二羟基-6-酮(4)、(22E, 24R)-麦角甾-3β,5α,9α-三羟基-7,22-二烯-6-酮(5)、(22E)-麦角甾-3β,5α,9α,14β-四羟基-7,22-二烯-6-酮(6)、(22E, 24R)-5α,8α-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(7)、3β-羟基-5α,8α-过氧麦角甾-6,9,22-三烯(8)、(22E, 24R)-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-5α,8α-过氧麦角甾-6,9,22-三烯(9)、(22E, 24R)-5α,6α-环氧麦角甾-8(14),22-二烯-3β,7α-二醇(10)、tuberoside(11)、烟酰胺(12)、(4E, 8E)-2-N-(2'-羟基棕榈酸酯)-1-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-9-甲基-4,8-鞘氨二烯(13)。其中包括甾醇类化合物8个、甾酮类化合物3个、含氮化合物1个和神经酰胺类化合物1个。其中化合物3-10为首次从离褶伞属中分离获得，化合物12为首次从荷叶离褶伞中分离获得。 2.荷叶离褶伞子实体挥发性成分的GC-MS分析采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对荷叶离褶伞中的挥发性成分进行了分析，从荷叶离褶伞中分析鉴定出46个挥发性成分。其中含氮类化合物10个，相对百分含量高达46.083%;烷烃和烯烃类10个，相对百分含量占20.424%;脂肪酸类5个，相对百分含量占9.749%;烯酮、脂肪酮、吡咯烷酮类5个，相对百分含量占4.192%;呋喃类3个，相对百分含量占3.122%;还有少量萜类、酯类、吡嗪类、脂肪醇类、哌啶类等其他类化合物。主要成分包括N-(3-甲基丁基)乙酰胺(23.548%)、N-(3-甲基-2-氧代丁基)-乙酰胺(8.522%)、十六烷(6.648%)等。 本文对荷叶离褶伞子实体的化学成分进行分离纯化，结合荷叶离褶伞子实体挥发性成分GC-MS分析，更加全面的分析了荷叶离褶伞中的化学成分，为下一步探究荷叶离褶伞中单体化合物的药理活性提供实验依据。
关键词: 荷叶离褶伞 ；化学成分 ；药效作用
摘要： 国际上对石磺科贝类的系统分类研究开始较早,国内对石磺的研究已从形态分类研究扩展到系统进化及资源利用等方面。角质层位于皮肤的表面,是生物防御外界物理伤害和化学伤害的重要屏障。本研究选取有代表性的以陆栖为主的瘤背石磺和以水栖为主的里氏拟石磺的背部皮肤为研究对象,对皮肤为适应环境表现出蛋白质层面的差异做进一步探索;通过对两种石磺背部组织染色观察和蛋白质组测定分析,得到两种背部皮肤组织结构差异明显的石磺在蛋白层面的差异、相关蛋白筛选与功能验证及基因表达分析结果:(1)两栖性生物皮肤对自身生存和适应栖息地的环境变化起着无可替代的作用,从两种石磺背部皮肤组织切片的TUNEL染色观察到瘤背石磺背部凋亡信号多于里氏拟石磺,且凋亡信号多集中分布靠近表皮部位,背部乳头状突起,凋亡信号明显。推测里氏拟石磺明显的蜕皮现象要求不断有新的细胞生成,瘤背石磺背部皮肤虽不蜕皮但同样有细胞分裂分化现象,从而机体为了维持体内细胞平衡状态,诱导大量细胞凋亡信号的发生。(2)采用Label-free非标定量研究方法,对瘤背石磺和里氏拟石磺背部皮肤组织进行蛋白质组学鉴定及分析,鉴定得到较多的是胶原家族蛋白,说明石磺科贝类有较高的营养价值,经济价值潜力突出;差异分析得出两种石磺嘌呤代谢通路有较多的差异表达同源序列。定量分析显示,两种石磺背部皮肤差异同源蛋白种类和数量均较多,差异同源蛋白与其不同性状联系紧密,同时参与多种通路的分子调控中。差异蛋白中维生素C和富含血红素的白蛋白在里氏拟石磺背部皮肤中高表达,这类蛋白在里氏拟石磺背部皮肤的呼吸作用和渗透压调节等功能中发挥重要作用。