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会议时间： 2014-07-14
摘要： 分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等对樟芝发酵液进行萃取,对四个萃取相提取物的体外生物活性进行了研究,细胞实验显示樟芝发酵液提取物具有体外抗肿瘤、免疫调节、抗衰老以及抗氧化等的生物活性,其中抗肿瘤活性最为显著。对抗肿瘤活性较强的氯仿相和乙酸乙酯相采用硅胶吸附色谱法进行分离,由氯仿相获得得到化合物Ⅰ和化合物Ⅱ。采用HNMR,C NMR以及高分辨质谱等现代光谱技术,进行结构鉴定,确定化合物Ⅰ为新化合物,命名为3-isobutyl-1-methoxy-4-(4-（3-methylbut一2-enyloxy）phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione,化合物Ⅱ为5-羟甲基呋喃甲醛。两个化合物具有很好的体外抗肿瘤活性。
关键词: 樟芝 ；发酵液 ；抗肿瘤活性
摘要： 粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus)经液体发酵后,通过萃取、硅胶柱层析、LH20葡聚糖凝胶柱层析及高效液相色谱对粗毛纤孔菌的发酵液进行分离纯化;通过质谱、核磁共振技术分析鉴定化合物的结构。共分离并鉴定到麦角甾醇(1)、Hispolon(2)、肉桂酸(3)、尿苷(4)、Cyclo(L-Leu-L-Phe)(5)5个具有抑制Hela细胞活性的化合物,其中化合物3、4、5首次从粗毛纤孔菌中分离,化合物5还未有抗肿瘤活性方面的报道。MTT实验结果表明,化合物5能明显抑制Hela细胞,其半抑制浓度(IC50)为21μg·mL^(-1),且利用流式细胞术分析发现化合物5可促使Hela细胞发生凋亡。研究结果可为粗毛纤孔菌发酵液中抗肿瘤活性代谢产物的开发利用提供参考。
关键词: 粗毛纤孔菌 ；抗肿瘤活性 ；代谢产物 ；分离 ；鉴定
被引量
8
摘要： 目的分离鉴定阿维链霉菌I06A-01716发酵液中抗植物病原真菌活性成分,并进行抗真菌、抗肿瘤和免疫抑制活性研究。方法在抗真菌活性指导下,采用硅胶柱层析、凝胶柱层析、HPLC等分离手段对活性组分进行分离;通过高分辨质谱,1D-NMR和2D-NMR对其结构进行鉴定;采用琼脂平板纸片法,进行抗植物病原真菌的最低抑制浓度测定;采用MTT法检测其对肿瘤细胞生长的抑制作用;采用流式细胞仪测定其对细胞周期的影响。结果分离得到2个活性组分:1716-1和1716-2。1716-1和1716-2对人肝癌细胞HepG2的IC50值分别为2.42μg/mL和3.42μg/mL;对人口腔上皮癌细胞KB的IC50值分别为1.64μg/mL和6.73μg/mL。细胞周期研究表明,随着1716-2的浓度增加,在KB细胞中,G2/M期比例由对照组的15.23%逐步升高到36.53%;在HepG2细胞中,G2/M期比例由对照组的4.39%升高到35.78%。结论1716-1和1716-2结构分别与寡霉素B和寡霉素A一致。1716-1和1716-2有抗多种植物病原真菌活性。1716-1和1716-2在较低浓度下能够抑制人肝癌细胞HepG2和人口腔上皮癌细胞KB生长。1716-2使HepG2细胞和KB细胞阻滞在G2/M期。
关键词: 寡霉素A ；寡霉素B ；抗肿瘤活性 ；抗真菌活性
摘要： 牛樟芝是我国台湾地区所产的一种珍稀药用真菌,因其独特的功效而受到人们的关注。随着越来越多的研究人员对其不断地研究探索,发现牛樟芝的菌丝体、子实体以及其发酵液中含有多种有效成分,如多糖、三萜类化合物、酚类化合物、蛋白质、氨基酸等。近年来,牛樟芝的药用研究也引起了广泛的关注。许多研究已经证实了牛樟芝具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗炎等多种生物活性,并且在肿瘤、心血管、糖尿病、肝脏等领域具有潜在的应用价值。本文将对牛樟芝在药学上的研究进行综述,包括牛樟芝的化学成分和药理毒理研究,以期为牛樟芝在药物研究、开发、应用和相关产品的使用等方面提供科学参考。
关键词: 牛樟芝 ；药理作用 ；化学成分 ；药用真菌
被引量
4
会议时间： 2018-08-11
摘要： 肺癌在全球癌症死亡率中占据第一位。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)在所有类型肺癌中所占比例最大。目前主要用于治疗NSCLC的方法是化疗法,然而,临床使用的化疗药物普遍具有较大的毒副作用,且容易产生耐药性。食药用真菌在东方有着独特的经济和医药价值,其天然组分的活性研究更是深得广大研究学者的青睐。因此,从食药用真菌中提取高效低毒的抗肿瘤活性先导化合物,用以研发新药将是生物医药界学者们研究的热点和难点。樟芝是原产于我国台湾的一种珍稀药用菌,具有多种生理活性,尤其是它卓越的抗肿瘤活性。樟芝中的明星分子,安卓喹诺儿,对NSCLC有很好的抑制作用,目前已进入FDA批准的NSCLC二期临床实验。然而,安卓喹诺儿主要来源于樟芝子实体,由于樟芝依赖生长的牛樟树是珍稀保护树种,且子实体生长极其缓慢,使得其研究成本居高不下,不利于科研的顺利进展。液态深层发酵具有原料来源广泛、成本低廉、生长过程短、操作易控制等优点,从液态发酵产物中分离纯化得到与安卓喹诺儿类似的活性物质,就成为十分值得开发的途径。本研究首先以樟芝液态发酵产物的粗提物为材料,研究其对NSCLC的抑制作用,发现其对NSCLC有较好的抑制作用,可引起S期细胞周期阻滞,诱导细胞发生凋亡。然而,粗提物是混合物,包含着许多成分不明的活性物质,很难从中发现发挥主要作用的活性单体物质。因此,后续研究采用实验室前期分离得到的两种单体化合物By-1和Antrodin C进行抗肺癌活性评价,并进一步探究其作用机制。其中,By-1主要来源于发酵液,Antrodin C主要来源于发酵菌丝体。通过对细胞迁移、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及凋亡相关蛋白、细胞自噬等检测来评价By-1和Antrodin C的抗肺癌活性,并探究自噬和凋亡的交互式调控是否参与抗肺癌活性中,进一步探究作用的信号通路。实验发现,By-1和Antrodin C均对非小细胞肺癌SPCA-1细胞株有较好的抑制作用,其作用机制主要是由于引起S期细胞周期阻滞,上调P53蛋白,P53参与ROS和Bcl-2介导的线粒体细胞凋亡途径,进一步引起Caspase家族的级联反应,促进凋亡执行因子Caspase-3的释放,进而诱导细胞凋亡。通过检测自噬性结构,自噬流的发生以及自噬标记蛋白LC3 II表达和LC3 I向LC3 II转变,发现By-1和Antrodin C可诱导SPCA-1细胞发生自噬。并进一步发现自噬发生是通过下调Akt/mTOR通路来介导的。通过自噬抑制剂和自噬激活剂处理细胞,对细胞增殖的检测,发现自噬在By-1和Antrodin C的抗肺癌活性中起保护性作用。将促凋亡化合物和抑制自噬化合物联用,将明显增加对肿瘤细胞的抑制能力,这可能为NSCLC治疗提供一条新思路。肺癌细胞中存在多种类型的基因突变,其中EGFR突变占到了总突变类型的一半以上。有数据表明,对EGFR突变型肺癌,采用靶向性治疗的方法,能达到更好的效果,且预后良好。通过对EGFR突变型细胞株HCC827细胞进行细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的相关检测,发现By-1和Antrodin C可以抑制该细胞增殖,将细胞阻滞在S期,并能诱导细胞发生凋亡。本研究采用不同类型的人非小细胞肺癌细胞系探究By-1和Antrodin C的抗肺癌活性及其分子机制,发现By-1和Antrodin C对NSCLC有较好的抑制作用,其作用机制是由于凋亡和自噬的交互式调控所致。由此可见,By-1和Antrodin C都有可能发展成为潜在的抗肺癌治疗的化疗药物,这也为后续的深入研究提供了理论依据。
