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摘要： 神经轴突导向分子Slit是一种在进化上高度保守的分泌型糖蛋白,Slit对神经轴突导向、神经细胞迁移、神经细胞形态分化、肿瘤转移、血管生成、心脏形态发生等多种生命活动具有调节作用。Slit功能的实现主要是通过其LRR-2结构域与受体Roundabout(Robo)的Ig1结构域相结合而实现的,另外硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)、GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins,GAPs)、酪氨酸激酶Abelson、Ca2+、MicroRNA-218和其它轴突导向分子等多种信号分子也参与了Slit功能的实现。slit基因受到Single-minded、Irx4和Midline等转录因子的调控,另外,转录后水平的选择性剪接使slit基因存在多种亚型。Slit导向机制的研究有助于揭示生物神经发育和再生过程中神经网络形成的内在分子基础,同时,也将为预防和治疗人类神经疾病、抑制癌细胞转移等提供理论参考。
关键词: slit基因 ；robo基因 ；神经轴突导向 ；细胞迁移 ；分子作用机制 ；基因表达调控
被引量
21
摘要： 神经轴突导向分子家族(slit guidance ligand,Slit)是一类高度保守的分泌型糖蛋白,与其单次跨膜受体(roundabout guidance receptor,Robo)相互作用。目前,已经在人类发现3个Slit基因(Slit1-3)和4个Robo基因(Robo1-4)。Slit3具有广泛的生物学功能,如细胞迁移、骨形成、血管生成和肿瘤发生。Slit3在不同临床疾病中的致病作用及机制尚未完全阐明,值得深入研究探索。通过研究Slit3在不同疾病中的作用和发病机制,将为探索其生物学作用及发病机制,研发靶向治疗方案提供理论依据和新思路。本文综述Slit3在各类疾病中的研究进展,并阐述其在相关疾病中的作用及可能机制。
关键词: Slit3 ；发病机制 ；研究进展
摘要： Semaphorins家族蛋白包括分泌型与膜结合型蛋白,最初关于Semaphorins家族蛋白的报道多为神经系统方面的研究。近年来,研究认为Semaphorins蛋白及其受体共同参与调控多种生理途径,包括血管形成、肿瘤形成、免疫调节、神经系统的轴突导向形成等。有关Semaphorins信号分子在免疫调节中的作用机制研究目前仍处于起步阶段,本文通过查阅文献简要论述与免疫相关的几类Semaphorins蛋白调控T淋巴细胞功能的研究进展。
关键词: Semaphorins蛋白 ；T淋巴细胞 ；免疫调节
被引量
1
摘要： 神经轴突导向分子Robo是进化上高度保守的跨膜蛋白。Robo及其配体Slit对神经轴突导向、神经细胞迁移、肿瘤转移、血管生成、肺脏、肾脏、心脏的形态发生以及卵巢、性腺的发育等多项生命活动具有调节作用。Robo功能的实现主要通过其Ig1结构域与其配体Slit的LRR-2结构域结合,同时也通过与多种信号分子如硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)、GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins,GAPs)、酪氨酸激酶Abelson等结合发挥作用。robo基因的表达受到Hox、Midline、Nkx2.9等转录因子的调节,另外,转录后水平上的选择性剪接和转录产物的转运等调控也影响Robo的功能。本文对Robo蛋白的结构与功能以及分子作用机制等研究进展进行了综述,以期为神经发育研究和神经系统疾病与癌症防治提供新思路。
关键词: 神经轴突导向 ；Robo ；Slit ；细胞迁移 ；分子作用机制 ；基因表达调控
被引量
16
摘要： Roundabout(Robo)蛋白是神经轴突导向分子家族Slit蛋白的单次跨膜受体,属于一种神经细胞粘附分子。Robo蛋白在神经系统已被确认具有重要轴突导向功能。近年来研究发现,血管新生的内皮细胞表面只特异性地表达Robo4,且Robo4对内皮细胞迁移、病理性血管生成和血管完整性都具有调节作用。缺血性脑血管病是人类致残甚至死亡的主要疾病之一,由于短暂或持续的脑血流减少而造成脑细胞损伤,因此,恢复脑血流、促进血管再生对脑功能恢复至关重要。Robo4对血管方面的作用为我们进一步研究及了解其在血管生成中的机制提供重要依据,也为缺血性脑血管病的治疗提供新的发展方向。
关键词: Robo4 ；血管生成 ；内皮细胞迁移 ；内皮细胞通透性 ；缺血性脑血管病
摘要： 神经轴突导向分子Slit 是一种分泌型糖蛋白。Slit蛋白在体内不仅可以阻止神经元的转移，同时在其他多个器官中都有表达，抑制血管内皮细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞等多种细胞的转移。在机体重症感染时，病原菌的刺激使体内产生大量细胞因子，形成细胞因子风暴，而外源性Slit蛋白可以抑制趋化因子的趋化性，减少白细胞的黏附和迁移，同时通过稳定血管，降低血管通透性，防止过多细胞因子进入血液循环，加重炎症损伤。而该作用主要是通过Slit的第2个亮氨酸重复序列（Slit D2）与Robo 的 N-端免疫球蛋白样区域 IG1-2的结合后，诱导Src激酶、磷脂酰肌醇3（PI-3）激酶等去磷酸化而失活、抑制多种趋化信号及细胞骨架重排、加强血管内皮VE-钙黏蛋白间连接、紧密血管内皮等机制来实现。尽管很多研究都表明Slit 蛋白在抗炎领域的重要意义，但目前Slit蛋白的作用机制尚未十分明确，其获得途径有限，因此，Slit蛋白在抗炎领域的研究将为炎性疾病提供更广阔的治疗策略。
关键词: Slit蛋白 ；趋化性 ；炎症 ；细胞因子风暴 ；抗炎
被引量
2
摘要： Sema4D又称CD100是近年新发现的重要的免疫调节分子,Sema4D与其受体plexin-B1和CD72结合,通过多种信号转导途径,在神经系统的轴突导向,肿瘤的侵袭转移和免疫系统中T、B细胞的活化和免疫调节中发挥关键作用。最新研究表明,Sema4D在慢性病毒持续感染中发挥重要作用,Sema4D对维持CD8^+T细胞的功能尤为重要,Sema4D对控制感染慢性化至关重要。Sema4D作为监测T细胞免疫功能的关键标志分子,可能参与慢性病毒感染性疾病T细胞功能低下。我们就Sema4D表达在慢性病毒持续感染中的作用机制方面的研究进展做简要综述。
关键词: Sema4D ；慢性病毒感染 ；免疫调节 ；研究进展
被引量
6
摘要： 免疫性血小板减少性紫癜（ITP）是一组以血小板减少为特征的自身免疫紊乱性疾病群。既往认为，ITP发病机制为经典体液免疫机制，即通过自身抗体作用于未成熟血小板，使其在单核巨噬系统被吞噬所致，并可影响巨核细胞和血小板的发育成熟。目前，细胞免疫在ITP发病机制中的作用越来越受到重视，血小板、巨核细胞的细胞凋亡异常对ITP发病有影响，而一些细胞亚群比例异常和细胞因子水平异常被证实存在于ITP患者中，有关ITP患者基因的相关研究也取得了一定进展。除此之外，神经轴突导向分子（Sema）5A与维生素D3的异常，也参与ITP的发病。笔者拟主要从体液免疫、细胞免疫、细胞凋亡、基因表达、氧化应激等方面，对ITP发病机制的最新研究进展进行阐述。
关键词: 紫癜 ；血小板减少性 ；特发性 ；免疫 ；体液 ；免疫 ；细胞 ；DNA甲基化 ；氧化性应激
被引量
11
摘要： 神经新生已成为肿瘤的重要获得性特征之一,研究表明通过基因技术特异性操控乳腺癌神经,激活交感神经促进乳腺癌进展,激活副交感神经抑制乳腺癌生长。神经调控肿瘤的分子机制成为肿瘤研究的热点,阻断神经为抗肿瘤治疗提供重要靶标。然而,目前针对神经生长的相关因子及受体的抑制剂研究正处于初始阶段。围刺为传统中医刺法,可沟通局部经脉、络脉、浮络和皮部之间的联系,以理气活血、化瘀通络。针对肿瘤的围刺,即以肿瘤局部为中心,沿肿瘤边缘进行多针包围性针刺。前期研究显示电针围刺后肿瘤组织内p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)表达明显增多,与抑瘤率变化趋势一致,且参与调控了肿瘤内的轴突导向因子Sema3a表达,提示围刺可能影响肿瘤神经。但围刺是否能够调控肿瘤神经及相关机制,仍有待进一步的研究阐明。本研究第一部分为文献综述,包括两方面:一是从临床应用角度,对围刺疗法及瘤周注射在肿瘤的运用和疗效进行整理、总结;二是从现代医学角度,梳理和总结了肿瘤神经新生及p75NTR在乳腺癌中的研究进展。第二部分为实验研究:目的:1比较不同围刺法对乳腺癌移植瘤肿瘤生长及癌细胞凋亡的影响;2观察电针围刺对肿瘤神经、神经递质、神经营养因子(NTs)及相应受体的影响;3通过有参转录组测序获取电针围刺相关的差异基因表达,并通过生物信息学分析探索电针围刺调控肿瘤神经的候选靶基因和相关分子机制;4以p75NTR为突破口,通过电针围刺后抑制p75NTR信号转导,观察p75NTR对电针围刺调控神经、细胞凋亡及肿瘤生长的影响。方法:构建4T1乳腺癌小鼠移植瘤模型,实验一分为TG组(模型组)、ETG组(电针围刺组)、ATG组(毫针围刺组),TG组小鼠每天抓握3min,ETG组予电针围刺3min/天,ATG组予毫针围刺3min/天,于干预后1周、2周、3周取材,绘制生长曲线、计算抑瘤率,TUNEL检测肿瘤细胞凋亡,比较电针与毫针围刺对肿瘤生长、癌细胞凋亡的影响。实验二分为TG组、ETG组、NG组(空白组)、ENG组(空白电针组),TG组、ETG组干预同实验一,NG组、ENG组均为正常小鼠,其中NG组每天抓握3分钟,ENG组电针围刺,其针刺部位、方法与ETG组一致,通过HE、IHC、ELISA检测,以明确电针围刺对肿瘤神经、神经递质、NTs及受体的影响。实验三样本来自实验二,取TG组与ETG组干预1周的肿瘤组织冰冻样本,每组各3个,共6个样本用于有参转录测序,并通过生物信息分析,以探索电针围刺对肿瘤神经的调控作用及潜在机制。基于前期研究电针围刺对p75NTR的上调作用,实验四分为TG组、ETG组、ETTG组(TP组,即p75NTR抑制剂组),TG组、ETG组干预同前,ETTG组电针干预同ETG组,并在电针后15分钟腹腔注射p75NTR受体抑制剂TAT-Pep5(75μg/kg·d),以明确抑制p75NTR信号传导对肿瘤神经、肿瘤细胞凋亡及肿瘤生长的影响。结果:1电针与毫针围刺抑制4T1小鼠乳腺癌肿瘤生长的比较(1)肿瘤生长曲线显示,ETG组肿瘤生长最慢,TG组最快,ATG介于ETG组与TG组之间;在实验干预第15天,三组肿瘤生长曲线开始趋于一致。肿瘤体积的组间比较显示,ETG组肿瘤体积于实验干预第5-18天较TG组显著缩小(p<0.05),ATG组肿瘤体积于实验干预第6-14天较TG组显著缩小(p<0.05)。(2)三个取材时点的瘤重比较,ETG组瘤重最小,TG组瘤重最大,ATG组瘤重介于ETG组与TG组之间。(3)在三个取材时点,ETG组抑瘤率分别为36.93%、46.49%、27.89%,ATG组抑瘤率分别30.79%、26.61%、21.67%。(4)TUNEL染色结果显示,ETG组在三个取材时点的癌细胞凋亡指数均显著高于ATG组与TG组(p<0.05),且在实验干预2周的凋亡指数最高,ATG组的凋亡指数与TG组相当。