其中差异同源蛋白多富集在糖酵解/糖质新生和丙酮酸代谢通路,糖酵解/糖质新生通路存在较多差异同源序列,表明两种石磺背部组织能量代谢过程存在差异,数据分析显示糖酵解/糖质新生过程关键酶己糖激酶在里氏拟石磺中高表达,能够保证充分的能量供应、促进细胞增殖,可知里氏拟石磺背部皮肤糖酵解能力较强,与蜕皮(角质膜更换)频繁,需要较多的能量支持和较快的细胞增殖现象相关。瘤背石磺背部皮肤角质化程度较高,脂质基质的主要成分神经酰胺类物质在瘤背石磺中高表达,神经酰胺是各种细胞因子和生长因子信号通路重要的第二信使,并且在皮肤渗透压调节通路中发挥重要作用,对皮肤保湿有重要贡献,是瘤背石磺适应陆栖生活的一个重要体现。在细胞凋亡功能富集中发现,与促进细胞增殖、抑制细胞凋亡相关的蛋白在里氏拟石磺背部皮肤中高表达,与TUNEL染色法观察到里氏拟石磺背部组织凋亡信号较弱现象吻合。两种石磺背部嘌呤代谢通路存在较多的差异同源序列,在动物从水生到陆生的进化过程中,尿素酶基因在陆生动物中完全消失,或蛋白失去活性;两种石磺的转录组和蛋白质组差异分析显示,尿素酶基因和蛋白在瘤背石磺中高表达,前期实验证明里氏拟石磺分泌的粘液中尿素含量远高于瘤背石磺,说明瘤背石磺在嘌呤代谢通路产生的尿素大部分被尿素酶分解,更偏向于水栖生物的特征,属于特殊物种,推测是与受到外界刺激时瘤背石磺以分泌粘液和散发出刺激性氨气为主,而里氏拟石磺以喷射粘液为主的现象相关。(3)采用RACE方法,首次于瘤背石磺中得到Os-PAK2、Os-14-3-3序列全长,在里氏拟石磺中得到Pr-14-3-3序列全长。Os-PAK2氨基酸位置29-64是典型的PBD(P21结合位点),位置222-473是丝氨酸/苏氨酸结构,具有自我磷酸化调控作用,是调节PAK活性的主要部位。荧光定量分析显示,瘤背石磺PAK2背部组织的表达量在mRNA和蛋白质水平均高于里氏拟石磺,结合TUNEL染色结果,推测瘤背石磺背部皮肤组织中Os-PAK2促进凋亡的作用更加明显。瘤背石磺各组织中Os-14-3-3的qRT-PCR定量分析显示,在肠道和神经组织中表达量远高于里氏拟石磺,推测瘤背石磺适应陆栖生活的条件下肠道和神经组织活跃度降低,组织细胞更新速率比里氏拟石磺慢。Pr-14-3-3在里氏拟石磺的背部和腹足组织表达量高于瘤背石磺,推测里氏拟石磺背部组织的细胞不断增殖分化,且细胞凋亡信号受到抑制,以保证在角质膜频繁更换的同时不断有新的细胞补充。瘤背石磺和里氏拟石磺在长期的系统进化过程中各自形成了背部皮肤对环境的适应,本研究对两种石磺背部皮肤的差异蛋白和两栖适应性有了更深入的了解,为全面分析两个近缘物种的环境适应性提供了蛋白组学的基础数据及部分候选蛋白,为深入研究石磺科贝类的趋异进化提供了有力参考。
关键词: 瘤背石磺 ；里氏拟石磺 ；蛋白质组 ；PAK2 ；14-3-3
摘要： 金莲花又名旱荷、陆地莲,是毛茛科植物金莲花（Trollius chinensis Bunge.）和短瓣金莲花（Trollius ledebourii Reichb.）的干燥花,广泛分布于我国北方地区如内蒙古、河北等。金莲花味苦,性寒,无毒,其药用历史悠久,《纲目拾遗》记载其可治口疮、喉肿、浮热牙宣、耳疼、目痛、明目、解岚瘴。民间常用作花茶引用,具有消炎止渴,清喉利咽和清热解毒的功效。中国药典2015年版（一部）收录了5种不同剂型金莲花单方制剂,并规定其含量测定成分为荭草苷。现代药理研究表明,金莲花具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌等活性,临床主要用于抗菌消炎,治疗呼吸道炎症、咽炎、扁桃体炎。金莲花中含有的化学成分主要有黄酮类、酚酸类、生物碱类。总黄酮为金莲花的主要有效部位,以荭草苷、牡荆苷、荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷的含量最高,也是其主要药效成分。本研究采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）技术首次对金莲花提取物中的化学成分和其主要活性成分荭草苷、牡荆苷在大鼠体内外的代谢产物进行快速鉴定,共鉴定了37个化学成分、12个荭草苷代谢产物和23个牡荆苷代谢产物;此外,首次采用高效液相色谱-四极杆/线性离子阱质谱（HPLC-QTRAP-MS/MS）同时测定了金莲花药材中黄酮类和酚酸类11个化学成分含量,可为金莲花药材的质量控制提供科学依据。