关键词: 樟芝 ；非小细胞肺癌 ；细胞凋亡 ；细胞自噬
被引量
1
摘要： 目的运用响应面分析法对蛹虫草液体发酵培养基进行优化,以提高蛹虫草发酵液中抗肿瘤活性物质的含量。方法以对肝癌细胞抑制率为指标,首先进行单因素试验优选出培养基中最佳氮源及其浓度以及葡萄糖和磷酸二氢钾(KH_2PO_4)最佳浓度;再采用响应面分析法确定关键因素之间的配比。结果蛹虫草最佳液体发酵培养基为:葡萄糖浓度20.22 g/L,蛋白胨浓度17.57 g/L,KH2_PO_4浓度0.92 g/L,硫酸镁浓度0.5g/L,在该条件下,肝癌细胞抑制率为70.121%,与模型预测值(70.938%)相接近。结论运用响应面分析法对蛹虫草液体发酵培养基进行了优化,从根本上提高了各活性物质的产量,对后续蛹虫草抗癌活性的研究具有重要意义。
关键词: 蛹虫草 ；发酵液 ；培养基 ；肝癌细胞 ；抑制率 ；响应面分析法
被引量
5
【专利/发明】 • CN201910829856.2 • •
申请日：2019-09-04,
公开日：2019-11-15
申请人： 台州职业技术学院
公开（公告）号： CN110452940A
摘要： 本发明属于代谢产物提取技术领域，公开了一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，利用HP‑20树脂柱洗脱发酵液、硅胶柱和Sephadex LH‑20凝胶柱层析分离、(半)制备高效液相分析与纯化化合物；运用现代仪器波谱分析技术如核磁共振、高分辨质谱等对单体化合物进行结构鉴定。本发明将从土样中分离得到的具有抗菌及抗肿瘤细胞活性的放线菌进行发酵，对其产生的代谢产物和部分产物生物活性进行归纳研究，丰富了微生物化合物多样性；为其他放线菌产活性物质的研究与发掘提供了参考与理论基础；同时，也为探索开发活性天然化合物及商业用药提供了前提。
【专利/发明】 • CN201910829856.2 • •
申请日：2019-09-04,
公开日：2021-03-30
申请人： 台州职业技术学院
公开（公告）号： CN110452940B
摘要： 本发明属于代谢产物提取技术领域，公开了一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，利用HP‑20树脂柱洗脱发酵液、硅胶柱和Sephadex LH‑20凝胶柱层析分离、(半)制备高效液相分析与纯化化合物；运用现代仪器波谱分析技术如核磁共振、高分辨质谱等对单体化合物进行结构鉴定。本发明将从土样中分离得到的具有抗菌及抗肿瘤细胞活性的放线菌进行发酵，对其产生的代谢产物和部分产物生物活性进行归纳研究，丰富了微生物化合物多样性；为其他放线菌产活性物质的研究与发掘提供了参考与理论基础；同时，也为探索开发活性天然化合物及商业用药提供了前提。
【会议论文】 •
+3位作者
会议时间： 2010-11-01
摘要： 目的研究土壤链霉菌HS-HY-197发酵液中抗肿瘤代谢产物。方法采用活性追踪的方法,利用大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱和半制备反相高效液相色谱等分离方法得到单体化合物,根据光谱分析确定其结构,利用CCK8法评价单体化合物的细胞毒活性。结果获得两个单体化合物,鉴定其结构分别为茚满霉素(Indanomycin,1)和Cafamycin(2)。它们都是已知的离子载体抗生素,其中化合物1对人乳腺癌细胞MDA-MB-231,人肝癌细胞HepG-2表现出明显的抑制作用,其IC50值分别为14.01μg·ml-1,7.26μg·ml-1。讨论化合物1值得进行动物体内的抗肿瘤活性评价。
关键词: 链霉菌 ；离子载体抗生素 ；茚满霉素 ；Cafamycin ；抗肿瘤活性
被引量
2
摘要： 癌症是全球人口死亡的主要原因之一,每年新发和死亡病例都居高不下,严重危害了人民的生命健康,且一些恶性肿瘤一旦被发现大多已到晚期,预后差、生存率低,治疗困难。今年一月份国家药品监督管理局批准上市了首个中药原创药——淫羊藿素胶囊（阿可拉定）,在中国肝癌患者的临床治疗中表现出良好疗效,成为中药科技创新的典范。牛樟芝作为台湾特有的珍稀药用真菌,具有显著的抗肿瘤、抗炎等功效,目前已开展的相关研究主要围绕多糖、三萜、泛醌类等活性物质,针对蛋白质类抗肿瘤活性物质的研究较为缺乏。本研究在前期牛樟芝液态发酵优化的基础上,由菌丝体中分离纯化出活性蛋白,初步探究其发挥抗肿瘤活性的作用机制,并实现其在毕赤酵母中的重组表达,为后续规模化开发应用奠定基础。主要研究结果如下:1.通过单因素实验和正交设计优化牛樟芝菌丝体蛋白的提取方法,以Bradford法检测蛋白浓度,确定在4℃条件下,以Tris-HCl为提取缓冲液,1:20的料液比提取8 h,粗蛋白提取得率达到4.3%。2.利用硫酸铵盐析法将粗蛋白进行沉淀处理,再经阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱纯化出活性蛋白;以洗脱组分的抗肿瘤活性为评价指标,筛选出具有显著抑制效果的活性蛋白（Antrodia cinnamomea active protein,ACAP）;单一蛋白条带经质谱鉴定后,通过氨基酸序列与牛樟芝转录组数据的比对,识别出目标基因序列为后续重组表达做准备。3.通过体外试验研究了ACAP对HeLa、Hep G2和Hepa 1-6等不同肿瘤细胞的抑制作用,发现ACAP在较低浓度下对这些肿瘤细胞均有显著性抑制效果,半抑制浓度IC50分别为13.10μg/mL、10.70μg/mL、18.69μg/mL。在此基础上,运用流式细胞仪检测Hep G2细胞的凋亡情况,进一步探究了ACAP抗肿瘤作用机制。结果表明,与对照组相比,ACAP主要诱导了Hep G2细胞的晚期凋亡,早期凋亡的比例较低;Western blot实验证实ACAP影响了细胞凋亡通路中相关蛋白的表达水平,如p53的表达水平显著上调,而下游caspase-3蛋白的表达水平明显下调。4.经质谱鉴定数据比对后,确定与牛樟芝转录组数据覆盖度最高的基因序列（记为ACAP-1）,生物信息学分析结果显示,ACAP-1CDS序列长1080bp,分子量大小约为50 kDa,理论pI为5.9;根据目的基因序列设计引物克隆得到目的片段,以pPIC9K质粒为载体构建重组质粒pPIC9K-ACAP,线性化后电转入毕赤酵母GS115菌株,通过不同浓度遗传霉素筛选得到高拷贝整合重组菌株,最后以甲醇诱导重组蛋白的表达,并初步证实了其抗肿瘤活性。