2电针围刺对4T1小鼠乳腺癌神经的影响(1)HE染色、IHC标记PGP 9.5均提示4T1小鼠乳腺癌肿瘤组织和癌旁组织有神经支配。(2)β3-tubulin+神经:ETG组β3-tubulin+神经束在实验干预1周、2周均少于TG组,至实验干预3周两组无差别;ETG组神经纤维在三个取材时点均多于TG组;IPP半定量分析β3-tubulin+表达面积显示,ETG组在三个取材时点β3-tubulin+表达面积均显著少于TG组(p<0.05)。(3)TH+交感神经:TH+神经纤维呈细丝状,分布于肿瘤间质,且多围绕在血管周围,ETG组在三个取材时点的TH+神经纤维均显著少于TG组。(4)血清神经递质:ENG组NE、ACH、AD较NG组均有一过性升高趋势,其中仅干预3周的AD差异有显著统计学意义;ETG组NE、ACH、SP含量较TG组有一过性升高趋势,其中仅第3周NE差异有显著统计学意义。(5)肿瘤组织神经递质:ETG组在三个取材时点的NE含量均低于TG组,其中干预2周、3周差异有统计学意义;ETG组 ACH水平均低于TG组,其中干预2周差异有统计学意义。(6)血清NTs:NGF、BDNF、NT-3、NT-4含量在三个取材时点组间比较均无差异。(7)肿瘤组织NTs:ETG组在干预1周、2周的NGF含量均明显高于TG组(p<0.05),ETG组在干预3周的NT-3水平显著高于TG组(p<0.05),BDNF、NT-4水平在ETG与TG组均无差异,ETG组proNGF相对表达量在三个取材时点均显著高于TG组(p<0.05)。(8)NTs相关受体:ETG组在三个取材时点的p75NTR相对表达量均显著高于TG组(p<0.05),TrkA、TrkB相对表达量在ETG与TG组均无差异。3有参转录组测序探索电针围刺对肿瘤神经的作用相较于TG组,ETG组共获得116个差异基因,其中66个上调基因,50个下调基因,GO功能注释分析显示电针围刺相关的差异基因主要与免疫反应、细胞死亡与稳态、氧化应激、物质与能量代谢等生物学过程相关,KEGG通路富集分析显示电针围刺相关的差异表达基因主要与神经、免疫反应、物质与能量代谢相关,其中在神经的生物学过程中,包含四个神经递质兴奋性突触通路和一个神经轴突导向通路,涉及1 1个差异基因,5-HT2、VGCC、COX、TRPC1、Ablim 下调,Gi/o、PLA2、GLS、CREB、Boc、Netin-G2上调,涵盖胞吐、钙离子内流、神经兴奋性、神经保护、轴突导向、神经递质释放的反馈抑制调节、突触可塑性等生物学功能。4 p75NTR介导电针围刺调控肿瘤神经及癌细胞凋亡的机制腹腔注射TAT-Pep5以抑制p75NTR信号传导,观察电针围刺对肿瘤神经、癌细胞凋亡的影响。(1)β3-tubulin+神经:ETTG组β3-tubulin+神经总数和神经纤维较ETG组和TG组均有减少趋势(p>0.05),而β3-tubulin+神经束比ETG组和TG组有增多趋势(p>0.05),此外,ETTG组在实验干预1周、2周β3-tubulin+表达面积显著高于ETG组(p<0.05)。(2)TH+神经:ETTG组TH+神经纤维在三个取材时点均显著多于ETG组(p<0.05);ETTG组在干预1周、2周的TH+神经纤维与TG组相当,至干预3周明显少于TG组(p<0.05)。(3)肿瘤组织神经递质(NE、ACH):ETTG组肿瘤组织NE含量介于TG组与ETG组之间;ETTG组肿瘤组织ACH含量在三个取材时点均高于ETG组,其中实验干预2周的差异有统计学意义,但与TG组无差异。(4)肿瘤组织NGF、proNGF:ETTG组在三个取材时点的NGF含量均显著高于TG组(p<0.05),在实验干预1周与ETG组相当,2周显著低于ETG组,3周高于ETG组;对于proNGF,在三个取材时点ETTG组proNGF表达均与ETG组相当,而显著高于TG组(p<0.05)。(5)肿瘤生长:ETTG组瘤体、瘤重均介于ETG组与TG组之间,三个取材时点ETTG组的抑瘤率显著低于ETG组(p<0.05)。(6)癌细胞凋亡:ETTG组在三个取材时点的凋亡指数均显著低于ETG组(p<0.05),而与TG组相当。结论:1单纯电针与毫针围刺均可抑制肿瘤生长,电针围刺较毫针围刺抑瘤作用更强、更持久,其中电针围刺的抑瘤机制之一为癌细胞凋亡增加。2电针围刺调控肿瘤神经,具体表现为促进神经新生、抑制神经浸润(PNI)和交感神经形成,调节肿瘤组织神经递质(ACH、AD、NE)、NTs(NGF、proNGF、NT-3)水平,上调 p75NTR 表达,可能为电针围刺抑瘤潜在分子机制。3电针围刺可能通削弱胞吐、抑制钙离子内流、调节神经兴奋性等作用抑制神经递质释放,及通过促进神经保护和轴突导向而诱导神经轴突生成,以调控肿瘤微环境。4电针围刺上调p75NTR/proNGF信号转导诱导癌细胞凋亡而直接抑制肿瘤生长,同时经由p75NTR介导以抑制PNI和交感神经支配,下调肿瘤组织NE、ACH水平,以调控肿瘤微环境而发挥间接抑瘤作用。
关键词: 凋亡 ；p75NTR ；乳腺癌 ；神经新生 ；围刺
被引量
7
摘要： 第一部分ADSCs外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3参与脑卒中神经损伤调节的作用研究研究背景脑卒中（Cerebral stroke）目前占脑血管病发病率约35%,40%的存活者遗留严重残疾,病死率高达50%以上,是威胁中、老年人健康的主要疾病之一,是世界范围内引起人类残疾和死亡的主要原因之一,是一个重要的公共健康问题。近年来临床中多采用手术清除血肿、去骨瓣减压术、动脉内膜剥脱术、脱水降颅内压、神经营养及高压氧等综合治疗手段,虽然能挽救部分病人的生命,但脑卒中存活者仍有很高的致残率。脑卒中后血肿及脑组织水肿的机械压迫和破坏可对神经系统细胞产生直接杀伤作用,而脑卒中后周围脑组织继发缺血缺氧会进一步导致神经元细胞等的坏死和凋亡,造成严重的神经功能缺失。已经开始有大量的研究试图阐明脑卒中神经损伤的病理机制以及脑卒中的治疗靶点,同时试图发现更好更快可以直接避免缺血性卒中损伤的治疗措施。如何减少脑卒中后神经元细胞的坏死和凋亡,是改善这类患者预后的关键。脂肪间充质干细胞（Adipose Derived Stem Cells,ADSCs）是一种从成体脂肪间充质中获得的干细胞,因其无明显的免疫排斥反应、亦可自体移植,具有多向分化潜能等优点,近年来成为干细胞移植研究的热点。ADSCs移植治疗多种疾病所致的神经功能缺损已获得有价值的研究进展。本人所在课题组前期已成功构建了 SD大鼠脑卒中模型,同时分离出ADSCs进行体外培养扩增,并诱导成神经元样细胞,然后注射到大鼠损伤脑组织局部,观察到受损脑组织局部不成熟神经元细胞增多、神经突触再生明显、细胞有丝分裂活动增强,局部神经组织损失面积减少,可促进大鼠的神经功能恢复。在综合大量动物实验的基础上,课题组又开展了自体ADSCs局部注射治疗脑卒中临床试验研究。研究结果证实在脑卒中患者血肿腔周围损伤的脑组织局部注射ADSCs治疗,可在近期（6个月）内有效改善患者的神经功能缺失,且效果优于静脉注射和蛛网膜下腔注射。但同时我们也发现ADSCs治疗组患者在12个月之后的神经功能评分与对照组比较无明显统计学差异,表明ADSCs治疗脑卒中后神经损伤远期效果较差,仍不能令人满意。如何提高移植后ADSCs神经修复效果是研究者面临的课题之一。这就提示我们要对ADSCs治疗脑卒中的作用机制进行深入研究,找到关键作用分子并进行靶向调控,是提高ADSCs临床治疗效果的关键。间充质干细胞在过去被认为能分化成不同类型的细胞,但是现在更多的研究关注间充质干细胞和其他细胞的相互作用和对其他细胞的影响,特别是研究和其他细胞的信息交流。近来通过细胞外囊泡进行信息交流吸引了更多的研究兴趣。有许多不同类型的分泌细胞外囊泡,它们在大小、细胞来源、生物合成、内容物和释放的生理环境都有不同。外泌体（Exosomes）是一种由细胞内溶酶体微粒内陷形成、直径在40-100nm的多囊泡体。它含有蛋白质、mRNAs和miRNAs等遗传物质,作用于靶细胞并调控相关靶基因表达,具有实现细胞间物质交换及信息传递等功能,参与体内多种病理生理过程。外泌体能够通过多种途径进行分离,通过电子显微镜进行特征描述和标记蛋白进行鉴定。目前研究认为,ADSCs移植治疗神经损伤性疾病,神经功能的改善主要获益于细胞的旁分泌机制,而外泌体是干细胞旁分泌效应中发挥主要作用的因子。干细胞来源的外泌体可提供生长因子等细胞保护因子,能够起到抗凋亡、促进血管生成、增强神经细胞分化及修复受损组织等多种作用。外泌体在ADSCs神经修复中的作用已经成为其作用机制研究的热点。已有大量研究证实脂肪间充质来源的干细胞可分泌外泌体,并在干细胞的生理作用中起到重要作用。在脑卒中相关外泌体研究中,Xin等报道ADSCs可通过分泌外泌体miR-133b被神经元及星形胶质细胞摄取后促进轴突生长。且ADSCs移植联合miR-133b过表达治疗对神经轴突可塑性及神经突触重塑方面效果优于单纯ADSCs治疗。该团队还首次用ADSCs源外泌体替代ADSCs治疗脑卒中动物模型,同样可改善脑卒中预后。然而,外泌体的内容物在不同的病理情况下发挥的作用不同,这种不同也许会导致靶细胞完全相反的命运。因此,研究在特定病理情况例如缺氧和缺血情况下外泌体的生物学功能将会大有收获。此外,本研究将尝试为缺血缺氧神经损伤的治疗提供新的理论依据。在外泌体的内容物中,有研究显示miRNAs调控缺血性脑卒中病理生理学结局中的重要过程。它是一组小（大约22核苷酸）、单链非编码RNA,在基因表达中具有重要的作用。miRNAs既能促进亦能抑制神经胶质细胞及脑血管内皮血细胞的凋亡,也能够调节急性脑缺血介导的脑卒中。但是脂肪间充质干细胞外泌体来源的miRNA是否可以在脑缺氧、缺血情况下参与神经胶质细胞及脑血管内皮细胞的凋亡调节过程还不是很清楚。在此研究中,我们探讨了脂肪间充质干细胞来源的外泌体对缺血、缺氧模型中神经胶质细胞及脑血管内皮细胞的保护作用,认为其机制主要是通过外泌体miR-21及miR-342对该两种细胞中caspase-3蛋白的调节来完成的。同时通过我们大量的研究工作亦可以为缺血性脑卒中提供潜在的细胞治疗策略。研究目的1.检测miR-21、miR-342在干细胞外泌体及脑卒中体外模型中的表达水平。2.分析miR-21、miR-342表达水平与脑卒中细胞凋亡间的关系。3.评估干细胞外泌体通过干预miR-21、miR-342的表达对卒中损伤的调控作用。4.研究miR-21、miR-342参与脑卒中损伤的调控机制及调节靶点。研究方法1.培养人源脂肪间充质干细胞,采用超速离心法成功提取外泌体并利用电子显微镜进行鉴定。培养人源神经胶质T98细胞及血管内皮细胞HCMEC,配置适当浓度氯化钴溶液（COC12）成功建立T98及HCMEC缺血缺氧模型,RNA-Seq、MTT及qRT-PCR方法分别检测、筛选差异表达miRNAs,并从中选取特异性高的 miRNA（miR-21、miRNA-342）。2.电子显微镜下观察T98及HCMEC细胞凋亡情况,并采用LP3000瞬时转染方法转染miR-21及miR-342的mimic及inhibitor,观察细胞凋亡及改善情况与miRNA表达的关系。3.