蛇床子素是一种天然香豆素类化合物,广泛存在于多种药用植物中,例如:蛇床子、前胡和枳实等。据文献报道,蛇床子素具有明显的药理活性,包括抗癌、抗凋亡和神经保护作用。近年来,蛇床子素的杀菌作用也受到国内外的广泛关注,在农业上用作植物源的杀虫剂,具有环保和毒性小的优点。本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合SWATH（Sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra）采集技术对蛇床子素在大鼠体内外的代谢产物进行了鉴定,共鉴定了72个代谢产物并总结了蛇床子素的代谢途径,为其在临床和农业应用上的有效性和安全性奠定了基础。第一部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术的金莲花化学成分的定性分析目的:建立基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术快速鉴定金莲花中的化学成分。方法:采用Poroshell 120 EC-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm,2.7μm）,以0.1%甲酸水（A）-乙腈溶液（B）为流动相进行梯度洗脱。结果:通过比较化合物的精确相对分子质量数、色谱行为和一级二级质谱碎片,利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS法共推断鉴定了金莲花药材中的37个化学成分,包括17个黄酮苷类化合物,6个黄酮类化合物,3个黄酮醇类化合物,1个二氢黄酮化合物,8个有机酚酸类化合物,1个酰胺类化合物和1个三萜类化合物;其中柳穿鱼叶苷、柚皮素、香叶木素、丹皮酚、阿魏酸、咖啡酸、原儿茶酸和异鼠李素均为首次在金莲花提取物中被鉴定。结论:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法为药用植物金莲花提供了一种快速、高效的定性分析方法,其主要化合物的裂解规律也为金莲花活性物质的代谢研究提供了参考。第二部分HPLC-QTRAP-MS/MS法同时测定金莲花中11个化学成分的含量目的:HPLC-QTRAP-MS/MS法同时测定金莲花药材中荭草苷、牡荆苷、荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、芹菜素、金丝桃苷、阿魏酸、刺槐素、槲皮素、木犀草素、香草酸和柚皮素的含量。方法:采用Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm,5μm）,以水（0.1%甲酸）-乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,体积流量0.8 mL/min,进样量10μL,柱温30oC;采用电喷雾离子源进行负离子模式监测,多反应监测模式（MRM）进行定量分析,源喷射电压为-4500 V,离子源温度为650oC。结果:HPLC-QTRAP-MS/MS法测定金莲花中11个成分的峰面积和质量浓度在测定质量浓度范围内均具有良好的线性关系（r2>0.9987）,加样回收率为98.15%101.6%,精密度RSD值为0.28%1.95%。结论:HPLC-QTRAP-MS/MS法准确、简便、快速、灵敏度高、专属性好,可用于金莲花中11个黄酮类和酚酸类化学成分的含量测定。第三部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术的荭草苷与牡荆苷的体内外代谢研究目的:基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,建立一种快速分离并鉴定荭草苷和牡荆苷在大鼠肝微粒体、血浆、胆汁、尿液及粪便样品中代谢产物的方法。