关键词: 牛樟芝活性蛋白 ；抗肿瘤活性 ；分离纯化 ；细胞凋亡 ；重组表达
被引量
1
摘要： 我国的水产养殖业发展十分迅速,获得了可观的经济效益,但随之而来引发的问题也愈发难以控制,在防治鱼类病害的过程中,由于抗生素药物的滥用,导致鱼类病原菌耐药性增强,污染了水产品和水体生态环境。将益生菌作为微生态制剂代替抗生素应用于水产养殖业已成为一种新型且有效防治鱼类细菌性疾病的技术。本研究从河北省秦皇岛市土壤样品中筛选到一株对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等9种鱼类主要病原菌具有广谱抑菌活性的放线菌,通过16S r RNA分子生物学鉴定以及生理生化实验,鉴定该菌株为沙阿霉素链霉菌（Streptomyces zaomyceticus）,并将其定名为沙阿霉素链霉菌新菌株S1-6。经抑菌谱试验测定,发现菌株S1-6对嗜水气单胞菌等9种鱼类主要病原菌均表现出一定的抑制作用,其中对异常嗜糖气单胞菌（Aeromonas abnormalis）的抑菌效果最佳。经抗生素敏感实验,发现菌株S1-6对氨苄西林（Ampicillin）等抗生素不敏感,而对硫酸安普霉素（Apramycin）等抗生素敏感。经最低抑菌浓度和抑菌效价测定确定了菌株S1-6对鱼类病原菌嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度为160μg/m L,其发酵液效价相当于庆大霉素（Gentamicin）的浓度为380.19μg/m L,相当于卡那霉素（Kanamycin）的浓度为346.74μg/m L。确定了菌株S1-6在生长发酵第72 h时其发酵液的抑菌效果最好,并具有中等热稳定性和强耐酸性等性质,对于蛋白酶K以及胰蛋白酶敏感性极弱,认为该菌株的抑菌活性产物为一种小分子物质。通过对草鱼肝脏细胞L8824的毒性实验和拌菌饲喂试验证明该菌株对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）安全无毒性。对草鱼进行30d的拌菌饲喂实验,发现试验组中草鱼的体重增长率明显高于对照组,10～9cfu/g饲喂组草鱼的体重增长率为17.19%,10～7cfu/g饲喂组草鱼的体重增长率为14.45%,显著高于对照组的体重增长率（7.40%）。通过生化测定,供试草鱼血清中溶菌酶（Lysozyme,LSZ）等酶的活力表达增强。对供试草鱼组织器官中抗氧化因子及免疫因子的表达情况进行测定,发现在肾脏与脾脏中试验组IL-8、LSZ和C3的表达相较于对照组显著上调,而LSZ和C3在肠道中则显著下调。通过病原菌嗜水气单胞菌攻毒实验发现试验组草鱼的存活率分别为80%和60%,而对照组在第5 d全部死亡,说明菌株S1-6可以显著提高草鱼对嗜水气单胞菌的抵抗力。通过小动物成像系统（IVIS）的测定,发现导入绿色荧光质粒的菌株S1-6在14 d内可以在草鱼的鳃部以及肠道中稳定地定殖、增殖和分布。同时利用导入红色荧光质粒的病原菌嗜水气单胞菌对草鱼进行攻毒,在小动物成像系统中观察7 d,发现试验组草鱼中的红色荧光信号明显弱于对照组,并且在攻毒之后试验组草鱼的存活率为80%,明显高于对照组,其中对照组草鱼在第6 d已全部死亡,进一步证明菌株S1-6可以有效提高草鱼对嗜水气单胞菌的抵抗能力。采用生物分子快速纯化系统及超高效液相色谱技术对菌株S1-6的抗菌活性产物进行分离纯化,获得一个对嗜水气单胞菌有抑菌活性的洗脱峰B-2,收集该洗脱峰结合质谱鉴定,发现该物质的质荷比（m/z）为432.05[M+H]+。进一步进行二级质谱分析、菌株S1-6的全基因组测序和生物信息学分析,推测S1-6活性物质为荷伯希二烯（Herboxidiene）的衍生物,该物质是一类具有抗菌、抗肿瘤活性的聚酮类化合物。该菌株基因组全长为8,937,949 bp,GC含量为72.40%,其中共预测到7790个完整的CDS、70个t RNA以及7套16S/23S/5S核糖体RNA。利用COG、KEGG、GO数据库对基因组功能进行注释分析,发现菌株S1-6在新陈代谢方面的功能基因占比较大。利用anti SMASH工具预测到荷伯希二烯、硫藤黄菌素（Thiolutin）、天神霉素（Istamycin）、赛苯霉素（Cypemycin）、兰卡霉素（Lankamycin）、利链菌素（Streptolydigin）等35个次级代谢产物基因簇存在于S1-6基因组中,上述活性物质均具有一定的抗菌作用,为菌株S1-6表现出的抗菌活性提供了重要依据。综上所述,沙阿霉素链霉菌新菌株S1-6有望研制成为一类能应用于鱼类细菌性病害防治的新型微生态制剂,在鱼类的健康养殖、疾病防控等方面具有潜在的应用价值。
关键词: 沙阿霉素链霉菌 ；嗜水气单胞菌 ；草鱼 ；次级代谢产物 ；益生菌
摘要： 目前,癌症是全球死亡的主要原因传统的癌症治疗主要是手术切除、放疗和药物治疗,然而,这三种方法可能在治疗过程诸多不良反应。许多研究正试图使用不同的策略设计或找寻针对各种癌症的新治疗剂,从自然界中挖掘药物仍然是抗癌治疗的前沿方法。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)能够产生各种功能以及活性化合物,通常具有低细胞毒性,并且只产生少许副作用,具有广阔的抗癌潜力,因此,它们似乎是合成抗癌剂的良好替代品。本论文对植物乳杆菌6Y-15产生的抗肿瘤活性化合物进行初步分离以及探寻其对肿瘤细胞促凋亡机制,取得下列主要研究结果:
1.检测6Y-15植物乳杆菌发酵液的抗肿瘤活性
对6Y-15发酵液采用CCK-8法检测其抗肿瘤活性,结果表明其具有较强的体外抗肿瘤活性,对HT-29细胞抑制率达到82.1%,检测发酵液中抗肿瘤活性物质合成量与发酵时间的关系,结果显示,在该菌发酵第6 d时,抗肿瘤活性物质合成量达到最高。对6Y-15发酵液中的抑癌物质进行溶解性的检测,结果表明,该菌的活性物质在能够溶于几种极性不同的有机溶剂,如乙酸乙酯,正丁醇等,且在乙酸乙酯中的溶解性最好。
2.抗肿瘤活性成分粗分以及鉴定
通过硅胶柱层析初步分离抗抗肿瘤活性成分,得到32份分馏组分,并检测各组分抗肿瘤活性,其中编号14的分馏组分拥有极高抗癌活性,抑制活性为93.56%。通过LC-MS对该组分进行化学成份的分析,得到15种化学物质,大多为酸性物质。
3.抗肿瘤活性机制分析结果
对该分离组分进行抗肿瘤作用进行研究,进行细胞形态学观察、AO/EB双染色、Hoechst 33258染色实验,结果表明了6Y-15抗肿瘤活性化合物能够诱导HT-29细胞凋亡。随后对凋亡机制进行探究,通过JC-1检测,发现线粒体膜电位下降,推测发酵液中的活性物质可能通过内源性凋亡通路促HT-29细胞凋亡,因此采用Western blot检测内源性通路相关蛋白:Bcl-2、Bax、Caspase 3、Cleaved-Caspase 3。结果表明随着抗肿瘤活性化合物浓度的增加,Bcl-2表达量下降,Bax表达量升高,Caspase 3被激活,Cleaved-Caspase 3表达升高。综上,抗肿瘤活性化合物通过上调Bax/Bcl-2的比值,导致线粒体膜电位下降,最终激活Caspase-3从而诱导HT-29细胞凋亡。