间充质干细胞利用qRT-PCR方法验证差异表达miRNAs,将外泌体与缺血缺氧细胞模型共培养,观察细胞凋亡及改善情况。干扰干细胞miR-21及miR-342表达量,再次分离得到外泌体并共培养,通过qRT-PCR方法、Western Blot及流式细胞学技术方法观察细胞凋亡及改善情况。4.通过荧光素酶检测方法检测miR-21及miR-342在脑卒中损伤模型中的作用靶点及蛋白caspase-3,结合生物信息技术验证miRNAs及其靶基因作用的细胞信号通路,同时观察脑卒中细胞凋亡情况与caspase-3表达的相关性,再次验证miR-21及miR-342在脑卒中损伤模型中的作用靶点,尝试为脑卒中损伤的调节提供潜在的细胞治疗策略。研究结果1.miR-21、miR-342在脑卒中神经胶质T98细胞及HCMEC细胞中表达水平分析结果表明利用氯化钴溶液可以成功建立缺氧缺血模型,miR-21、miR-342在脑卒中神经胶质T98细胞及HCMEC细胞中表达水平具有明显特异性。脑卒中细胞模型建立后,miR-21表达降低（mean±SD,2.53±1.94）,miR-342表达升高（mean±SD,2.57±1.95）,miR-21与细胞凋亡程度呈负相关,miR-342与细胞凋亡情况呈正相关。2.分析miR-21、miR-342表达水平与脑卒中细胞凋亡间的关系脑卒中细胞模型建立后,miR-21表达降低,miR-342表达升高（mean±SD,2.57±1.95）,miR-21与细胞凋亡程度呈负相关,miR-342与细胞凋亡情况呈正相关。3.评估干细胞外泌体通过干预miR-21、miR-342的表达对卒中损伤的调控作用。干细胞利用LP3000成功瞬时转染mi-R-21及miR-342的生物模拟物,并利用qRT-PCR检测到相应miRNA的表达改变。干细胞外泌体干扰miR-21及miR-342表达对脑卒中损伤发挥相应调控作用,干细胞外泌体miR-21过表达可以改善脑卒中损伤模型中细胞凋亡情况,miR-342过表达则起到促进细胞凋亡作用。4.研究miR-21、miR-342参与脑卒中损伤的调控机制及调节靶点。外泌体作为一个转运微粒,通过细胞间miRNA和蛋白的交换在细胞间的信息交流中发挥重要的作用,研究特定病理情况下分泌的具有潜在生物学功能外泌体中的miRNA等内容物是很有必要的。因此,我们选择了此前文献报道的12种miRNA,既包括缺血缺氧过程中的miR-24,miR-146,又包括少突胶质细胞凋亡过程中的miR-21,592,138,342等。在这些miRNA中,脂肪间充质干细胞来源的外泌体miR-21在经过缺氧处理后被显著下调,而miR-342显著上调。这提供了一个潜在的外泌体两种miRNA的共同靶点,其在缺氧处理后的T98及HCMEC细胞中也许会影响caspase-3的表达。我们检测了缺氧处理后的T98及HCMEC细胞中的miR-21及miR-342,结果显示miR-21被显著下调、miR-342显著上调,提示缺氧过程中miR-21、342的改变和caspase-3表达改变之间有可能存在联系。因此使用两种miRNA的抑制物进行过表达及低表达功能实验,结果显示miR-21的表达与caspase-3的表达水平呈负相关,miR-342与caspase的表达呈正相关。结论1.脑卒中损伤后神经胶质细胞及血管内皮细胞的凋亡进展与miR-21及miR-342的表达具有明显相关性。2.间充质干细胞来源的外泌体可通过miR-21及miR-342参与改变神经胶质细胞及血管内皮细胞的凋亡。3.间充质干细胞外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3参与脑卒中损伤调节。意义本课题明确了我们能得出一个结论,即脂肪间充质干细胞源外泌体miR-21及miR-342、caspase-3有希望成为脑卒中治疗的潜在靶点。第二部分ADSCs外泌体通过miR-342-5p调控血管内皮细胞抗动脉粥样硬化改善脑卒中的作用研究研究背景脑血管疾病、心血管疾病和癌肿是导致人类死亡最常见的3类疾病。脑血管病的年人发病率在每十万人有150～200人,其中缺血性脑血管病约75%85%、脑出血约10%15%以及自发性蛛网膜下腔出血约5%9%。脑梗死30天病死率约15%33%,生存者均有程度不同的病残。虽然发达国家已大力开展对脑血管危险因素的防治,曾使脑血管病的发病率和死亡率在20世纪70年代有所降低,但在80年代初又有所回升。近年来,虽然神经科学在诊断、治疗以及基础研究上有很大的发展,但是脑血管病的治疗依旧是我们要面临的重大挑战。缺血性脑卒中见于很多种神经外科疾病的病理及生理过程中,如脑血管病、颅内肿瘤、脑外伤、术中暂时性血管阻断等;亦可见于心脏骤停、休克等全身性的病理过程。脑缺血可表现为不同的形式,例如局灶性和弥漫性脑缺血、永久性及暂时性脑缺血之分。但不论以哪种方式出现,脑缺血后的病理生理机制和生化改变基本相似,且与脑缺血的程度和持续时间高度相关。基本病理过程包括:能量衰竭、细胞离子平衡失调、酸中毒、钙内流、兴奋毒性作用和氧自由基介导的毒性作用等。研究表明,当颈动脉管腔狭窄程度<70%时,脑血流保持不变。可是,当狭窄≥70%时,管腔的横切面减少90%,即引起显著脑血流减少。动脉管腔内血栓形成或者栓塞是错综复杂的过程,受很多种因素相互作用:血液成分改变、血管壁内膜损伤、局部脑血流的特征例如流速、漩涡等。因颈动脉粥样硬化引起管腔高度狭窄进而导致脑供血不足是促成缺血性脑卒中的主要病因,因此颈动脉内膜剥脱术不仅可以增加CBF,而且可以消除潜在的脑血栓和栓塞风险进而达到防治缺血性脑卒中的目的。颈动脉粥样硬化,通常是由颈动脉壁上充满脂质的巨噬细胞积聚引起的,是脑血管疾病的主要潜在贡献者,并在全球范围内具有高发病率和高死亡率。一系列高脂血症引发的慢性炎症过程:包括修饰后的脂蛋白、单核细胞和T淋巴细胞与来自血管壁的细胞成分之间复杂的相互作用,
关键词: miR-21 ；miR-342 ；脑卒中 ；间充质干细胞 ；外泌体 ；caspase-3 ；miR-342 ；脂肪间充质干细胞 ；外泌体 ；血管内皮细胞 ；动脉粥样硬化
被引量
8
摘要： 研究背景肝硬化是消化系统的常见疾病,由各种慢性肝损伤引起,是慢性肝病病理过程的终末期阶段。如果损伤因素持续存在,肝硬化持续发展,可进一步导致门脉高压,出现食管静脉曲张(esophageal varices,EV)、腹水等严重并发症。肝硬化门脉高压及其并发症是慢性肝病患者死亡的主要原因之一,但目前尚无根治方法。因此探讨肝硬化门脉高压的发病机制,开发新的治疗靶点;寻找无创性预测指标,提高早期诊断率,具有重要的临床意义。肝硬化的发病机制主要包括肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化引起的肝内纤维结缔组织的过度沉积和肝窦内皮细胞(hepatic sinusoidal endothelialcells,HSEC)活化引起的肝内血管异常再生。血管异常再生可引起肝内病理性血管结构的重建,肝内血流紊乱,导致肝内血管阻力(intrahepatic vascular resistance,IVR)增加,并可进一步加重纤维结缔组织的沉积。研究表明,血管异常再生在促进肝硬化进展中发挥着重要作用,因此血管异常再生是治疗肝硬化一个重要的靶点。然而,肝内血管再生在肝硬化门脉高压发生过程中的具体作用机制尚未阐明,尤其肝内血管再生在肝硬化门脉高压IVR增加中的作用需进一步探讨。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor receptor,VEGF)是目前已知的增强血管再生最强的物质之一,其主要通过与血管内皮生长因子受体(VEGF receptors,VEGFRs)和神经纤毛蛋白(neuropilins,NRPs)等受体结合发挥作用,其中VEGFR2是VEGFR家族的重要成员,也是VEGF的主要效应受体。神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)是NRPs家族的第一个成员,最初被认为是神经轴突指导分子SemaphorinⅢ(SEMA3)家族受体,在神经系统细胞导向轴突生长方面发挥调节作用。后来研究发现NRP-1可作为VEGF的受体,与VEGFR2共同作用,促进胚胎血管生成及肿瘤血管再生。前期研究发现,NRP-1通过调节血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)/转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)介导的信号通路,促进HSC的活化、迁移和增殖,从而促进肝硬化进展。然而,NRP-1在调控HSEC介导的肝内血管异常再生的作用尚不清楚,有待于进一步研究。NRP-1作为一种跨膜糖蛋白,可与VEGF及VEGFR2形成复合物。目前,普遍认为NRP-1通过其胞外区与 VRGF结合,增强VEGF与其受体VEGFR2的结合及亲和力,并进一步增强VEGFR2的活化和下游信号传导,从而促进内皮细胞血管再生。然而,也有研究发现,利用NRP-1基因突变特异性阻断NRP-1/VEGF结合,并不影响胚胎及成年小鼠血管发育,提示NRP-1并非主要通过与VEGF结合发挥作用。此外,研究发现,NRP-1协助激活的VEGFR2下游信号通路主要包括:p38,细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases l/2,ERK1/2),磷脂酰肌醇 3'-激酶(phosphatidylinositol3'-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)和Src/粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)等通路。总之,NRP-1促进HSEC血管再生的具体机制,尤其是其与VEGFR2协同作用及细胞内信号传导通路尚不明确。肝内血管再生和肝脏纤维组织沉积均可能引起肝硬化患者门静脉高压。肝硬化门脉高压的早期诊断对于早期开展治疗非常必要。目前,肝静脉压力梯度(hepatic venous pressure gradient,HVPG)测定是临床诊断肝硬化门脉高压的金标准。但由于HVPG测定是有创性检测,技术要求较高,只在少数中心开展,临床并不常规应用。寻找无创性方法来预测门静脉高压至关重要,在无创性方法中血清学指标在临床简单易得。我们课题组已经应用反映肝内血管再生的血液学指标血管假性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)无创预测肝硬化患者门脉压力。在本研究中,我们拟利用反映肝脏纤维化程度的血清学指标无创预测肝硬化门脉高压。本研究分三部分,第一部分我们首先收集了肝硬化患者的临床标本及数据,证实了肝内血管再生与患者Child-Pugh分级及肝纤维化水平呈明显正相关,肝内血管再生可引起肝硬化患者门脉压力升高。第二部分我们进一步在临床标本及动物实验中证实了 NRP-1与肝硬化肝内HSEC血管再生密切相关。通过体外细胞实验发现NRP-1通过VEGFR2依赖性PI3K//Akt通路促进HSCE血管再生。同时,利用体外肝脏组织培养,验证了阻断NRP-1功能对于肝硬化抗肝内血管再生的治疗作用。