方法:采用大鼠肝微粒体作为体外代谢反应模型,将荭草苷和牡荆苷分别与大鼠肝微粒体进行体外Ⅰ相和Ⅱ相温孵试验,分别设置空白组、对照组和样品组,平行孵育三份;大鼠灌胃分别给予荭草苷和牡荆苷,收集给药前后血浆、胆汁、尿液和粪便样品。将处理好的生物样本注入到UHPLC-Q-TOF-MS/MS色谱-质谱联用仪进行数据采集。色谱柱为Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm,2.7μm）配有SecurityGuard?预柱,柱温:40oC,流动相为乙腈:水（含有0.1%甲酸）,梯度洗脱。质谱采用电喷雾离子源（ESI源）,正离子模式监测,采集模式为信息依赖性采集（information dependent acquisition,IDA）。通过与对照品比对,同时借助采集到的液相保留时间、高分辨一级和二级质谱数据,联合MetabolitePilotTM1.5代谢物软件,推测可能的代谢产物结构,并阐述其代谢途径。结果:通过与已有对照品比较保留时间、一级和二级质谱信息,结合荭草苷和牡荆苷质谱裂解规律及MetabolitePilotTM1.5软件中的代谢反应类型,共鉴定了12个荭草苷代谢产物,23个牡荆苷代谢产物。结论:本文归纳总结了荭草苷和牡荆苷在大鼠体内外的代谢反应途径,其主要的代谢反应类型有氧化、甲基化、乙酰化、还原、葡萄糖基团的丢失和葡萄糖醛酸结合反应等。第四部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合SWATH采集方法鉴定蛇床子素的体内外代谢产物目的:采用非信息依赖性SWATH在线数据采集技术,建立快速分离并鉴定蛇床子素在大鼠体内外代谢产物的方法,总结其代谢规律,为进一步阐明药效作用机制提供依据。方法:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS结合SWATH数据采集技术进行全扫描,获取化合物的色谱信息和一级、二级质谱信息,通过MetabolitePilotTM2.0代谢物软件的主成分变量分组（principal component variable grouping,PCVG）功能进行化合物过滤,初步筛选蛇床子素可能的代谢产物;MasterViewTM1.1软件的“关键子离子”（key product ions,KPIs）提取技术作为辅助工具可以快速筛选与母药特征碎片相吻合的、准确度更高的代谢产物。通过比较保留时间和质谱数据,鉴定蛇床子素在大鼠肝微粒体、血浆、胆汁、尿液和粪便中的代谢产物,总结其生物转化途径。结果:通过与已有对照品比较保留时间、一级和二级质谱信息,结合蛇床子素的质谱裂解规律,共鉴定了72个蛇床子素代谢产物,其中在体外大鼠肝微粒体中检测到39个;在大鼠体内血浆中检测到20个,胆汁中32个,尿液中32个和粪便中37个。结论:蛇床子素在肝微粒体和生物体内代谢活性较高,肝脏和粪便中检测到的代谢物数量和种类最多;代谢途径主要为单氧化反应、去甲基反应、脱氢反应、硫酸化、葡萄糖醛酸结合、磷酸化、S-半胱氨酸结合反应和N-乙酰半胱氨酸结合反应。
关键词: UHPLC-Q-TOF-MS/MS ；金莲花 ；蛇床子素 ；药物代谢 ；IDA ；SWATH ；肝微粒体
被引量
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摘要： 目的:六堡茶是一种后发酵黑茶,属茶科[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]品种之一。多有研究表明茶叶有清热化湿、调节肠胃的功效。但关于六堡茶对湿热型便秘的研究目前鲜有报道。以广西梧州六堡茶作为研究对象,首先采用液质联用和气质联用技术对其进行初步定性分析,再结合网络药理学预测六堡茶改善湿热型便秘的潜在作用机制。在前两章的基础上,通过构建湿热型便秘大鼠模型,从多方面评价六堡茶对湿热型便秘的药效作用机制。采用16s r RNA高通量测序技术探究六堡茶改善湿热型便秘与肠道菌群的关系,初步探讨其微生物作用机制。项目研究从化学成分分析,网络药理学预测,动物模型药效机制及肠道菌群的角度明确六堡茶改善湿热型便秘的机制,为六堡茶的产业开发提供研究基础。