关键词: 植物乳杆菌 ；抗肿瘤活性 ；提取物 ；细胞凋亡
摘要： 真菌多糖具有免疫调节、降血糖、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性。木蹄层孔菌（Fomes fomentarius）是一种大型药用真菌,主要生长在我国东北地区,含有苷类、多糖、有机酸、甾醇、萜类等化学成分。为了挖掘木蹄层孔菌胞外多糖（Fomes fomentaria exo-polysaccharides,FFEP）的药用价值,本论文以木蹄层孔菌为实验材料,利用大罐深层培养获得FFEP,对其进行分离纯化与结构表征,并研究了主要成分FFEP-1的耐缺氧、降脂护肝、修复烫伤创面活性,及分子修饰后衍生物的抗氧化活性和抗肿瘤作用,主要研究结果如下:
（1）高产木蹄层孔菌产胞外多糖的发酵条件
利用单因素试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验依次确定了液体培养木蹄层孔菌响应面优化的中心点:蔗糖10.0 g·L-1、酪蛋白胨5.0 g·L-1、接种量6.0%。按照响应面分析法（Response Surface Methodology,RSM）中的Box-Behnken Design设计原理,确定影响木蹄层孔菌产胞外多糖的最优培养条件为:蔗糖15.2 g·L-1、酪蛋白胨7.0 g·L-1、接种量6.2%、KH2PO41.0 g·L-1、Mg SO40.5 g·L-1、VB20.625mg·L-1、p H 7.5、培养温度30℃、摇床转速150 rpm、培养时间为10 d。在此条件下,木蹄层孔菌发酵液中多糖含量较未优化时提高了4.02倍。
（2）FFEP-1的纯化及结构表征
木蹄层孔菌的发酵液经脱色、除蛋白等预处理后,将获得的粗多糖再经DEAE-52柱串联层析,获得三种多糖,分别命名为FFEP-1、FFEP-2、FFEP-3。本试验选取含量最高的FFEP-1为研究对象,此多糖具有典型的糖类特征峰,无味、淡黄色粉末,易溶于水,相对分子量约为3.08×10～5Da。气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析结果表明,FFEP-1是一种由甘露糖,葡萄糖和半乳糖组成的杂多糖（摩尔比为0.18:0.24:0.58）。通过核磁共振（NMR）分析发现FFEP-1主链可能是由β-1,2-D-半乳糖（Galp）、β-1,2,3-D-半乳糖（Galp）、α-1,3-D-葡萄糖（Glcp）、β-1,3,4-D-甘露糖（Manp）和α-1,3-D-甘露糖（Manp）构成,其O-2、O-3位被支链α-D-Galp和α-D-Glcp取代的一类新的杂多糖。
（3）FFEP-1的生物活性
经过预实验活性筛选,最终选择耐缺氧、降脂护肝、修复烫伤创面这3种生物活性进行研究。不同浓度（≧50 mg/kg）的FFEP-1均能显著延长不同缺氧条件下的小鼠存活时间,具有显著的耐缺氧活性,处理组红细胞数量和血红蛋白浓度显著增加,并接近于阳性给药组（苯妥英钠,PHT）。不同剂量的FEEP-1（≧100 mg/kg）均对模型小鼠具有不同程度的降脂护肝作用。当FFEP-1用量≧100 mg/kg时,小鼠血清和肝脏的总胆固醇（Total Cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）及脂肪含量,血清中谷丙转氨酶（Alanine Transaminase,ALT）、谷草转氨酶（Glutamic Oxalacetic Transaminase,AST）、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenas,LDH）和碱性磷酸酶（A Lkaline Phosphatase,ALP）等酶活性及总胆红素（Total Bilirubin,T-BIL）含量极显著降低（p<0.01）,抗氧化指标超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase,GPx）、氧化氢酶（Catalase,CAT）显著增加,同时组织丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量显著降低,抗炎相关因子核因子（Nuclear Factor Kappa-B,NF-κB）、白细胞介素1β（Interleukin 1β,IL-1β）、细胞色素P4502E1（CYP2E1）、白细胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）水平显著降低并接近于阳性组。提示FFEP-1能够提高小鼠的抗氧化防御体系、能有效降低高脂引起的肝组织过氧化,并能减弱肝损伤炎性因子对小鼠损伤,促进肝组织重塑。此外,FFEP-1对深二度烫伤的创面修复活性研究发现,5%FFEP-1的软膏能显著促进烫伤创面结痂愈合,缩短烫伤面修复时间;经5%FFEP-1处理烫伤皮肤的基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase,MMP-1）和转化生长因子β（Transforming Growthβ,TGF-β）分泌显著增加,IL-6的释放创面细胞的新陈代谢加快,进而促进烫伤创面的伤口愈合,说明FFEP-1能抑制伤口初期感染,有效促进烫伤创面伤口后期修复和再生。
（4）FFEP-1的分子修饰及体外抗氧化活性
FFEP-1经磷酸化、硫酸化及硒化修饰,傅立叶变换红外（Fourier Transform Infrared,FT-IR）分析验证产物修饰成功。体外抗氧化活性研究结果表明,FFEP-1经磷酸化、硫酸化及硒化修饰后的抗氧化活性明显增强。磷酸酯化多糖（PFFEP-1）对羟基自由基和O2-的清除最大,清除率分别比FFEP-1提高了91.55%、57.85%;硫酸酯化多糖（SFFEP-1）显著抑制脂质过氧化和DPPH,抑制率分别比FFEP-1提高了99.78%和41.09%。FFEP-1及其衍生物的多糖还原力表现为SFFEP-1>PFFEP-1>Se FFEP-1>FFEP-1,且均随着浓度的增加逐渐增强。
（5）FFEP-1及其衍生物的抗Eca109肿瘤作用