第三部分研究,针对肝硬化门脉高压的无创预测,分析了血清学肝纤维化指标对于门脉高压的预测效能。总之,我们的结果提示肝内血管再生促进了肝硬化及门脉高压发生发展。在肝硬化进程中,NRP-1主要通过VEGFR2依赖性PI3K/Akt通路促进HSCE血管再生,NRP-1是治疗肝硬化血管再生的有效靶点。本研究为肝硬化及门脉高压的抗血管再生治疗提供了理论依据,同时为门脉高压提供了无创的一线预测模型,具有广泛的临床应用价值。第一部分肝内血管再生可引起肝硬化患者门脉高压目的肝内血管再生在促进肝硬化进展中发挥着重要作用,但其在肝硬化门脉高压中作用尚不明确,本研究旨在探究肝内血管再生与乙肝肝肝硬化门脉压力的关系。方法1.纳入60例乙肝肝硬化门脉高压患者,40例对照组患者。收集患者临床标本及数据,根据患者的实验室检查结果及临床、影像学资料计算每位患者Child-pugh分级。2.患者肝脏组织进行VEGFR2及vWF免疫组织化学(immunochemistry,IHC)染色以反应肝内血管再生水平,分析患者肝内血管再生水平与患者肝功能Child-Pugh分级的相关性。3.患者肝脏组织进行α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle αctin,α-SMA)IHC染色及天狼星红(Sirius Red,SR)染色以反应肝脏纤维化水平,分析患者肝内血管再生水平与肝脏纤维化程度的相关性。4.利用HVPG评分方程估算患者的HVPG,分析患者肝内血管再生水平与门静脉压力之间的关系。5.分析患者肝内血管再生水平与患者门脉高压并发症(食管静脉曲张、腹水、脾大)之间的关系。结果1.肝硬化患者肝内血管生成水平明显增高,且与患者Child-Pugh分级呈正相关。肝硬化组织中VEGFR2的表达增加,并与vWF染色所表示的微血管密度成明显正相关(r=0.85,p<0.01)。肝组织中VEGFR2表达量与Child-pugh分级成正相关(r= 0.590,p<0.01),肝组织中vWF表达量与Child-pugh分级呈正相关(r= 0.524,p<0.01)。2.肝硬化患者肝内血管再生水平与肝脏纤维化程度呈明显正相关。在肝硬化组织中VEGFR2表达量与α-SMA表达呈明显正相关(r=0.710,p<0.01),VEGFR2表达水平与Sirius-Red染色水平呈正相关(r=0.841,p<0.01),vWF表达水平与α-SMA表达水平呈正相关(r=0.768,p<0.01),vWF表达水平与Sirius-Red染色水平呈正相关(r=0.825,p<0.01)。3.肝内血管再生的增加可以引起肝硬化患者门脉压力的升高。HVPG≥12mmHg的患者肝内血管再生水平明显高于HVPG<12mmHg组患者,其中两组患者VEGFR2表达水平分别为2.60±1.28%vs.1.09±0.73%(p<0.01),vWF表达水平分别为5.85±2.45%vs.2.31±1.34%(p<0.01)4.肝硬化患者肝内血管再生水平,与多种门脉高压并发症密切相关。肝内血管再生水平增高,门静脉高压的并发症(食管静脉曲张、腹水、脾大)的发生率及严重程度也随之增高(p<0.01)。结论肝内血管再生可引起乙肝肝硬化患者门脉压力升高,寻找引起肝内血管再生的关键分子可为肝硬化门脉高压提供治疗靶点。第二部分NRP-1通过VEGFR2依赖性PI3K/Akt通路促进肝内血管再生目的NRP-1协同VEGFR2在胚胎及肿瘤血管再生中发挥重要作用,且NRP-1通过PDGF/TGF-β促进HSC的活化及肝硬化进展。本研究旨在探究肝硬化过程中NRP-1促进HSEC血管生成作用及其内在的作用机制,为肝硬化抗血管再生治疗提供靶点。方法1.收集患者临床标本,分为肝硬化组及对照组。以C57BL/6小鼠为研究对象,腹腔注射CCl4构建肝硬化模型,小鼠随机分成3组(对照组,肝硬化6周组,肝硬化8周组)。对人和小鼠肝脏组织进行苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)和Masson染色评价肝纤维化程度。IHC、Western blot及实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)实验用于检测NRP-1、VEGFR2及相应的肝内血管再生、肝纤维化指标的表达水平。分析NRP-1表达与VEGFR2表达及肝内血管再生的相关性。2.体外培养人原代肝窦内皮(HSEC)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)。慢病毒转染并验证转染效率:根据说明书提供的MOI值分别用慢病毒转染HSEC和HUVEC,下调和过表达NRP-1,并在荧光显微镜下观察绿色荧光比例及强度。通过qRT-PCR和Western blot实验从mRNA及蛋白两种水平验证慢病毒介导的NRP-1下调和过表达效果。3.细胞功能学实验:通过小管形成实验验证NRP-1对HSEC和HUVEC血管生成的作用。通过Transwell实验验证NRP-1对HSEC和HUVEC迁移能力的影响。通过CCK-8实验验证NRP-1对HUVEC增殖的影响。4.细胞内信号通路:Western blot测定NRP-1对HSEC和HUVEC细胞内信号通路的影响,并应用相应信号分子的抑制剂,验证NRP-1发挥作用的相应信号通路。5.体外组织培养:肝纤维化组织体外培养,分别给予不同浓度的NRP-1抑制剂处理,培养7天后应用CCK-8实验检测组织存活率,qRT-PCR检测组织血管再生及纤维化相关指标,以探究阻断NRP-1功能对于肝硬化的治疗的作用。结果1.NRP-1在肝硬化组织的HSEC中表达增高,且与VEGFR2及肝内血管再生水平呈正相关。HE和Masson染色判断人及小鼠的肝硬化程度。IHC、Western Blot、qRT-PCR实验结果显示人和小鼠的肝硬化组织中NRP-1、VEGFR2、肝内血管再生及纤维化指标表达均增高(p<0.05)。NRP-1的表达与VEGFR2的表达呈明显正相关(r= 0.829,p<0.05),且与肝内血管生成的水平呈显著相关(r= 0.783,p<0.05)。2.慢病毒转染成功,NRP-1下调(NRP-1-RNAi)组HSEC及HUVEC中NRP-lmRNA及蛋白表达较下调对照(Control)组明显降低,且内皮细胞的成管,迁移及增殖能力下降(p值均<0.05);慢病毒转染成功,NRP-1过表达(Lenti-NRP-1)组HSEC及HUVEC中NRP-lmRNA及蛋白表达较过表达对照(Lenti-control)组增加,且过Lenti-control组内皮细胞的成管,迁移及增殖能力增强(p值均<0.05)。3.NRP-1通过调节FAK及其激酶活性来调节VEGFR2的表达和活化。慢病毒下调NRP-1的表达,NRP-1-RNAi组内皮细胞VEGFR2的mRNA和总蛋白水平及VEGFR2的磷酸化水平均较Control组降低(p值均<0.
关键词: 肝内血管再生 ；血管内皮生长因子受体2 ；肝硬化 ；门脉高压 ；神经纤毛蛋白-1 ；肝窦内皮细胞 ；血管内皮生长因子受体2 ；血管再生 ；肝硬化 ；门静脉压力梯度 ；肝硬化 ；门脉高压
被引量
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摘要： 多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是一种克隆性浆细胞异常增生的恶性肿瘤,目前即便给与传统药物化疗、免疫调节剂(沙利度胺或来那度胺)、蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)及自体干细胞移植等综合治疗,大多数患者最终仍不可避免出现疾病复发或者进展。因此,寻找更加高效的药物或药物组合一直是MM治疗领域的研究热点。组蛋白表观遗传学是近年来遗传学的研究热点。组蛋白的乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化修饰等通过改变组蛋白和DNA之间的亲和力从而导致相关基因转录改变,其中组蛋白乙酰化作用尤其引人关注。越来越多研究表明,肿瘤的发生发展与组蛋白乙酰化状态密切相关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)作为一种特异性靶向组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的抗癌新药越来越引起人们的关注。FDA已经批准伏立诺他(vorinostat)、贝利司他(belinostat)和罗咪酯肽(romidepsin)用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤(PTCL),批准帕比司他(panobinostat)用于治疗复发或难治性MM。西达本胺是我国首个自主研发的亚型选择性HDACi,用于治疗复发或难治性PTCL取得了不错的治疗效果,CFDA已经批准用于治疗复发或难治的PTCL。近年来,研究者评估了西达本胺在不同种类肿瘤细胞系中的抗肿瘤活性,大量研究证实西达本胺对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌及淋巴瘤等多种肿瘤均有抗肿瘤作用。研究发现HDAC在多发性骨髓瘤中过表达,HDAC过表达的骨髓瘤患者预后较差,并且HDACi(伏立诺他和帕比司他等)单药或联合硼替佐米具有良好的抗骨髓瘤效应。因此我们推测西达本胺也可能是治疗多发性骨髓瘤的有效药物,并且可能与硼替佐米具有协同抗骨髓瘤作用。为此,我们选择多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和U266细胞为研究对象,观察西达本胺单药或联合硼替佐米抗骨髓瘤细胞增殖作用并探索其可能的机理。本实验分三部分进行:第一部分:西达本胺抗骨髓瘤细胞增殖作用及其机制研究。第二部分:西达本胺增敏硼替佐米抗骨髓瘤细胞增殖作用及其机制研究。第三部分:基于全转录组测序技术分析西达本胺抗骨髓瘤作用机制的研究。第一部分西达本胺抗骨髓瘤细胞增殖作用及其机制研究目的:明确西达本胺对人骨髓瘤细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用并探讨其相关机制。方法:1.CCK-8法检测西达本胺对人骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266细胞的增殖抑制作用;2.流式细胞仪PI染色方法检测西达本胺作用后细胞周期变化;3.Wright-Giemsa染色观察西达本胺作用后细胞形态学改变;流式细胞仪AnnexinV/PI双染方法检测西达本胺作用后细胞凋亡比例变化;4.Western Blot方法检测西达本胺作用后组蛋白去乙酰化酶、细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达变化。