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1. 认领

【期刊论文】 • 黄淑惠徐诗伟法幼华 • 《微生物学报》 • 1989年第1期 68 - 71，共4页

机构： [1] 中国科学院微生物研究所

摘要：对新月弯孢霉AS3.4381的菌丝体转化16α-甲基Reichstein's化合物S21-醋酸酯(Ⅰ)生成16α-甲基氢化可的松(Ⅱ)进行了研究。培养24h的菌丝体的11β-羟基化活性最高;乙醇对此羟基化活性的抑制作用明显。当(Ⅰ)浓度为0.15%,转化72h,产物(Ⅱ)的重量收率为55.4%。

摘要译文

关键词: 新月弯孢霉 ；羟基化 ；氢化可的松

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2. 认领

【学位/博士】 • 陈晶 • 中国科学院大学 • 导师：张学礼 • 2019年

摘要：甾体化合物，是一类广泛分布于动植物体内的，具有重要生物学作用和药理学功能的化合物。近年来，甾体药物因其广阔的应用范围成为世界上仅次于抗生素的第二大类药物。随之而来的是对甾体药物生产方式的一场革新。原始的甾体药物生产方式多以动植物提取和（半）化学合成为主，伴随着高污染、高能耗和低效率的缺陷。所以，以简单、安全、高效的微生物合成替代原有的（半）化学合成等生产方式成为甾体药物生产转型的关键。本研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为核心分别采用生物转化和从头合成两种方式对三种甾体化合物的生产进行深入探究，为实现甾体工业的生产转型提供助推。　　以基础甾体药物氢化可的松为目标产物，首先，通过转录组学分析结合酿酒酵母异源表达功能验证，解析了传统生物转化宿主蓝色犁头霉(Absidia orchidis)的甾体C11β羟化酶系统（CYP5311B2、AoCPR和AoCytb5）。实验发现，这套真菌体系在酿酒酵母中的催化能力相比已知的哺乳动物体系(CYP11B1、Adx和AdR)高6倍。随后，通过半理性设计进一步提高了CYP5311B2的催化活性，R126D/Y398F双突变体相比野生型的催化活性提高约两倍。继续的，应用代谢工程策略对酿酒酵母中C11β羟化酶系异源表达体系进行优化（包括:密码子优化、副产物合成相关基因敲除、关键元件的异源同工酶筛选比较，关键基因表达调控等）提高其功能模块与细胞间的适配性，氢化可的松生产速率达到223mg/L·d。进一步在酵母细胞中引入新月弯孢霉（Cochliobolus lunatus）来源的新型甾体转运蛋白ClCDR4，增强甾体底物分子对酵母细胞的向内运输能力，氢化可的松的产率进一步提高到268mg/L·d。最终，通过提高生物转化系统细胞密度，氢化可的松产量达到1060mg/L，最大生产速率667mg/L·d，纯度大于80％，达到酵母系统氢化可的松生产的最高水平，且整体催化水平接近现有蓝色犁头霉工业化水平。由于酿酒酵母催化工艺简单快速，安全性高，因而相比传统丝状真菌系统具有较突出的优势。　　C14α羟基化甾体化合物具有特有的抗促性腺激素和抗癌生物活性，也是生产强心苷甾体药物的前体物质。目前该类甾体药物的合成只能通过丝状真菌介导的生物转化实现，且对应的甾体C14α羟化酶系统目前还未被揭示。本研究首次克隆和鉴定出新月弯孢霉来源的甾体C14α羟化酶系统(P-450lun和CPRlun)，并将其引入酿酒酵母细胞工厂用于生产C14α羟基化甾体化合物。通过代谢工程改造，酿酒酵母菌株催化底物脱氧可的松21-醋酸酯（Acetylated cortexolone，RSA）合成14α-羟化可的松(14a-OH-RSS)产量达到64mg/L，纯度约为40％;催化底物雄烯二酮(Androstenedione，4-AD)合成产物14α-羟化雄烯二酮（14α-OH-AD）产量达到150mg/L，纯度高于99％。进一步，对不同条件下的酿酒酵母生物转化系统稳定性进行评价，发现甾体C14α羟化酶在酿酒酵母异源系统中的催化稳定性显著高于丝状真菌系统。本工作首次实现应用酿酒酵母生物转化系统催化合成C14α羟基化甾体化合物，克服了以往丝状真菌系统发酵周期长，菌丝在发酵体系中均质性差，副产物较多的缺点。　　薯蓣皂素作为一种重要的甾体激素合成前体，目前主要从薯蓣科植物:盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis）中提取进行生产，但工艺复杂，产品得率低，且大量使用有机溶剂造成环境污染。所以在酿酒酵母中构建薯蓣皂素从头合成细胞工厂，以经济集约的生产方式替代原有的植物提取方式具有重要意义。本研究，首先在酿酒酵母中构建胆固醇合成底盘细胞，随后通过筛选比较不同来源的甾醇7位还原酶(DHCR7)和甾醇24位还原酶(DHCR24)，失活副产物途径等将胆固醇产量提高至16mg/L;通过转录组和基因组分析鉴定出盾叶薯蓣中薯蓣皂素合成的相关CYPs蛋白（胆固醇16，22位双氧化酶和甾醇26位氧化酶）和重要功能CYPs基因簇（包括:DzinCYP90B2、DzinCYP94X和DzinCYP90G），并通过共表达DzinCYP94X和DzinCYP90G基因成功构建出薯蓣皂素生产菌株，产量为3.2mg/L;随后根据基因簇进一步挖掘到不同来源的胆固醇16，22-双氧化酶和26位羟化酶，最终通过组合DzinCYP90G和山藜芦（Veratrum californicum）来源的VcCYP94N1薯蓣皂素产量可以达到10mg/L。　　本论文围绕酿酒酵母甾体化合物的合成，从不同合成方式和不同产物两个维度应用合成生物学（学习、设计、创建和验证）进行深入探究，最终取得了具有一定价值的研究成果。提高了酿酒酵母作为宿主生产甾体化合物的潜在竞争力。

摘要译文

关键词: 甾体化合物 ；酿酒酵母；细胞工厂；生物转化

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