以人食管癌Eca109细胞为实验模型,研究了FFEP-1及其SFFEP-1、PFFEP-1的抗肿瘤作用。结果显示,随着待测物浓度增加,Eca109细胞凋亡明显,当浓度为400μg/m L时,SFFEP-1、PFFEP-1、FFEP-1处理48 h后,对Eca109细胞的抑制率分别为52.45%、69.47%和41.73%,细胞凋亡率呈一定的剂量依赖关系。不同浓度的FFEP-1、SFFEP-1和PFFEP-1能诱导Eca109细胞内产生ROS,能够调节Eca109细胞内醌氧化还原酶-1（NADPH Quinine-Oxidoreductase-1,NQO-1）、血红素加氧酶1（Heme Oxygenase 1,HO-1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、锰超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase 2,SOD-2）等抗氧化酶,同时能显著抑制Nrf2（NF-E2-related factor 2）介导的抗氧化防御系统。并且,FFEP-1、SFFEP-1和PFFEP-1能诱导Eca109细胞内线粒体膜电位改变,进而激活线粒体凋亡途径,引起B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）蛋白家族中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表达量显著降低,促凋亡蛋白Bax和Bak表达量显著增加,从而抑制Eca109细胞的增殖。此外,SFFEP-1能够使Eca109细胞停滞在G2/M期,PFFEP-1将Eca109细胞在停滞S期,进而延长肿瘤细胞的周期,抑制损伤细胞的DNA修复。
关键词: 木蹄层孔菌胞外多糖 ；分级分离 ；结构表征 ；分子修饰 ；生物活性
被引量
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摘要： 小刺猴头菌是一种珍贵的食药用真菌,其工厂化生产采用液体深层发酵技术,以发酵液浓缩后的发酵浸膏入药,用于治疗萎缩性胃炎、消化性溃疡等胃肠疾病。研究表明,多糖和寡糖是小刺猴头菌发酵浸膏重要活性成分,关于其抗炎、抗肿瘤、调节肠道菌群等活性有较多的研究报道,但是对其抗氧化活性尤其是细胞水平抗氧化活性的研究还比较少,而慢性炎症、溃疡、肿瘤等疾病的发生和发展与细胞氧化还原平衡出现紊乱有关。因此,本试验对小刺猴头菌发酵浸膏多糖和寡糖进行分离和纯化,分析其化学性质,并对化学抗氧化和细胞抗氧化活性进行研究,以明确其抗氧化活性组分及其作用机制,为相关产品的开发和应用提供参考。本研究采用乙醇沉淀、膜透析以及柱层析方法对不同分子量多糖和寡糖进行分离和纯化。通过测定还原糖、可溶性蛋白、糖醛酸、硫酸基和氨基糖含量对其化学组成进行分析,采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法和FI-TR分析单糖组成和结构。采用化学反应体系对主要多糖和寡糖组分的抗氧化能力进行检测,筛选出具有抗氧化活性的含糖组分;再建立H2O2氧化损伤的RAW264.7巨噬细胞模型,检测细胞活力、抗氧化酶活性、细胞MDA和ROS水平,以及细胞凋亡率,进一步确定各组分对细胞氧化损伤的保护作用。采用q-PCR法检测对抗氧化酶基因转录的影响,利用Western-Blot分析检测对信号蛋白MAPK和Nrf2的激活情况,初步明确其抗氧化损伤的分子机制。主要结果如下:（1）获得了4种粗糖组分:d-HFCO1（500 Da以下）、d-HFCO2（500-5,000 Da）、d-HFCP1（5000-50,000 Da）、d-HFCP2（50,000 Da以上）,以及13种纯化后的组分,其中有2种高纯度的中性寡糖d-HFCO1-1和d-HFCO2-1（总糖含量88.90%和97.43%）和1种较高纯度的中性多糖d-HFCP1-1（总糖含量55.43%）。（2）HFCO还原糖含量较高,蛋白质主要存在于HFCP中,粗糖各组分均含有少量的糖醛酸、氨基糖和硫酸基。单糖组成均以Glc为主,随着分子量增大,单糖种类增多,Gal比例增大。d-HFCO1-1、d-HFCO2-1具有α和β两种糖苷键,d-HFCP1-1以β-糖苷键为主。（3）ABTS和DPPH自由基清除能力为:d-HFCP150值由小到大的顺序为:d-HFCO150值,d-HFCP1-150值均超出试验浓度范围。（4）d-HFCO2和d-HFCP1均可显著提高细胞活力,降低MDA水平,提高T-SOD、GPx和CAT的活性（p<0.05）;2种中性糖组分可显著提高细胞活力,降低MDA水平（p<0.05）,d-HFCO2-1显著提高CAT的活性,d-HFCP1-1显著提高T-SOD和CAT活性（p<0.05）。d-HFCO2-1和d-HFCP1-1都能抑制ROS的产生,减少细胞的死亡和凋亡。（5）d-HFCO2-1和d-HFCP1-1均能显著提高Mn-SOD、GPx1和CAT的mRNA的相对含量（p<0.05）,促进三种抗氧化酶的基因转录。d-HFCP1-1的活性高于d-HFCO2-1,与其促进抗氧化酶活性的趋势一致。（6）d-HFCP1-1处理促进了Nrf2蛋白与Keap1的解离,以及Nrf2的核移位,在1.5h时即可达到显著性水平（p<0.05）。结论:（1）HFC含糖组分以中性糖为主,含少量酸性糖,寡糖含量较高。（2）HFCO和HFCP可以通过清除自由基、提高抗氧化酶活性、抑制MDA和ROS的产生、降低细胞的凋亡率,对H2O2氧化损伤的RAW264.7细胞起到保护作用,多糖的效果优于寡糖,粗糖的效果优于中性糖。（3）HFCO和HFCP的抗氧化作用可能与其降低MAPK蛋白的磷酸化水平、促进Nrf2的核移位有关。综上所述,本研究明确了小刺猴头菌发酵浸膏多糖和寡糖中抗氧化活性的主要组分,初步揭示了其抗氧化机制,为小刺猴头菌的合理开发利用提供了理论依据。
关键词: 小刺猴头菌发酵浸膏 ；多糖 ；寡糖 ；抗氧化 ；MAPK ；Nrf2
被引量
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摘要： 茯砖茶是一种有400多年历史的黑茶,具有降脂减肥、降血糖、保肝、免疫调节等多种有益人体健康的作用。作为一种后发酵茶产品,其独特的发酵工艺称为“发花”。冠突曲霉(Aspergillus cristatus)被称为“金花菌”,是参与茯砖茶发酵的主要真菌,对茶叶的感官品质和保健品质的影响很大,其数量是茯砖茶质量的重要指标。冠突曲霉胞外多糖(EPSs)和胞内多糖(IPSs)作为可能存在于茯砖茶中的重要生物活性物质,目前相关研究还很有限,仅限于一些提取优化、理化性质以及抗氧化、降脂和抗肿瘤活性等初步研究。然而,冠突曲霉EPSs和IPSs在体内对机体免疫系统和肠道菌群的影响尚未见报道。目前,对冠突曲霉EPSs/IPSs、免疫系统和肠道菌群之间的相互作用的关系还不清楚。因此,本研究首先将EPSs和IPSs分离纯化,对其理化性质、初步结构及其体外免疫调节活性进行简要分析。然后聚焦冠突曲霉EPSs和IPSs对免疫抑制小鼠的免疫功能及肠道菌群的调节作用,并进一步研究EPSs和IPSs对结肠炎的缓解作用及其对肠道屏障功能的调节,深入探讨其在调节免疫反应和维持肠道稳态中的作用。主要结果如下:1.EPSs和IPSs的分离纯化、理化性质及其体外免疫调节活性本实验采用水提醇沉法和超声波辅助提取法从冠突曲霉发酵液和菌丝体中分别提取出胞外和胞内粗多糖(CEPSs和CIPSs),经Sevage法、透析等步骤除去蛋白及各种小分子杂质后,通过DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析纯化得到其对应的两个主要纯化组分EPSs-2和IPSs-2。EPSs和IPSs总糖含量较高,主要为中性多糖,其中EPSs相比于IPSs含更高的糖醛酸,而IPSs-2几乎不含糖醛酸。经纯化后,EPSs-2和IPSs-2的总糖含量显著提高,其蛋白及多酚含量显著降低。