结果:1.0.5-8μmol/l西达本胺能够抑制骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266细胞的增殖活性,西达本胺对RPMI8226细胞株在24h、48h及72h的IC50值分别为9.09±0.58μmol/l、1.19±0.36μmol/l和0.77±0.21μmol/l(p<0.001),对U266 细胞株的 24h、48h 及 72h 的 IC50 值分别为 16.16±2.51μmol/l、8.06±1.02μmol/l 和2.86±0.58μmol/l(p<0.001),呈现明显浓度依赖性及时间依赖性。2.2μmol/l西达本胺处理RPMI8226细胞48h后,G1期细胞比例由28.12±1.50%升至42.42±4.80%(p<0.0.5),8μmol/l西达本胺处理U266细胞48h后,G1期细胞比例由 42.31±1.43%升至 71.25±4.65%(p<0.05)。3.2μmol/1西达本胺处理RPMI8226细胞48h后,总凋亡细胞比例从7.12±2.50%升至31.51±4.52%(p<0.05),并且光镜下可见凋亡小体、核碎裂等凋亡特征性形态学改变;8μmol/l西达本胺处理U266细胞48h后,细胞总凋亡率由6.82±2.41%升至18.21±3.51%(p<0.05),同样在光镜下可见凋亡小体、核碎裂等凋亡特征性形态学改变。4.西达本胺能够明显下调HDAC1、HDAC2及HDAC3表达,上调H3及H4乙酰化水平,能够激活 caspase-3、caspase-8、caspase-9 及 PAPR。5.西达本胺使p53磷酸化水平升高,c-myc及cyclinD1表达明显下调,p21表达明显上调;使Bax表达明显上调,Bcl-2及mcl-1表达明显下调,导致Bax/Bcl-2比率升高。结论:西达本胺对人骨髓瘤细胞株具有增殖抑制作用。西达本胺通过增加H3及H4乙酰化水平,诱导caspase途径依赖的细胞凋亡及p53依赖的G0/G1细胞周期阻滞。西达本胺有望成为有效的抗骨髓瘤候选药物。第二部分西达本胺增敏硼替佐米抗骨髓瘤细胞增殖作用及其机制研究目的:明确西达本胺增敏硼替佐米抗骨髓瘤细胞增殖作用及其机制。方法:1.CCK-8法检测硼替佐米联合西达本胺对人骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266细胞的增殖抑制作用;2.流式细胞仪PI染色方法检测药物联合作用后细胞周期变化;3.流式细胞仪AnnexinV/PI双染方法检测药物联合作用后细胞凋亡比例变化;4.Western Blot检测药物联合作用后组蛋白去乙酰化酶、细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达变化。结果:1.硼替佐米联合西达本胺作用48h可以显著抑制RPMI8226和U266细胞的增殖。0.5μmol/l西达本胺单药处理RPMI8226细胞48h后的生长抑制率为18.02±3.74%。硼替佐米(1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml)联合 0.5μmol/l 西达本胺处理RPMI8226细胞48h后的抑制率分别从(31.35±5.94%,85.71±4.33%,96.88±2.77%)提高到(65.40±3.35%,96.70±2.65%,98.35±1.14%)(p<0.05),且两药联合指数<1。2μmol/l西达本胺单药对U266细胞作用48h的生长抑制率为21.91±2.45%。硼替佐米(1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml)联合 2μmol/l 西达本胺作用 U266 细胞 48h 后的抑制率分别从(3.87±1.79%,28.48±5.63%,55.26±4.97%)提高到(35.51±3.14%,69.34±8.61%,89.21±1.35%)(p<0.05),且两药联合指数<1。2.在RPMI8226细胞中,1.25ng/ml硼替佐米处理48h后G2期细胞比例由12.83±1.10%升至 42.09±19.81%(p<0.05),联合 0.5μmol/l 西达本胺作用 48h 后G2期细胞比例为51.90±14.12%,与硼替佐米单药组无统计学差异(p>0.05)。在U266细胞中,2.5ng/ml硼替佐米处理48h后G2期细胞比例由19.70±5.49%升至46.86±11.65%(p<0.05),联合2μmol/l西达本胺作用48h后G2期细胞比例为42.98±5.57%,与硼替佐米单药组无统计学差异(p>0.05)。3.硼替佐米联合西达本胺诱导细胞凋亡比例明显增加。西达本胺单药与硼替佐米单药作用RPMI8226细胞48h后细胞总凋亡率分别为18.34±2.23%及36.23±2.45%,而两药联合后的细胞总凋亡率为52.14±5.23%,明显高于单药组(p<0.05)。西达本胺单药与硼替佐米单药作用U266细胞48h后细胞总凋亡率分别为8.94±3.16%,23.28±3.57%,两药联合后细胞总凋亡率35.42±4.54%,明显高于单药组(p<0.05)。4.硼替佐米联合西达本胺能够下调HDAC1、HDAC2、HDAC3表达并维持H3 及 H4 高乙酰化水平,激活 caspase-3、caspase-8、caspase-9 及 PAPR。5.硼替佐米联合西达本胺后使Bax表达明显上调,Bcl-2及mcl-1表达明显下调,使Bax/Bcl-2比率升高;cyclinB表达下调,p21表达上调。结论:西达本胺增强硼替佐米对人骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266增殖抑制作用和诱导凋亡作用。本研究为西达本胺联合硼替佐米应用于临床抗骨髓瘤治疗提供了实验依据。第三部分基于全转录组测序技术分析西达本胺抗骨髓瘤作用机制的研究目的:基于全转录组测序技术分析西达本胺抗骨髓瘤的作用机制。方法:以加入等体积细胞培养基为对照组,用lμmol/l西达本胺处理RPMI8226细胞株24h后,使用TRIzol法提取RNA,标本送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行全转录组测序(RNA-Seq)。使用Illumina测序检测差异基因。差异基因集的GO功能富集分析、KEGG通路富集分析及Reactome通路富集分析均采用clusterProfiler软件进行,蛋白质相互作用采用cytoscape软件分析。选取10个差异表达明显的基因用qRT-PCR方法验证。结果:1、以padj<0.05为准,全转录组测序差异基因分析提示与对照组相比,1μmol/l西达本胺作用RPMI8226细胞株24h后表达差异显著的基因共463个,其中上调基因457个,下调基因6个。选取的10个差异基因的qRT-PCR结果与转录组测序结果基本一致。2、差异基因GO分析提示差异基因主要富集在化学信号传递、神经突触形成、细胞形态、细胞生长信号调控、细胞间相互作用等过程;差异基因KEGG分析提示差异基因主要富集在轴突导向、PI3K/AKT信号途径、细胞外基质受体相互作用、细胞粘附分子及癌症相关蛋白聚糖等8个途径;差异基因Reactome分析提示差异基因主要富集在细胞外基质代谢、神经轴突导向信号、神经系统疾病、基质金属蛋白酶的活化等。3、与PI3K/AKT信号通路相关的差异表达基因有23个,均为上调基因。与轴突导向相关的差异表达基因有16个,均为上调基因。4、通过蛋白质相互作用分析,得到7个重要的差异表达基因,分别是SRC、MMP9、MMP2、NOTCH3、MYH14、GNAO1 及 RHOC。结论:西达本胺影响多发性骨髓瘤细胞多条信号通路和多种生物学功能,其中需要特别关注PI3K/AKT信号通路及轴突导向通路。总结1、西达本胺对人骨髓瘤细胞株具有增殖抑制作用和诱导凋亡作用。2、西达本胺通过增加H3及H4乙酰化水平,诱导caspase途径依赖的细胞凋亡和G0/G1细胞周期阻滞。3、西达本胺增强硼替佐米对人骨髓瘤细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡作用。4、西达本胺增强硼替佐米对骨髓瘤细胞诱导caspase途径依赖的细胞凋亡。5、西达本胺影响多发性骨髓瘤细胞多条信号通路和多种生物学功能。其中需要特别关注PI3K/AKT信号通路及轴突导向通路。6、西达本胺有望成为有效的抗骨髓瘤候选药物。
关键词: 西达本胺 ；硼替佐米 ；组蛋白去乙酰化酶抑制剂 ；多发性骨髓瘤 ；细胞凋亡 ；周期阻滞 ；全转录组测序 ；PI3K/AKT ；轴突导向
摘要： 目的:基于数据挖掘技术分析高天舒教授治疗Graves病的配伍规律,并利用血液蛋白质组学技术探究含富碘中药滋阴降火散结方治疗Graves病的潜在作用机制。材料与方法:第一部分收集2020年9月至2021年10月于辽宁中医药大学附属医院内分泌科门诊就诊的85例经高天舒教授诊治的Graves病患者。将病例信息录入“中医传承计算平台V3.0”软件中,通过中医传承计算平台的数据统计模块进行数据处理与分析,进而统计85位患者的证候;处方中的药物种类、四气、五味、归经;药物单品的使用频次;分析药物之间的关联规则、分析核心处方。第二部分研究根据第一部分研究得出的最常见的证型继续筛选该证型的Graves病患者,并对患者进行为期一个月的单纯中药复方治疗,收集患者的基本信息、治疗前后的实验室检查结果及甲状腺超声结果,并采用血液蛋白质组学技术对患者治疗前后的血液进行对比分析以评价含富碘中药复方干预后血液蛋白的差异表达情况。结果:1.临床Graves病出现的证型最多见为阴虚火旺痰凝证、其次心肝火旺证、气阴两虚证。应用中药的种类频次前5类由多到少依次为清热类、化痰止咳平喘类、补虚类、平肝熄风类、活血化瘀类。药物四气统计频次中,“寒”性药物使用频次最高,其次分别为“平”性药物和“温”性药物,在归经分类中,以入肝经的药物最多。百合、知母、夏枯草、白花蛇舌草、生地黄、玄参、浙贝母、牡蛎、海藻、昆布是高天舒教授治疗Graves病遣方用药的经典规律。2.未使用ATDs的患者在接受为期1个月的含富碘中药滋阴降火散结方治疗后,血清FT3、FT4、TRAb、甲状腺体积、甲状腺上动脉血流速度峰值较治疗前显著下降,血清TSH水平显著上升,血清Tg Ab、TPOAb水平较治疗前未见统计学差异。3.起始治疗前的GD患者与健康对照组相比,106个蛋白显著高表达,93个蛋白显著低表达;经一个月含富碘中药滋阴降火散结方干预后的GD患者与健康对照组相比,58个蛋白显著高表达,45个蛋白显著低表达;经含富碘中药滋阴降火散结方干预后的GD患者与接受治疗前相比,36个蛋白显著高表达,31个蛋白显著低表达。根据生物信息学分析结果,生物进程分类中差异表达蛋白质功能主要涉及到细胞进程、生物功能调节、应激反应、多细胞有机体过程、定位功能、发育过程、代谢进程、信号转导、免疫进程、生物附着、多器官进程、细胞迁移等;在细胞组成分类中差异表达蛋白质主要位于细胞、细胞内、含蛋白质复合物等部位;在分子功能分类中差异表达蛋白主要有蛋白结合、催化活性、分子转导活性、结构分子活性、信号传导活性、蛋白质折叠伴侣等功能。COG/KOG分类结果提示差异蛋白功能分类主要集中在信号转导机制（13个差异蛋白）,翻译后修饰、蛋白转运、分子伴侣（8个差异蛋白）,细胞骨架（5个差异蛋白）和能量生产和转换（5个差异蛋白）。GO富集提示在生物学进程中富集性最显著的是对环磷酸腺苷（c AMP）的反应性、对白介素-6的反应性、细胞内转运负调控以及对睾酮的反应性;在细胞组成中富集较为显著的是酶原颗粒、多核糖体、兴奋性突触和内质网膜腔侧;在分子功能中富集较为显著的是类固醇激素受体结合、细胞核激素受体结合、激素受体结合、嘌呤核苷三磷酸结合等。KEGG富集提示差异表达蛋白与c AMP信号通路、幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号转导、胃酸分泌、心肌细胞肾上腺素能信号传导、c GMP-PKG信号通路、神经轴突导向有关。结论:1.GD患者中以阴虚火旺痰凝证、心肝火旺证和气阴两虚证为主,而又以阴虚火旺痰凝证的患者最为常见。故临床治疗时应该审证求因,牢牢把握滋阴降火散结之治疗大法。2.含富碘中药滋阴降火散结方可通过多个靶点、多条通路影响Graves病的发生发展进程,Rap1b蛋白可能是含富碘中药滋阴降火散结方发挥治疗作用的潜在靶点。