方法:(1)六堡茶的化学成分分析采用液质联用和气质联用技术对梧州六堡茶进行化学成分定性分析,对梧州六堡茶的化学成分进行鉴定,为六堡茶的化学基础提供依据。(2)六堡茶干预湿热型便秘的网络药理学研究采用网络药理学方法预测六堡茶改善湿热型便秘的潜在作用机制。基于文献挖掘和数据库搜索,收集六堡茶活性成分,同时结合质谱鉴定成分,预测共有成分的作用靶点;通过疾病数据库对湿热型便秘的疾病靶点收集后,将共有成分的作用靶点与疾病作用靶点相映射以获得共同作用靶点集,通过PPI、GO、KEGG等信号途径,预测六堡茶改善湿热型便秘的潜在作用机制。(3)六堡茶对湿热型便秘大鼠的药效学研究以雄性SD大鼠作为研究对象,通过高温高湿、饥饱失常、肥甘厚味及疲倦过劳的造模方法建立起湿热型便秘的中医证候模型,随机将大鼠分为正常组、模型组、六堡茶低剂量组、六堡茶高剂量组。在实验中期和后期,以各组大鼠的毛发、精神状态及粪便含水率作为模型成型的依据。造模后,采用全自动生化检测仪及ELISA法测定大鼠血液生化指标含量(血脂四项丙氨酸转氨酶、尿酸、D-乳酸)以及血清中四种肠神经递质水平(一氧化氮、血管活性肠肽、胃动素、P物质);对大鼠的结肠、胃、肾组织进行HE染色切片以观察组织形态学变化,并在病理切片的基础上,对结肠、胃、肾组织的三种炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)进行免疫组化分析;采用实时定量PCR检测结肠、胃、肾组织中的AQP3、AQP4、AQP8基因的表达情况。以此评价六堡茶改善湿热型便秘的药效学作用。(4)六堡茶对湿热型便秘大鼠肠道菌群研究基于前章节的动物实验,以正常组大鼠作为对照,运用16s r RNA高通量测序技术对V3～V4高变区域进行测序,结合生物信息学技术分析湿热型便秘大鼠模型的肠道菌群结构,初步探索其微生物作用机制。结果:(1)六堡茶的化学成分分析通过液质联用和气质联用技术鉴定出113种化合物。通过已知文献报道、对照品信息和谱库分析鉴定出槲皮苷、表没食子儿茶素等黄酮类,缬氨酸、D-脯氨酸等氨基酸类,硬脂酰胺、十六碳酰胺等酰胺类物质等。根据初步鉴定出化合物分类情况,可知六堡茶的成分组成主要为黄酮类、酰胺类、氨基酸类。(2)六堡茶干预湿热型便秘的网络药理学研究数据库搜索与质谱匹配所得的共有成分有9个,六堡茶改善湿热型便秘的潜在作用靶点有74个。富集分析可得MAPK1、MAPK3、MAPK8、TP53、IL6、TNF等22个核心靶点主要作用于PI3K-AKT、Human cytomegalovirus infection、MAPK等信号通路中。核心靶点及富集结果提示六堡茶可能通过多个成分作用于多条通路调控炎症因子和MAPK因子的表达直接或间接干预湿热型便秘。(3)六堡茶对湿热型便秘大鼠的药效学研究与正常组比较,造模过程中模型组大鼠的毛发逐渐发黄并且蓬松欠光亮,进食量明显减少并且体重明显下降(P<0.05),粪便颗粒变小,质地干燥,其含水量降低(P<0.05),精神上表现为眯眼蜷缩、抱团拱背,而且触碰到鼠体时,多见精神紧张暴躁;血清中胃泌素、D-乳酸、胃动素、P物质、血管活性肠肽和一氧化氮的分泌量明显增多(P<0.05),并且血脂水平表现为异常;炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β在模型组大鼠的结肠、胃、肾组织分泌量明显增多(P<0.05)。此外,与正常组相比,在模型组大鼠的结肠和胃组织中,AQP3和AQP4的基因表达明显增强(P<0.01),AQP8的基因表达明显降低(P<0.01);在肾组织中,模型组的三种水通道蛋白表达量明显下降(P<0.05)。六堡茶干预后,大鼠的毛发发黄状态得到改善,并且少见眯眼蜷缩现象,提高了湿热型便秘大鼠的粪便含水量,降低了胃泌素、D-乳酸、胃动素、P物质、血管活性肠肽和一氧化氮的分泌量,减少了炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达,改善了结肠、胃、肾组织中的炎症浸润状态及三种水通道蛋白的基因表达。