EPSs和IPSs均是主要由甘露糖和半乳糖组成的杂多糖,EPSs-2的单糖组成摩尔比为甘露糖:核糖:葡萄糖醛酸:葡萄糖:半乳糖=4.3:0.5:0.4:1.2:3.6,IPSs-2的单糖组成摩尔比为甘露糖:核糖:葡萄糖:半乳糖=4.4:0.4:1.1:4.1。EPSs-2和IPSs-2的平均分子量分别为5.60、17.98 k Da。EPSs和IPSs都具有良好的热稳定性。此外,以小鼠巨噬细胞RAW264.7为细胞模型,对EPSs-2的体外免疫调节活性进行了初步评价。发现EPSs-2对RAW264.7细胞无明显的细胞毒性,并且能够显著促进细胞对NO、TNF-α和IL-6的分泌并呈现明显的剂量关系,表明EPSs-2在体外对RAW264.7细胞具有良好的免疫调节作用。2.EPSs和IPSs的免疫调节功能及其对肠道菌群的调节作用采用环磷酰胺(Cy)诱导的免疫抑制小鼠模型评价EPSs和IPSs对机体免疫功能和肠道菌群的调节作用。结果表明EPSs-2、CIPSs和IPSs-2对Cy诱导的免疫抑制小鼠具有较强的免疫调节作用,其中,EPSs-2作为主要纯化组分,比CEPSs具有更有效的活性,而CIPSs和IPSs-2的差异不明显。主要表现在小鼠体重和日采食量的恢复,免疫器官指数(胸腺指数、脾脏指数)的增加,血清中细胞因子和免疫球蛋白(TNF-α、IL-1β、IFN-γ和Ig A)水平显著提高。通过对空肠和结肠病理分析发现,EPSs和IPSs干预可减轻Cy诱导的空肠和结肠组织损伤,显著增加空肠的绒毛长度及绒毛长度/隐窝深度比值(V/C),促进结肠中紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-1)和粘蛋白(MUC2)的表达,增强肠道屏障功能和黏膜免疫。同时,EPSs和IPSs干预可显著增加不同种类的短链脂肪酸(SCFAs)的产生,并且EPSs-2和IPSs-2干预显著上调了结肠中SCFAs受体(GPR41、GPR43)和细胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)的表达。此外,EPSs和IPSs干预可以平衡Cy诱导的小鼠肠道菌群的紊乱,其中,EPSs主要通过促进Muribaculaceae、Prevotellaceae＿UCG-001、Bacteroides、Parabacteroides和Tidjanibacter的生长,降低Helicobacter、Bilophila、Mucispirillum、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Clostridiales的相对丰度,从而调节菌群结构。IPSs通过促进与免疫指标呈正相关的益生菌Muribaculaceae、Muribaculum、Duncaniella＿muris、Bacteroides acidifaciens、Parabacteroides、Barnesiella的生长,抑制与免疫指标呈负相关的条件致病菌Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Clostridiales、Bilophila、Helicobacter、Mucispirillum＿schaedleri的生长,从而维持肠道微生态平衡。3.EPSs和IPSs对小鼠结肠炎症的缓解及肠道屏障功能的调节通过建立葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠模型,研究EPSs和IPSs干预对小鼠结肠炎的缓解作用及其对肠道屏障功能的调节作用。结果表明,EPSs-2、CIPSs和IPSs-2干预对改善小鼠结肠炎的具有较强的作用,尤其是IPSs-2具有更有效的活性。主要表现在能够恢复小鼠的体重、固态粪便的形态、颜色和质量,改善结肠形态并抑制结肠萎缩等症状,并显著抑制粪便中Lcn-2水平,显著降低血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6和LPS的含量,上调小鼠结肠组织中抗炎性因子IL-10和下调炎症相关基因TNF-α、IL-1β、i NOS和TLR4的表达。另外,EPSs和IPSs对小鼠结肠炎的缓解作用与其肠道屏障功能的调节密切相关,EPSs-2和IPSs对结肠的病理损伤具有明显的缓解作用,并改善DSS诱导的杯状细胞减少和粘液产生缺陷,增强ZO-1、Occludin、Claudin-1和MUC2的m RNA水平的表达,促进紧密连接蛋白和粘蛋白的产生,从而增强肠道屏障功能及肠道粘膜免疫。同时,EPSs-2和IPSs干预显著促进SCFAs产生,并上调SCFAs主要受体GPR43、GPR41和GPR109A的m RNA表达,在维持肠道屏障功能和缓解结肠炎中发挥重要作用。
关键词: 冠突曲霉 ；胞内外多糖 ；免疫调节 ；肠道菌群 ；结肠炎 ；肠道屏障功能
摘要： 近年来,弱磁场因其具有显著提高酵母菌、猴头菌等多种微生物的生物量,以及乙醇、抗生素、酶和多糖等代谢产物产量的作用,而成为众多物理场辅助微生物生长代谢手段中备受关注的研究方向。樟芝（Antrodia camphorata）是一种寄生于牛樟树上的珍贵食药用真菌,因含有多糖、三萜类、固醇类等生物活性成分而具有极高的应用和商业价值。本文采用弱磁场辅助发酵的方式提高樟芝液态发酵效果,并从樟芝菌丝体形态结构、细胞膜流动性、菌丝体多糖、菌丝体三萜类化合物、发酵液挥发性成分的等方面研究弱磁场对樟芝液态发酵的作用效果,为弱磁场在辅助珍稀食药用真菌的液态发酵中的应用提供依据,并为进一步研究弱磁场的磁致效应机制奠定基础。主要结果如下:（1）以菌丝体的生物量、多糖产量及三萜类化合物产量为指标,确定了弱磁场辅助樟芝液体发酵的最佳发酵时间为9天。当发酵时间为9天时,菌丝体生物量、多糖产量及三萜类化合物产量分别达到3.478 g/L、0.01755 g/L和0.04091g/L,随磁场强度进一步增加,菌丝体生物量维持稳定,无显著性变化,菌丝体多糖产量也不再显著增加,而三萜类化合物产量开始降低,当磁场强度为180 mT时达到最低。因此,90 mT的弱磁场可对樟芝液体发酵呈现促进作用,而磁场强度过大则可能会影响到樟芝的生长和代谢,从而影响发酵效果。（2）90 mT磁场处理下菌丝体更加分散,延伸度更好,更饱满,进一步增大磁场强度,部分菌丝体出现受损现象。一定强度范围的弱磁场可使樟芝菌丝体细胞膜流动性增加,磁场强度为90 mT时,膜流动性最大,磁场强度继续增大至120 mT和180 mT时,细胞膜流动性趋于稳定。结合菌丝体生物量对弱磁场强度的响应规律,推测细胞膜流动性的变化可能是弱磁场促进樟芝菌丝体生物量积累的原因之一。（3）对照组、90 mT和120 mT磁场处理组的樟芝菌丝体多糖均分离纯化得到多糖Ⅰ和多糖Ⅱ。其中,对照组与90 mT处理组的多糖Ⅰ的单糖组成相同,均由果糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖和半乳糖五种单糖组成,但单糖之间的比例存在差异,而120 mT处理组的多糖Ⅰ的单糖组成只含有果糖、鼠李糖、葡萄糖和半乳糖四种单糖;各处理组的多糖Ⅱ均由果糖组成,但含量较少。