关键词: Graves病 ；数据挖掘 ；组方规律 ；血液蛋白质组学
被引量
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摘要： 提高家蚕的产丝量是蚕丝业几千年来一直追求的目标。家蚕的丝腺是合成和分泌蚕丝蛋白的器官,是整个蚕丝业的生物学基础。因此,探明家蚕丝腺形成和发育的分子调控机制具有重要的理论意义和实践意义。Slit是一类在进化上高度保守的分泌型糖蛋白,它与受体Roundabout(Robo)在神经轴突导向、神经元的迁移、血管生成、癌细胞转移、白细胞趋化等多种生理病理过程中具有调节作用。家蚕丝腺被认为是果蝇唾液腺的进化同源器官。现有研究发现,Slit及其受体Robo在果蝇唾液腺发育中发挥着重要作用,但是在家蚕丝腺中的功能研究还未有相关报道。Tbx20是一种进化上高度保守的转录因子,是T-box转录因子家族成员之一,在调控心脏发生、控制细胞迁移、促进细胞增殖等过程中扮演着重要角色。在果蝇胚胎发育过程中,Tbx20的同源基因midline能够调控唾液腺的导向迁移,也可以同时调控神经系统中slit和robo基因的表达,但对于Tbx20在家蚕中的功能目前还不清楚。本研究基于前期在家蚕中已鉴定并克隆的Bmslit和Bmrobo(Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3)以及Bmtbx20基因,通过qPCR和免疫荧光染色确定Bmslit、Bmrobo及Bmtbx20基因在丝腺中的时空表达模式,探讨它们在丝腺发育中的功能,并在胚胎期采用RNAi技术,分析BmTbx20对Bmslit和Bmrobo基因的表达调控作用及对丝腺发育的影响,以期为揭示家蚕丝腺发生和发育的基因调控网络提供新的资料。主要研究结果如下:1.利用qPCR技术,系统检测了家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的表达变化。结果表明,Bmslit和3个Bmrobo基因在家蚕前、中、后部丝腺中均有表达,而且在不同发育时期存在很大差异,但Bmslit和Bmrobo的表达特征具有较高的相似性和关联性。2.通过免疫荧光染色对BmSlit和BmRobo蛋白进行双染,发现BmRobo1a、BmRobo1b、BmRobo2/3与BmSlit在家蚕胚胎以及幼虫不同发育时期、不同功能区的丝腺细胞质中均有合成,而且在幼虫丝腺细胞膜处都存在共定位。说明BmSlit可能通过与BmRobo结合而在家蚕丝腺中发挥作用。3.分别将Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的siRNA注射到丝腺发生前的蚕卵中进行RNA干涉。qPCR检测发现,注射48 h后的蚕卵中以上4种基因的表达均被不同程度抑制,相对表达量都比对照组极显著下调。4.取家蚕不同发育时期的丝腺组织,通过qPCR和免疫荧光染色分别从转录水平和蛋白水平上分析了Bmtbx20基因在丝腺中的时空表达模式。结果表明,Bmtbx20在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期均有表达,转录因子BmTbx20与BmSlit在家蚕胚胎期和幼虫期丝腺中均有合成。5.对家蚕17-18期胚胎中的Bmtbx20基因进行RNAi,qPCR测定显示,蚕卵注射后48 h,不仅Bmtbx20的相对表达量与对照组NC相比极显著下降,而且Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的相对表达量也都存在不同程度的下调。这些结果表明,转录因子BmTbx20可能通过调控Bmslit和Bmrobo基因的表达从而调控丝腺的发育过程。6.在家蚕胚胎期对Bmslit、Bmrobo以及Bmtbx20基因进行RNAi,与对照组NC相比,Bmslit和Bmrobo基因RNAi后,丝腺的发生位置及丝腺发育情况均未见明显差异。但Bmtbx20基因RNAi后会导致胚胎发育加快,丝腺发育也相应提前,故在同一催青时间,丝腺较对照组延伸的较长。关于这些基因在丝腺发育中的详细作用机理还有待利用基因敲除等手段做进一步研究。
关键词: 家蚕 ；丝腺 ；BmSlit ；BmRobo ；BmTbx20
摘要： 研究背景 骨癌痛（Bone cancer pain,BCP）是原发性或者转移性骨肿瘤引起的慢性疼痛。据世界卫生组织(WHO)统计,全世界每年新增1000万癌症患者，约三分之一的恶性肿瘤会发生骨转移。绝大部分骨肿瘤患者会出现不同程度的慢性疼痛。由于目前对骨癌痛机制的认识不足以及临床现有治疗措施的局限性，约50%的骨癌患者疼痛未得到有效控制。长期慢性疼痛给患者及其家人带来巨大痛苦，严重影响患者生活质量，甚至使患者丧失生活自理能力。所以，对骨癌痛机制的深入研究，以期为癌痛治疗提供有效的治疗措施，是目前亟待解决的重大问题。 基于对多种骨癌痛动物模型的研究，目前对骨癌痛的独特机制有了初步了解，认为骨癌痛与其它慢性疼痛不同，涉及多种炎症介质、细胞因子、多种受体和离子通道，既有炎性痛，又有神经病理性疼痛的成分。要破解骨癌痛发生这个错综复杂的分子网络，沿用传统的研究方法，从单一基因、或单个因素入手是无法解释和阐明这些现象的本质及其相互之间的因果关系并取得突破性进展的。 利用基因组学为平台，应用基因芯片分析技术，可以从细胞、组织、器官和生物体整体水平上研究结构和功能各异的各种分子及其相互关系，能够定量描述和预测生物功能、表型和行为，能客观真实地反映机体的整体变化。因此，本实验拟应用寡核苷酸微阵列芯片及生物信息学技术，研究骨癌痛模型与神经病理性痛模型、炎性痛模型大鼠脊髓水平基因表达谱差异，筛选出―脊髓组织骨癌痛特异性基因‖，进而利用计算生物学方法，采用统计学中聚类分析，探讨骨癌痛发生发展过程中脊髓组织分子水平的改变与疼痛行为学的关系，发掘在骨癌痛发病机制中起关键作用的特异基因表型。 中枢敏化是指脊髓和脊髓以上部位对疼痛信号传导的放大过程,是目前解释神经病理性疼痛，炎性痛等多种慢性疼痛出现痛觉过敏和痛觉超敏的主要理论。临床资料和基础实验研究提示，脊髓水平的中枢敏化是骨癌痛产生和维持的重要机制。在脊髓水平,背角是疼痛的调制主要部位，也伤害性信息的初级整合中枢。外周伤害性信息经初级传入纤维传入背角后，在此中继、整合,再由投射神经元向上位脑结构传递，最终产生痛觉。因此，目前对疼痛形成中脊髓敏化的研究也多集中在背角部位。 突触传导的可塑性改变是疼痛产生过程中脊髓敏化的重要机制之一。突触可塑性是指突触效能在某些因素的作用下出现不同程度的增强或减弱的特性。突触的可塑性改变包括两方面，一个是对现有突触结构的修饰，改变突触递质的释放而增强或减弱突触的传导性能，另一个是长时程突触可塑性调节机制，是通过增加或减少突触的数量来调节突触的传递效能。有研究报道，突触重塑导致脊髓敏化是骨癌痛发生的重要因素，但突触重塑的方式及其具体机制都不清楚。由于骨癌痛是一个长期慢性进展的过程，突触重塑过程也将是一个长期的持续变化，因此我们假设骨癌痛脊髓敏化是通过增加兴奋性突触数量来实现突触传递增强的。但是，新的突触的形成需要神经元轴突或树突延伸以及有导航作用的分子引导新生突起精确对接才能完成，而这个过程的分子机制也不清楚。 Slit homolog2protein(Slit2)是一种神经轴突的导向分子，在神经系统发育过程有重要作用。能够刺激神经元轴突生长和延伸以及侧支的形成[28-30]，调控神经元迁移，并且通过对生长锥的导向而指导突触的形成和功能性神经网络的建立。Roundabouthomolog1(Robo1)属于细胞粘附分子免疫球蛋白超家族成员，是slit2的受体，通过与slit2结合对神经元和生长锥产生排斥作用，参与调控发育中的中枢神经轴突定向延伸，促进轴突生长和调控神经纤维束化、定位以及突触的形成。研究显示Slit2和Robo1可能在病理状态下参与神经系统结构性重塑过程。因此我们假设，在骨癌痛形成过程中，Slit2和Robo1结合后，发挥了分子导向作用，促进轴突分支靶向性迁移而引导突触形成。为了证实Slit2和Robo1结合导致脊髓中新突触的形成而诱发骨癌痛脊髓敏化这一假说，本实验拟建立大鼠骨癌痛模型，利用RNA干扰技术等分子生物学技术，论证Slit2和Robo1在骨癌痛形成中的作用以及对神经元轴突延伸和突触形成的影响。以期从一个全新的角度揭示骨癌痛发生的机制，为骨癌痛是治疗寻找新的靶点 研究方法与结果 1.骨癌痛大鼠脊髓特异性基因表达谱的筛选 方法选择雌性wistar大鼠，随机分为4组：正常组，骨癌痛组，神经病理性疼痛组和炎性痛组。分别制作乳腺癌细胞胫骨种植的骨癌痛模型，L5脊神经结扎的神经病理性疼痛模型和弗氏完全佐剂（CFA）足底注射的炎性痛模型。模型建立后，进行痛阈测定。在疼痛发展的不同时期分别取各组大鼠脊髓腰L4-6进行基因芯片检测。采用统计分析筛选表达差异的基因谱，结合聚类分析和分子注释功能数据库分析特异基因之间的相互作用，模拟疼痛的分子路线图。 结果基因芯片检测结果提示在炎性痛早期，有2245个基因表达上调，其中包括479个基因仅在早期表达上调，515个基因持续上调至疼痛进展期，有1093个基因则在整个炎性痛发生发展过程中是持续上调。在疼痛的进展期共有2089个基因表达上调，其中263个基因仅在这个时间段上调，另外有118个基因从疼痛进展期出现上调，并持续至后期。在炎性痛的后期有1679个基因表达上调，其中有310个基因仅在后期出现表达上调。 神经病理性疼痛大鼠脊髓组织基因芯片检测结果提示在疼痛早期，有1570个基因表达上调，其中包括227个基因仅在早期表达上调，301个基因上调持续至疼痛进展期，有884个基因则在整个神经病理性疼痛发生发展过程中持续上调。在疼痛的进展期共有1560个基因表达上调，其中265个基因仅在进展期上调，另外有110个基因从疼痛进展期开始出现持续表达上调。在神经病理性疼痛的维持期有1476个基因表达上调，其中有342个基因在疼痛维持期才出现表达上调。 骨癌痛基因芯片的结果提示在骨癌痛早期，有1383个基因表达上调，其中包括381个基因仅在早期表达上调，155个基因上调持续至疼痛进展期，有691个基因则是在骨癌痛发生发展过程中是持续上调。在疼痛的进展期共有1740个基因表达上调，其中414个基因仅在这个时间段上调达，另外有480个基因从疼痛进展期开始出现持续表达上调。