(4)六堡茶对湿热型便秘大鼠肠道菌群研究从各组的OTU数量以及α多样性来看,湿热型便秘大鼠模型肠道菌群的相对丰度和多样性最低,其肠道菌群结构得到破坏,侧面表明造模成功;在门水平上发现2个具有显著性变化的菌门,在属水平上发现15个具有显著性差异的菌属。结合属水平上菌属所归属的菌门,发现多数归属厚壁菌门和拟杆菌门。六堡茶干预后,大鼠肠道菌群较模型组相对丰富和多样化,并逐渐趋向正常组大鼠。将各药效指标与肠道菌群进行关联度分析,门水平和属水平上均具有明显的相关性。结论:本研究先通过液质和气质联用技术鉴定出113种化合物,之后借助网络药理学预测六堡茶可能是通过多个成分作用于多条通路调控炎症因子和MAPK因子的表达直接或间接干预湿热型便秘。通过构建湿热型便秘大鼠模型,六堡茶干预后,提高了大鼠的粪便含水量,猜测六堡茶可能通过降低血清中SP、VIP、MTL及NO的分泌量,减少炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达,及调控结肠、胃、肾组织中三种水通道蛋白的基因表达和肠道菌群结构,以此综合改善湿热型便秘。
关键词: 梧州六堡茶 ；化学成分 ；湿热型便秘 ；肠道菌群
摘要： Spongia属海绵为寻常海绵纲(Demospongiae)网角海绵目(Dictyoceratida)角骨海绵科(Spongiidae)动物。国内外研究发现,该属海绵中蕴含有多种结构类型的次生代谢产物,主要包括萜类、甾体类、神经酰胺类和大环内酯类等结构类型。这些结构新颖的化合物表现出丰富多样的生物活性,如细胞毒、抗病毒、抗炎和免疫抑制活性等,得到了相关学者的广泛关注。本论文对采自广东省湛江市徐闻县浅水海域的一种海绵Spongia sp.的95%乙醇提取物进行了系统的化学成分研究。采用了硅胶柱层析、反相ODS柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和高效液相等色谱分离技术分离得到了50个化合物,并通过核磁共振、质谱、紫外光谱和红外光谱等谱学手段鉴定了它们的结构,运用圆二色谱、X-ray单晶衍射及计算化学的方法确定了新化合物的绝对构型。所分离得到的化合物分别为spongiain A(S1),spongiain B(S2),spongiain C(S3),bisnorspongiain A(S4),bisnorspongiain B(S5),bisnorspongiain C(S6),bisnorspongiain D(S7),bisnorspongiain E(S8),bisnorspongiain F(S9),bisnorspongiain G(S10),bisnorspongiain H(S11),norspongiain A(S12),norspongiain B(S13),norspongiain C(S14),norspongiain D(S15),norspongiain E(S16),norspongiain F(S17),spongiain D(S18),spongiain E(S19),spongiain F(S20),spongiain G(S21),(+)-spongiterpene[(+)-S22],(-)-spongiterpene[(-)-S22)],1H-indole-3-carbaldehyde(S23),1H-indole-3-carboxylic acid(S24),1H-indole-3-carboxylic acid acetate(S25),indazole(S26),dehydrololiolide(S27),loliolide(S28),(+)-dehydrovomifoliol(S29),β-hydroxy-5α,6α-epoxy-7-megastimen-9-one(S30),β-cholesterol(S31),β-sitosterol(S32),3β-hydroxycholest-5-en-7-one(S33),(S)-5-hydroxy-3,4-dimethyl-5-pentylfuran-2(5H)-one(S34),(S)-5-hydro-3,4-dimethyl-5-oxo-2-furantridecanoic