对照组、90mT和120 mT磁场处理组的菌丝体多糖样品对肿瘤细胞A2780均呈现出抑制作用,且90 mT的磁场强度处理组的菌丝体多糖抗肿瘤活性最好,这可能与樟芝菌丝体多糖的单糖组成的种类和比例等一级结构发生变化有关。经LC-MS分析,对照组、90 mT和120 m T磁场处理组的菌丝体均含有齐墩果酸、赤芝酸和灵芝酸C2这三种主要的三萜类化合物。90 mT和120 mT磁场处理组樟芝菌丝体三萜类化合物的总抗氧化能力有明显提高,对超氧阴离子和羟基自由基的作用并不显著,因此推测弱磁场促进樟芝菌丝体三萜类化合物总抗氧化活性可能是与樟芝三萜类化合物间比例的变化有关。（4）各处理组樟芝发酵液挥发性成分的SPME-GC-MS测定结果显示,对照组及不同磁场处理组的发酵液均含有醇类、酯类、醛类、酮类、烯类及酚类等成分,经分析相比对照组,磁场强度为90 mT时,一些具有抗菌活性的挥发性物质含量增加,而当磁场强度增加到120 mT和180 mT时,一些具有抗菌活性的挥发性物质消失,同时也产生对人体有害的物质。
关键词: 樟芝 ；弱磁场 ；液态发酵 ；多糖 ；三萜类化合物 ；生物活性
被引量
5
摘要： 甲壳素是由N-乙酰氨基葡萄糖残基经过β-1,4糖苷键聚合而成一种天然碱性多糖,广泛存在于地球的水陆生态系统中,自然界中甲壳素的含量仅次于纤维素,它是许多真菌细胞壁和甲壳类动物外骨骼的重要组成部分,每年全球约产生1000亿t甲壳素。由于其结构中含有N元素,因此其降解产物可以作为许多化工业产品的基础物质,具有极高的商业价值。由于天然甲壳素结构紧密,溶解性极差,这大大限制了甲壳素的应用。但由甲壳素降解所得的甲壳低聚糖克服了这一缺点,具有良好的溶解性,还具有例如抗菌、抗氧化和抗肿瘤等生理活性,应用前景广泛。目前,工业上常用酸水解法制备甲壳素及其低聚物等附加产品,但这一方法操作过程复杂不易控制,产率低且容易对环境造成严重的污染,与之相比生物酶降解甲壳素反应条件温和,产品聚合度高且基本不会造成环境污染,因此采用专一性酶水解甲壳素制备其低聚物等附属产品成为研究的热点。自然界中,微生物是甲壳素专一性水解酶——甲壳素酶的重要生物来源,因此如何通过一定的实验手段优化微生物发酵产甲壳素酶的能力,并降低发酵产酶成本,以此来满足工业化生产甲壳素酶,这仍然是开发利用甲壳素资源的重要研究课题。本研究对筛选所得的一株可以产甲壳素酶的菌株Streptomyces No.6进行全基因组分析,从基因组遗传水平上深入了解该菌株的遗传背景信息以及如何降解利用甲壳素,并根据KEGG数据库的分析结果尝试构建了该菌株降解甲壳素的代谢网络,为后续对其进行基因改造奠定了基础。然后通过单因素对所得的菌株产甲壳素酶的发酵条件和发酵培养基进行优化,并根据单因素实验结果选择对产甲壳素酶有显著影响的三个因素进行响应面实验设计,对这三个因素的不同水平进行优化,进一步提高该菌株产甲壳素酶的能力。同时通过恒重法研究该菌株对粉末甲壳素的利用率,通过HPLC分析该甲壳素酶的降解产物。最后对发酵所得的发酵液进行硫酸铵盐析得到提纯后的酶液,并对该酶液进行酶学性质的研究,确定该菌株所产甲壳素酶的最适反应条件。实验结果如下:1、根据KEGG数据库的分析结果尝试构建了该菌株体内甲壳素的代谢网络,初步了解了甲壳素的代谢过程,为后续对其进行基因改造奠定基础。基于氨基酸序列分析构建了甲壳素酶的系统进化树,比较分析了其进化关系,筛选出两条具有重要研究价值的甲壳素酶基因GL001524和GL006593。2、Streptomyces No.6的最优发酵条件为:甲壳素0.5%,壳聚糖0.1%,（NH4）2SO40.5 g/L,Ca Cl2·2H2O 0.01 g/L,接种量为1.5%,初始p H值为5.5,发酵时间为144 h,发酵温度为28℃,发酵转速为400 rpm/min,优化后的酶活为6.3756 U/m L。3、发现随着发酵时间的增长,甲壳素的利用率逐渐增长,在发酵168 h后,甲壳素利用率达到43.15%。HPLC实验结果显示Streptomyces No.6发酵所产甲壳素酶的水解产物中含有还有大量的（Glc NAc）5、（Glc NAc）3、Glc NAc以及少量的（Glc NAc）2,由此可以推测Streptomyces No.6发酵产生的甲壳素酶可以降解甲壳素为多种甲壳寡糖。4、得到该酶的特性如下:最适反应温度为65℃,最适反应p H值是5,表示该甲壳素酶是酸性甲壳素酶;温度稳定范围是35℃-70℃,p H值稳定范围是p H 4-p H 8,最适反应底物是胶体甲壳素;金属离子对该甲壳素酶活性影响不是很显著,与其他金属离子相比,Zn2+可以提高甲壳素酶活性,但效果不是很显著,EDTA和Tween-80对该甲壳素酶活性的影响不是很显著,但SDS对该甲壳素酶具有显著的抑制作用。
关键词: 链霉菌 ；甲壳素酶 ；全基因组测序 ；发酵优化
被引量
2
摘要： 多糖是与蛋白质和核酸同等重要的一类生物大分子,在细胞环境中起着重要作用,包括细胞间的识别辨认、细胞的迁移和粘附等。多糖在动植物和微生物中均有存在,分布广泛。其中,真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体和发酵液中分离出来的一类多糖。大量药理实验表明,这些多糖具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化和免疫调节等作用。本论文中我们所关注的两种真菌多糖是来自牛樟芝和烟曲霉菌中的半乳甘露聚糖。牛樟芝是一种珍贵的台湾地区特有药用真菌,可用于治疗各种疾病,包括肝脏疾病、腹痛、药物中毒、腹泻、皮肤瘙痒、高血压和癌症等。多糖是牛樟芝中存在的主要药理活性成分之一,具有肝脏保护作用、抗血管生成作用、抗氧化作用、免疫调节作用、抗炎和抗肿瘤活性等。研究发现,牛樟芝半乳甘露聚糖是一类具有重要生物活性的多糖,能够显著增强小鼠巨噬细胞的吞噬作用和杀菌能力,且能够刺激免疫活性并减轻严重炎症的风险。因此,此聚糖可作为开发针对多种疾病的营养补充剂和佐剂的候选药物。烟曲霉菌是一种最普遍的空气传播真菌病原体,可在免疫功能低下的患者中引起严重且通常是致命的侵袭性曲霉病。研究发现,烟曲霉菌产生的主要碳水化合物抗原是半乳甘露聚糖,此聚糖能够诱导宿主的特异性免疫反应。因此,在临床上,通常采用检测循环在患者体液中的这种多糖抗原来诊断侵袭性曲霉病的感染。鉴于上述两种真菌半乳甘露聚糖的重要生物活性和潜在的应用价值,同时考虑到天然提取的多糖存在微观不均一性、纯度较差、结构变化大等问题,本论文拟通过化学合成法制备具体明确结构特征的相关寡糖片段,为系统地进行相应的构效关系研究奠定基础。本论文主要包括以下三个部分:一、在第一章前言中,我们对真菌多糖做了简要的概述,重点总结了真菌多糖的多种功能与应用。同时,我们介绍了所关注的两种真菌多糖牛樟芝和烟曲霉菌半乳甘露聚糖,并阐述了两种真菌多糖的重要生物学功能以及合成进展等研究现状。二、牛樟芝半乳甘露寡糖片段的合成与初步活性评价。我们利用前期八糖合成过程中的部分糖基模块,分别通过[2+2]和[2+2+2]的组装策略合成了四糖ACP-2、ACP-3和六糖ACP-4,以及通过催化氢化反应脱除保护基制得了六糖ACP-5。