在骨癌痛的维持期则有1908个基因表达上调，其中有581个基因在疼痛的维持期出现表达上调 综合分析三种大鼠疼痛模型基因芯片分析的结果显示，有352个基因仅在炎性痛发生发展中持续表达上调，196个基因仅在神经病理性疼痛的进展过程中持续表达上调，而骨癌痛中有216个基因持续表达上调。有344个基因在三种慢性疼痛进展中均持续表达上调。 2. Slit2/Robo1促进兴奋性突触形成诱发骨癌痛 方法选择雌性wistar大鼠，随机分为5组：假手术组(Sham)，骨癌痛组(BCP)，对照病毒组(BCP+NC-LV)，Slit2干扰病毒组（BCP+siSlit2-LV）和Robo1干扰病毒组（BCP+siRobo1-LV）。建立骨癌痛模型并进行脊髓内病毒注射。模型建立成功后进行痛阈测定。3W后处死动物进行取出，用HE染色观察肿瘤细胞侵犯胫骨情况。用免疫组化多重标记法结合RT-PCR和Western blot检测大鼠脊髓腰膨大部分Slit2，Robo1，Rhoa的表达；用免疫共沉淀检测Slit2和Robo1之间的直接作用；用电镜检测脊髓背角突触形成情况；用免疫组化双标结合RT-PCR和Western blot检测背角兴奋性突触的形成及相关标记物表达情况。 结果HE染色结果显示乳腺癌细胞接种的大鼠胫骨骨髓腔中有大量的癌细胞，癌细胞向骨质扩散，突破骨髓腔，随着病程延长，癌细胞骨质侵犯进行性加重，后期可出现病理性骨折。机械痛阈测定结果显示，癌细胞接种后第9天，大鼠接种癌细胞侧的后肢出现痛阈下降，随病程进展疼痛进行性加剧，癌细胞接种对侧后肢痛阈没有改变。siSlit2-LV明显缓解大鼠骨癌痛的症状，而Robo1则显著加剧疼痛。免疫组化结果提示Slit2，Robo1和Rhoa均广泛共表达在脊髓背角的神经元上。定量实验分析显示在骨癌痛大鼠脊髓背角中Slit2表达上调，Robo1和Rhoa表达下调；RNA干扰慢病毒成功的下调大鼠脊髓背角中Slit2和Robo1的表达。而且siSlit2-LV下调Slit2表达的同时导致Robo1和Rhoa的表达上调，siRobo1-LV显著下调Robo1和Rhoa的表达，但不影响Slit2的表达。电镜检测突触数量和免疫组化双标检测突触标记蛋白表达均提示骨癌痛大鼠脊髓背角兴奋性突触数量明显增多，siSlit2-LV可减少骨癌痛大鼠脊髓背角兴奋性突触的形成，而Robo1则明显增加兴奋性突触的形成。RT-PCR和Westernblot对突触标记蛋白的定量研究结果与免于组化一致。 3. Slit2/Robo1促进轴突延伸诱导兴奋性突触形成 方法原代培养大鼠皮质神经元。将细胞随机分为4组：正常组（Normal）,对照病毒组(NC-LV)，Slit2干扰病毒组（siSlit2-LV）和Robo1干扰病毒组（siRobo1-LV）。在细胞培养液中加入慢病毒转染5天后，用荧光显微镜观察病毒转染情况，用免疫组化多重标记法结合RT-PCR和Western blot检测神经元上Slit2，Robo1，Rhoa的表达；利用免疫组化观察神经元形态变化；用免疫组化双标结合RT-PCR和Western blot检测神经元兴奋性突触形成及相关蛋白的表达情况。 结果免疫组化结果提示Slit2，Robo1和Rhoa共表神经元上。定量检测结果显示干扰慢病毒成功的下调神经元中Slit2和Robo1的表达。siSlit2-LV下调Slit2表达的同时导致Robo1和Rhoa的表达上调，siRobo1-LV显著下调Robo1和Rhoa的表达，但不影响Slit2的表达。siSlit2-LV明显减少神经元轴突的长度和分支数量，而Robo1则显著增加轴突长度和促进轴突分支形成。siSlit2-LV可减少神经元兴奋性突触的形成，而Robo1则明显增加兴奋性突触的形成。 4.统计学处理 统计学分析采用SPSS18.0统计软件，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析（AnalysisofVariance,ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。 研究总结 一、主要研究结果 1.利用基因芯片分析了骨癌痛，神经病理性痛疼和炎性痛发生发展过程中相关的脊髓基因表达谱。并筛选出与骨癌痛形成有关的脊髓特异性基因表达谱。利用分子功能关联分析，模拟与骨癌痛形成分子网络图。 2.骨癌痛大鼠脊髓中Slit2表达上调，Robo1和Rhoa表达下调；RNAi慢病毒下调Slit2表达则明显缓解骨癌痛，而下调Robo1表达则显著加剧骨癌痛。 3.骨癌痛大鼠脊髓中兴奋性突触数量明显增多；RNAi慢病毒下调Slit2表达则明显减少突触数量，而下调Robo1表达则显著进一步增加突触数量。 4. RNAi慢病毒下调Slit2表达则减少原代培养的神经元轴突长度和分支数量，而下调Robo1表达则显著增加突长度和分支数量。 5. RNAi慢病毒下调原代培养神经元中Slit2表达则明显减少兴奋性突触形成，而下调Robo1表达则显著增加突触形成。 二、研究结论 1.骨癌痛和炎性痛以及神经病理性疼痛三者的发生机制既有共同之处，又有各自的特性。其调控过程不仅是一个复杂的分子网络式整合过程，同时也是一个动态进展的过程，在不同时期有不同基因调控网络。 2.骨癌痛大鼠脊髓中Slit2表达上调，通过与Robo1结合，抑制Robo1和Rhoa的表达，参与骨癌痛的形成。 3. Slit2通过与Robo1直接结合，抑制Robo1和Rhoa的表达，促进大鼠脊髓背角兴奋性突触的形成而导致骨癌痛发生。 4. Slit2通过与Robo1结合，抑制Robo1和Rhoa的表达，通过促进神经元轴突的延伸和分支形成，以及Slit2介导的轴突导向作用诱导兴奋性突触的形成。 三、创新之处 1.本研究首次分析了分别与骨癌痛、炎性痛和神经病理性疼痛发生发展密切相关的特有的基因表达谱以及慢性疼痛形成共同的基因表达谱。
关键词: 骨癌痛 ；基因芯片 ；Slit2 ；Robo1 ；脊髓 ；突触
被引量
1
摘要： 中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）主要由两类细胞组成——神经元和胶质细胞。胶质细胞是神经系统的间质和支持细胞，对神经元的存活、分化、迁移、突触联系和神经冲动传导等均起到重要的调节作用，胶质细胞生物学已逐渐成为当前神经科学研究的热点之一。脑内的胶质细胞主要有三类：星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。本研究主要关注少突胶质细胞在中枢神经系统发育及损伤后修复中的相关作用机制。
少突胶质细胞（oligodendrocytes，OLs）由少突胶质前体细胞（oligodendrocyteprecursor cells，OPCs）经过增殖、迁移、分化形成，是中枢神经系统唯一的成髓鞘细胞。在脊椎动物，神经系统中轴突髓鞘化的顺利完成以及髓鞘的完整性是维持轴突绝缘和实现动作电位跳跃式传导的重要保证，在进化上具有重要意义。在中枢神经系统发育及修复所涉及到的髓鞘化过程中，少突胶质细胞的迁移扮演了重要的角色。然而，精确调节少突胶质细胞迁移的细胞外和细胞内机制目前尚未研究清楚。近年来的研究显示，Slits蛋白家族可通过与其受体Robos的结合，调节诸多神经发育过程中的事件，例如细胞的迁移、粘附、轴突导向和延伸。Slit2在运动神经元区域具有高表达，而这一区域正是OPCs产生的区域；Slit2在大鼠腹侧脊髓维持高表达水平而在背侧脊髓低表达。这些空间表达特征提示，Slit2有可能参与了对OPCs迁移过程的调节，然而迄今尚未见Slit2在OPCs迁移中的作用的研究报道。
OLs通过形成髓鞘，促进神经冲动转导，并维持轴突完整性。神经损伤后，髓鞘崩解，并释放多种降解产物，能够抑制神经轴突的再生。这些降解产物被称为髓鞘相关抑制因子（myelin-associated inhibitory factors，MAIFs）。目前已鉴定出五个MAIFs，其中Nogo、髓鞘相关糖蛋白（myelin-associated glycoprotein，MAG）以及少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp）能够直接与同一个受体，Nogo受体复合物，结合并发挥功能。最初鉴定的Nogo受体复合物由三个部分组成：Nogo受体（NgR）、p75神经营养因子受体（p75neurotrophin receptor，p75）和LINGO-1，之后的研究发现，TROY受体可以功能性地替代p75，参与组成Nogo受体复合物，即构成NgR/TROY/LINGO-1受体复合物。这一三联受体复合物与配体结合后，激活其下游的小G蛋白RhoA GTP酶，引起神经元生长锥塌陷、轴突再生抑制。目前已知神经突起生长的抑制依赖于TROY介导的RhoA激活，但TROY是通过何种机制激活其下游的RhoA，迄今尚不清楚。
本研究运用多种实验手段，对少突胶质前体细胞的迁移机制以及髓鞘相关抑制因子的作用机制进行了研究，旨在深入认识神经元与胶质细胞相互作用机制，以期为设计与开发促进神经再生与修复的策略开创新思路。本研究取得的主要结果如下：
1.轴突导向分子Slit2通过Fyn-RhoA信号通路调节少突胶质前体细胞的迁移
我们的研究显示：（1）运用免疫细胞化学、免疫组织化学、RT-PCR及Western-Blot实验方法，明确了在体外培养的以及体内OPCs中均表达Robos受体；（2）运用Transwell小室迁移实验，发现Slit2可以排斥OPCs的迁移，并且这种排斥效应与Slit2的浓度有关；（3）运用Robos受体的特异性抑制物RoboN进行Transwell小室迁移实验，可以显著减弱Slit2的这一效应；（4）用Slit2蛋白处理体外培养的OPCs，观察到OPCs中Fyn活化水平降低，而RhoA的活化水平升高；（5）运用免疫共沉淀实验（Co-IP）发现，OPCs中的Fyn可与Robo1相互作用，并且，对OPCs给予Slit2刺激后，Fyn和Robo1的结合强度下降。本部分结果表明，Slit2与其受体Robo1的结合能够通过Fyn和RhoA信号通路调节少突胶质前体细胞的迁移。
2. TROY受体与RhoGDIα的相互作用参与了Nogo-66介导的神经突起生长抑制作用
我们的研究显示：（1）利用GST（glutathione S-transferase，谷胱甘肽S-转移酶）pull-down技术联合二维电泳、质谱分析，鉴定出RhoGDIα是TROY的一个结合分子；采用免疫共沉淀（Co-IP）的方法在体外培养的细胞和组织水平进一步确证了TROY与RhoGDIα的结合；（2）缺失突变分析结果显示，TROY胞内段（ICD）的234-356aa（amino acids）和321-350aa两段序列介导了TROY与RhoGDIα的结合；（3）运用免疫细胞化学、免疫组织化学方法，在出生后的中枢神经系统的脊髓背根神经元（DRG）、大脑皮层神经元以及小脑颗粒神经元（cerebellar granule neurons，CGNs）中均检测到了TROY和RhoGDIα的共定位；（4）Nogo-66能够增强TROY/RhoGDIα的相互作用，且TROY/RhoGDIα的相互作用是p75非依赖性的；（5）在p75基因敲除小鼠的神经元中，TROY/RhoGDIα的相互作用仍然可介导RhoA的激活；（6）在野生型和p75敲除的小脑颗粒神经元中过表达RhoGDIα能够阻断Nogo-66介导的RhoA的激活以及随后的神经突起生长抑制。本部分结果表明，RhoGDIα与TROY的相互作用参与了Nogo-66介导的依赖于TROY的RhoA活化，并抑制了神经突起生长。