acid actetate(S35),4-hydroxybenzaldehyde(S36),benzoic acid(S37),phenylacetic acid(S38),4-methoxyphenylacetic acid(S39),hypoxanthine(S40),adenine(S41),6-methoxy-7-methyl-8-oxoguanine(S42),2′-deoxyuridine(S43),uridine(S44),2′-O-methyluridine(S45),2′-deoxythymidine(S46),β-adenosine(S47),2′-deoxyadenosine(S48),5′-deoxy-5′-methylamino-adenosine(S49)和inosine(S50)。化合物S1-S22为新化合物,其中,化合物S1-S3是自然界中首次发现通过A环重排的具有新颖骨架的5/5/6/6/5五环体系的海绵烷型二萜;化合物S4-S11为首次发现A环开环的18-降海绵烷型二萜;化合物(+)-S22和(-)-S22为首次从海绵中发现的一对新的缬草烷型倍半萜对映异构体,并通过手性HPLC对其进行了拆分。本论文对分离得到一系列新的海绵烷型二萜的生物合成途径进行了探讨。我们认为各种类型的海绵烷型二萜是在其基本骨架上经历了多次的氧化、脱羧、缩合等反应所得到的。19-降海绵烷型二萜的前体为正常C20骨架结构的海绵烷型二萜,18-降海绵烷型二萜的前体为19-降海绵烷型二萜,因此,这也印证了本论文分离得到的海绵烷型二萜以18-降海绵烷型二萜为主。本论文还对分离得到的新化合物进行了抗污损、抗肿瘤、抗菌以及抗病毒等活性测试。在抗污损活性测试中,化合物S1,S2,S4,S6和S16在作用4 h之后,苔藓虫的附着率小于10%,化合物S14和S20作用4 h之后,苔藓虫的附着率则小于50%。在细胞毒活性测试中,化合物S16对大鼠噬碱性白血病细胞PBL-2H3和前列腺癌细胞PC3表现出一定的细胞毒活性,IC50值分别为27.2和24.8μM。然而,化合物S2和S3在10-80μM浓度之间呈剂量依赖性地促进RBL-2H3细胞的增殖,提示了这两个化合物在后续的研究中可从促进血管新生、组织修复、神经保护等方面进行相关活性测试和作用机制研究。
关键词: 海绵 ；Spongia sp. ；海绵烷型二萜
被引量
3
摘要： 目的：研究斑蝥素（Cantharidin,CTD）致LO2细胞毒性的作用机制，以期为CTD的肝毒性提供依据。 方法： 1.CTD致LO2细胞毒性分子机制研究 培养人肝LO2细胞，CCK-8法检测不同浓度CTD（0、6.25、12.5、25、50和100μM）对其增殖的影响;采用试剂盒检测CTD（0、6.25、12.5、25和50μM）对LO2细胞中ALT、AST、LDH和MDA含量及SOD、GSH活性的影响;采用免疫荧光染色法和透射电镜观察CTD对LO2细胞自噬、凋亡等的影响;采用流式细胞术和Hoechst33342检测CTD对LO2细胞凋亡的影响;采用蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测CTD对LO2细胞内质网应激（Endoplasmicreticulumstress,ERS）、自噬和凋亡通路相关蛋白的蛋白表达水平，同时加入ERS激动剂（2DG）进行反证。 2.基于脂质组学的CTD致LO2细胞毒性研究 采用不同浓度的CTD（0、6.25和25μM）干预LO2细胞12h后，胰酶消化，加入预冷的淬灭试剂，低温离心，收集细胞，-80℃保存备用。分析时置冰上解冻5min后，离心;取上清300μL加入1mL的脂质提取液;以100μL流动相复溶后LC-MS分析。采用MWDB代谢物数据库，根据保留时间（Retentiontime,RT），前体离子和产物离子鉴定代谢物结构。采用MultiQuant软件对获取的数据进行定量分析，以获得包含每种代谢物的RT，离子和峰面积的矩阵。