在四糖ACP-2和ACP-3的合成过程中,我们采用三氯乙酰亚胺酯供体来进行糖苷化偶联,并通过邻基参与效应和乙醚的溶剂效应来构建α构型的糖苷键,从而高产率地制得了全保护四糖ACP-14和ACP-17,最后脱除所有保护基、还原叠氮基为氨基得到目标四糖分子ACP-2和ACP-3;在六糖ACP-4的合成过程中,我们利用了三苯甲基选择性保护伯羟基来构建单糖模块ACP-19,然后通过硫苷供体和三氯乙酰亚胺酯供体来依次糖苷化偶联,并以酰基的邻基参与效应和乙醚的溶剂效应来确保生成的糖苷键构型专一。在此基础上,我们评价了五种半乳甘露寡糖片段ACP-1、2、3、4和5对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw 264.7的增殖和吞噬作用,发现四糖ACP-3、六糖ACP-5和八糖ACP-1具有相对较好的生物活性,其中以半乳甘露聚糖主链片段ACP-3效果最佳。因此,我们推测牛樟芝半乳甘露聚糖的免疫活性可能是主链结构起重要作用。三、烟曲霉菌半乳甘露聚糖相关四糖片段的合成。我们以D-半乳吡喃糖为原料构建了单糖模块AFP-3和AFP-4,而以2-乙酰基甘露糖模块AFP-6为原料构建了单糖模块AFP-5。我们通过[1+1+1+1]的组装策略,采用预活化糖基化方法来合成半乳甘露四糖AFP-1。合成过程中,β构型糖苷键可通过糖基供体C-2位苯甲酰基的邻基参与效应来实现。首先,单糖供体AFP-3经预活化试剂对甲苯硫氯充分活化后,与单糖受体AFP-4发生糖苷化偶联,得到二糖AFP-14。随后,将AFP-14作为供体并充分活化,使其再次与单糖受体AFP-4糖苷化偶联,制得三糖AFP-15。最后,将AFP-15活化后与甘露糖受体AFP-5进行偶联,得到全保护四糖AFP-16,并将其脱除所有保护基,并还原叠氮为氨基,即得到目标分子AFP-1。
关键词: 牛樟芝 ；烟曲霉菌 ；半乳甘露聚糖 ；寡糖 ；化学合成
摘要： 补体系统是人体非常重要的免疫防御系统之一,其在消除微生物入侵和维持机体的平衡等生理过程中起着重要作用。但是,补体系统如果过度激活会引起类风湿性关节炎、老年性痴呆及急性呼吸窘迫综合征等多种疾病。天然产物来源的抗补体活性成分具有可持续生产,且能在体内被直接消化吸收等优点因此引起了国内外学者广泛的关注。由于微生物易于培养、易于基因工程改良,且微生物来源的产品质量容易控制,所以微生物来源的抗补体活性物质具有良好的应用前景。然而,目前对微生物来源抗补体活性物质的研究还非常有限。海洋放线菌次级代谢产物复杂多样,且具有众多生物活性,如抗细菌、抗真菌、抗病毒、细胞毒性和抗肿瘤活性,因此海洋放线菌已成为新药研究与开发的新来源,但目前对海洋放线菌的抗补体活性物质的研究还处于起步阶段。本课题首先筛选了具有抗补体活性的海洋来源链霉菌,并对两株产抗补体活性物质的菌株星海链霉菌Streptomyces xinghaiensis NRRL B24674T(简称 S187)和海洋链霉菌Streptomyces sp.DUT11(简称DUT11)进行了深入研究,得到以下主要结果:(1)对分离自大连星海湾和小平岛海平面以下约10m处的海泥样品中的42株海洋放线菌进行了抗补体活性物质生产菌筛选,发现7株海洋放线菌的发酵液具有良好的抗补体活性。对这7株放线菌进行了 16S rRNA基因序列分析,发现这些海洋放线菌分别属于不同的种,提示可产生抗补体活性物质的海洋放线菌菌株有丰富的生物多样性。(2)进一步研究了具有良好抗补体活性的菌株星海链霉菌S187抗补体活性物质的生产,对其抗补体活性次级代谢产物的发酵培养基进行优化,并对抗补体活性物质进行了分离纯化和结构解析。首先,选取7种不同培养基对菌株S187进行了发酵条件优化,确定M12培养基为最佳培养基,并对其发酵条件进行优化,确定最佳发酵条件为:初始pH为7.0,温度为28 ℃,培养时间为6天。然后,比较了野生菌株S187和抗补体活性消失的突变菌株△sinH-P3的次级代谢物,寻找抗补体活性物质,液相色谱分析发现两个菌株的多个次级代谢物含量存在差别,结合液相质谱质谱联用分析,初步判断了抗补体活性化合物所对应的液相色谱对应峰。最后,通过抗补体活性追踪的方法,对菌株S187发酵提取物粗品进行了分离纯化,采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、薄层层析色谱和高效液相色谱等各种分离纯化的方法,从粗提物中纯化获得4个小分子化合物,经过理化性质、质谱和核磁共振分析(1H-NMR和13C-NMR),并结合文献值对照,最终确定这4个化合物分别为2-吡咯甲酸、对羟基苯甲酸、邻羟基苯甲腈和邻氨基苯甲酸。活性测试表明,这4个化合物均有抗补体活性,其CH50分别为2.0 ± 0.3、0.8 ± 0.1、2.4± 0.5和2.5 ± 0.6 mmol/L。(3)以可生产抗补体活性物质的海洋链霉菌DUT11为研究对象,对其基因组序列进行分析,分析基因组次级代谢物生物合成基因簇信息,发现存在衣霉素生物合成基因簇。对DUT11的菌丝体和发酵液进行分析,发现均有衣霉素存在,进而通过优化培养基大量发酵获得粗提物,对抗补体活性组分进行薄层层析色谱、正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱和重结晶等各种分离纯化的方法,最终获得9个化合物,经过理化性质和高分辨质谱分析,确定了 5个化合物的结构,分别是衣霉素I、衣霉素II、衣霉素V、衣霉素VII、衣霉素X,其余4个化合物是经过理化性质和波谱分析(LC-MS、1H-NMR和13C-NMR),并结合文献值对照,确定其结构分别是3-吲哚甲酸、对羟基苯甲酸、2-吡咯甲酸和无活菌素。在抗补体活性测试中除了无活菌素外,其它8个化合物均具有抗补体活性,其中衣霉素X的抗补体活性最好,其CH50为 0.041 ± 0.03 mg/mL。(4)对海洋链霉菌DUT11的衣霉素及抗补体活性物质发酵生产的最佳条件进行了优化。该菌株在NaCl浓度为10%时可以生长,NaCl浓度为3%时菌株生长最好,衣霉素的产量最大,为30.78 mg/L;而NaCl的浓度在0-5%时抗补体活性没有明显的变化。其次,对链霉菌株DUT11进行衣霉素生产培养基优化,确定了 M33培养基作为基础培养基。最后,采用了响应面方法对其培养条件进行优化,确定了衣霉素生产的最佳工艺条件为:可溶性淀粉的浓度(A)、黄豆粉的浓度(B)和酵母粉的浓度(C)分别为49.97、24.88和4.15 g/L,衣霉素的产量可到达57.03 mg/L;而抗补体活性物质生产的最佳工艺条件为A、B和C分别为47.56、18.00和3.92 g/L,提示该菌株可产生除衣霉素外的其他抗补体活性物质。本研究通过对抗补体活性物质生产菌的筛选,证明了许多海洋放线菌具有产生抗补体活性物质的潜力。同时,对星海链霉菌S187和海洋链霉菌DUT11的抗补体活性物质进行了分离纯化和结构鉴定,所取得的结果为进一步开发微生物来源的抗补体活性物质以及高效经济地生产抗补体活性药物提供了借鉴。
关键词: 海洋链霉菌 ；抗补体活性物质 ；次级代谢产物 ；衣霉素 ；基因组测序
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