将其导入SIMCA-P14.1(Umetrics,Sweden)进行多元统计分析，包括主成成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘-判别分析法（OPLS-DA）。通过变量重要性投影（VIP）＞=1和fold-change＞=5或fold-change＜=0.2筛选CTD致LO2细胞的差异代谢物，进而分析主要代谢通路。 结果： 1.CTD致LO2细胞毒性的分子机制研究 CCK-8实验结果显示，CTD可剂量依赖性的抑制LO2细胞增殖;CTD可显著升高ALT、AST、LDH和MDA含量（P＜0.01），显著降低了GSH-PX和SOD活性（P＜0.01）;透射电镜结果可得到在CTD作用后，细胞出现明显的自噬双层膜结构;荧光显微镜下可见CTD诱导LO2细胞出现微管相关蛋白1轻链3（LC3）绿色荧光的分布;Westernblot结果显示，当CTD浓度为6.25μM时，GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、XBP-1s和CHOP蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），当CTD浓度为12.5、25和50μM时，上述蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。当2DG预干预12h，与单纯CTD组相比，GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、XBP-1s和CHOP蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。CTD显著上调了Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Atg3、Atg4A、Atg4B和Atg7的蛋白表达水平（P＜0.05），显著下调了GABARAP的蛋白表达水平（P＜0.05）;同时CTD上调了caspase-3和Bax/Bcl-2比值蛋白表达水平（P＜0.05）。当2DG预给药12h后，CTD再分别继续干预LO2细胞15min、6h和12h以检测自噬和凋亡的关键蛋白，当50μMCTD干预15min时，Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Bax/Bcl-2比值较单独CTD组显著升高（P＜0.05）。但当50μMCTD干预6h和12h时，Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Bax／Bcl-2比值均较单独50μMCTD组显著降低（P＜0.05）。流式细胞术结果显示CTD作用LO2细胞12h后凋亡率呈剂量依赖性增加（P＜0.01），CTD作用于LO2细胞24h后凋亡率呈剂量依赖性增加（P＜0.01）。但当CTD浓度为25μM和50μM时，凋亡率呈剂量依赖性下降，细胞死亡率上升（P＜0.05）。并且CTD干预LO2细胞后可见典型的凋亡形态变化。 2.基于脂质组学的CTD致LO2细胞毒性研究 与空白对照组相比，CTD高剂量组发现差异代谢物33个，其中磷脂酰胆碱类1个、单甘油酯类1个、神经酰胺类1个、酰基肉碱类4个和甘油三酯类26个，且磷脂酰胆碱类、酰基肉碱类和单甘油酯类代谢物代谢水平被显著下调，而神经酰胺类和甘油三酯类代谢物代谢水平被显著上调（P＜0.05）;低剂量组发现差异代谢物6个，其中3个为酰基肉碱类、3个为甘油三酯类，且代谢物代谢水平被显著上调（P＜0.05），以上说明CTD致LO2细胞毒性主要与甘油三酯和酰基肉碱代谢紊乱有关。 结论： 低剂量时CTD可激活ERS，高剂量时CTD可抑制ERS，进而诱导LO2自噬和凋亡产生细胞毒性。进一步脂质组学发现CTD致LO2细胞毒性细胞代谢轮廓发生显著的变化，其致LO2细胞毒性机制主要与甘油三酯和酰基肉碱代谢等异常有关。以上结论可为CTD引起的肝毒性提供了科学依据。
关键词: 斑蝥素 ；肝毒性 ；内质网应激 ；细胞凋亡 ；脂质组学
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