综上所述，本研究发现：Slit2作为一个轴突排斥性导向分子，能够在发育过程中以排斥性的方式调节OPCs的迁移；TROY作为髓鞘相关抑制因子受体的一个组成成分，可以通过与RhoGDIα的相互作用介导髓鞘相关抑制因子的神经突起抑制作用。这一研究有助于深入认识神经发育与再生过程中神经元与胶质细胞相互作用的机制。
关键词: 细胞迁移 ；少突胶质前体细胞（OPCs） ；Slit2 ；RhoA ；Fyn ；TROY ；RhoGDIα ；神经突起生长 ；Nogo-66
被引量
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摘要： 随着妊娠的进展,部分细胞滋养细胞分化为绒毛外滋养细胞,弥散侵入子宫蜕膜及肌层上三分之一,并对其中的螺旋小动脉进行重铸,其结果是减少胎盘床末梢血管阻力,使较多的血液无障碍的流入胎盘的绒毛间隙,以保证胎盘和胎儿的正常生长。若滋养细胞功能障碍,导致胎盘“浅着床”,则子宫胎盘循环障碍,胎盘缺血缺氧,引起病理性改变,致流产、胎儿生长受限及子痫前期等病理妊娠发生。最近研究表明,血管新生相关因子与绒毛外滋养细胞侵袭功能密切相关,可能是引起胎盘循环障碍的重要因素。
Netrins是一类高度保守的层粘连蛋白相关的分子家族,对神经细胞的迁移具有吸引和排斥双重作用。近年研究发现,其家族成员Netrin-1,常通过与其特异性配体Neogenin相互作用后介导神经轴突导向生长。基于神经血管发育过程在形态学上的类似性,众多学者亦发现Netrin-1能通过对内皮细胞抑制凋亡、促进增殖和管腔形成来介导血管新生。这一点亦得到我们前期研究的证实。此外,Neogenin可作为一种血管新生因子促进兔角膜囊新生血管生长,但它对滋养细胞生理功能影响的研究尚未见报告。在本研究中,我们研究了Netrin-1在正常妊娠及胎盘循环障碍母胎界面中的表达及分布,同时在体外通过可溶性Netrin-1受体,即Neogenin,结合培养基中游离Netrin-1后,观察人绒毛外滋养细胞株(TEV-1)生物学行为的改变情况,旨在探讨Netrin-1/Neogenin与妊娠期胎盘循环障碍发生的关系,为防治病理妊娠提供有力的实验基础和理论依据。
目的：
1、观察人滋养细胞(TEV-1)经血清剥夺刺激后,VEGF、Netrin-1的表达及分布情况,同时监测TEV-1增殖、凋亡及管腔形成等生物行为的变化,探讨血清剥夺对滋养细胞生物行为的影响及其机制。
2、人滋养细胞(TEV-1)经含不同浓度Neogenin的无血清培养基培养24h后,监测细胞VEGF、Netrin-1、RGMa、DAPK和Neogenin的表达及增殖、凋亡、侵袭和管腔形成等生物行为的变化,探讨Neogenin对滋养细胞生物行为的影响及其机制。
方法：
1、行早孕期滋养细胞株TEV-1培养,并随机分为以无血清培养基处理的实验组及含15%胎牛血清的培养基处理的对照组,应用噻唑兰(MTT)比色法、流式细胞术(FCM)法检测细胞增殖凋亡情况,并监测管腔形成的变化。同时利用免疫荧光细胞化学染色法及实时定量PCR检测VEGF、Netrin-1蛋白表达定位及VEGF、Netrin-1 mRNA变化情况。
2、首先用含0、1、5、10及50ng/ml的Neogenin无血清培养基预处理TEV-1细胞24h,应用噻唑兰(MTT)比色法、流式细胞术(FCM)法检测细胞增殖指数、凋亡率,并采用AO/EB双染法对细胞凋亡进行形态学监测；此外,监测TEV-1穿过Matrigel基质膜情况及管腔形成的变化；同时检测Caspase-3的活性,实时定量PCR检测及RGMa、DAPK、Neogenin、Netrin-1、VEGF mRNA变化情况。Western印迹检测Netrin-1、VEGF蛋白变化情况。
结果：
1、血清剥夺能显著减少TEV-1细胞Netrin-1 mRNA表达水平(p<0.05),但对TEV-1细胞VEGFmRNA水平无明显影响(p>0.05)。与含血清培养基比较,在无血清培养基中细胞增殖功能明显下降且细胞总凋亡率增加。
2、经不同浓度Neogenin处理24h后,MTT检测各组细胞吸光度值为0.11±0.02、0.08.±0.01、0.12±0.02、0.14±0.07及0.12±0.09。所有数据经统计学处理表明各组细胞增殖能力无明显变化(p>0.05)
3、FCM检测表明Neogenin诱导TEV-1凋亡；Neogenin诱导的TEV-1凋亡率随Neogenin浓度增加而变大,当Neogenin刺激浓度达50ng/ml时,滋养细胞总凋亡率达29.6%,较空白组(0ng/ml)6.8%凋亡率显著增加(P<0.01)。但各组间Caspase-3活性相比无明显差异(P>0.05),与对照组相比,各组Caspase-3活性依次为对照组1.02±0.00、1.06±0.00、0.93±0.02、1.04±0.01。
4、Real-time PCR结果显示：不同浓度Neogenin干预TEV-1细胞24小时后,TEV-1细胞RGMamRNA的表达水平依次为空白对照组(即Ong/ml Neogenin)的0.62±0.04、0.90±0.04、0.90±0.03及0.75±0.03；DAPK mRNA的表达水平在依次为空白对照组的0.68±0.02、0.74±0.01、0.51±0.01及0.33±0.01；Neogenin mRNA的表达水平依次为空白对照组的1.45±0.03、1.22±0.08、1.47±0.00及1.14±0.00。
5、VEGF、Netrin-1蛋白均表达于TEV-1细胞胞浆,在培养的滋养细胞中加入不同剂量的Neogenin干预滋养细胞24h后,滋养细胞Netrin-1表达量均升高,当Neogenin的干预剂量达到50ng/ml时,滋养细胞Netrin-1 mRNA水平较空白对照组约增加44.84倍,呈现一定的量效关系(P<0.01)。western印迹检测Netrin-1蛋白未见类似变化趋势。
6、滋养细胞培养24h后可出现管腔形成现象,且这一现象不受血清剥夺及不同浓度Neogenin的影响。
7、经不同浓度neogenin干预TEV-1细胞24小时后,其穿膜能力减弱。
结论：1、血清剥夺后,Netrin-1 mRNA表达显著减少,滋养细胞出现凋亡增加及增殖抑制现象,血清剥夺可能通过影响Netrin-1的表达来参与对滋养细胞增殖凋亡的调控。血清剥夺不影响滋养细胞管腔形成。
2、Neogenin对TEV-1细胞增殖无影响,Neogenin诱导TEV-1凋亡,并呈一定的浓度依赖性,Neogenin不影响滋养细胞管腔形成,Neogenin对TEV-1细胞侵袭功能具有抑制作用。
3、Neogenin下调TEV-1细胞内DAPK mRNA表达、上调Neogenin mRNA表达,不影响RGMa mRNA的表达,推测Neogenin可能通过DAPK途径参与了滋养细胞凋亡的调控。
4、游离Neogenin中和培养基中Netrin-1后,通过Netrin-1/Neogenin信号转导途径,反馈作用于滋养细胞,促进Netrin-1转录及翻译。
目的：
1、了解正常早孕绒毛、蜕膜,正常足月妊娠及子痫前期胎盘及蜕膜中的微血管密度,从而证实血管新生参与妊娠发生。
2、测定相应患者血清VEGF水平及绒毛、胎盘及蜕膜中Netrin-1、VEGF表达情况。并探究Netrin-1、VEGF对血管新生的影响及与子痫前期发病的关系。
3、测定另外收集的正常足月妊娠及循环障碍胎盘中Netrin-1、VEGF蛋白水平,进一步探究Netrin-1、VEGF与胎盘循环障碍发病的关系。
方法：
1、收集16例正常早孕期绒毛及蜕膜,27例足月妊娠和45例子痫前期(其中轻、重度子痫前期分别为21例及24例)胎盘及蜕膜,行免疫组织化学染色法检测微血管表达情况。
2、利用ELISA方法监测1中相应孕妇血清VEGF;水平。并利用免疫组化方法检测绒毛、胎盘及蜕膜中Netrin-1、VEGF:表达情况并行光密度分析。
3、采用免疫印迹法(Western blot)检测另外收集的24例妊娠(其中正常妊娠6例,轻度子痫前期5例,重度子痫前期4例,胎儿生长受限3例,胎儿生长受限合并轻度子痫前期3例,胎儿生长受限合并重度子痫前期3例)胎盘中VEGF及Netrin-1蛋白表达水平。
结果：
1、与正常足月妊娠胎盘相比：1)妊娠早期母胎界面微血管密度较低,以蜕膜为甚；2)轻度子痫前期胎盘及蜕膜血管密度无明显变化；3)重度子痫前期胎盘、蜕膜微血管密度降低(均P<0.05)。
2、ELISA方法监测相应孕妇血清VEGF水平显示：正常妊娠晚期患者体内VEGF浓度高于妊娠早期患者体内VEGF浓度。与正常足月妊娠相比,轻度子痫前期VEGF水平变化不明显,重度子痫前期VEGF浓度下降明显(P<0.05)
免疫组化检测相应孕妇母胎界面Netrin-1及VEGF结果显示：1.胎盘组织中滋养细胞胞及内皮细胞胞浆可见Netrin-1表达,而VEGF主要见于胎盘组织中内皮细胞部位。孕期蜕膜基质细胞、蜕膜细胞胞浆中均可见Netrin-1及VEGF表达。2.对各组标本进行光密度分析表明：A.与正常足月妊娠胎盘VEGF表达水平相比,早孕绒毛、轻度子痫前期胎盘、早孕蜕膜、轻度子痫前期蜕膜VEGF无明显差异,但在重度子痫前期胎盘及蜕膜内VEGF水平明显下降(P<0.05)。B.与正常足月妊娠胎盘Netrin-1表达水平相比,早孕绒毛、轻度子痫前期胎盘、早孕蜕膜、轻度子痫前期蜕膜Netrin-1无明显差异,但在重度子痫前期胎盘及蜕膜内Netrin-1水平明显下降(P<0.05)。
3、Western blot检测相应Netrin-1及VEGF蛋白结果显示：1. Netrin-1蛋白在正常足月妊娠组表达最高,而在胎儿生长受限组、轻度子痫前期、重度子痫前期、轻度子痫前期合并胎儿生长受限组及重度子痫前期合并胎儿生长受限组表达水平均减弱,并较正常足月妊娠组下降明显(P<0.05)。Netrin-1蛋白表达水平在轻度子痫前期及重度子痫前期合并胎儿生长受限组较正常足月妊娠组极显著下降(P<0.01)。2.VEGF在胎儿生长受限组表达水平最高,在重度子痫前期、轻度子痫前期合并胎儿生长受限组及重度子痫前期合并胎儿生长受限组表达下降,其在轻度子痫前期合并胎儿生长受限组及重度子痫前期合并胎儿生长受限组表达水平下降较正常组明显(P<0.05)。
结论：
1、Netrin-1、VEGF等影响孕期血管新生。
2、Netrin-1、VEGF在重度子痫前期发病中起到重要作用。
3、与VEGF相比,Netrin-1较VEGF更显著地影响胎盘血管网络构建过程,参与子痫前期合并胎儿生长受限发病过程。
关键词: Neogenin ；Netrin-1 ；滋养细胞 ；生物学行为
被引量
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摘要： 乳腺癌是严重危害人类生命健康的常见恶性肿瘤之一,已位居女性肿瘤死亡首位,全球每年约有120余万妇女患乳腺癌,约50万妇女死于乳腺癌。其发病率和死亡率在世界范围内呈较快增长趋势,每年约以0.2～0.3%的速度递增,且发病年龄趋向年轻化；已经证实,年龄、疾病分期、肿瘤大小、淋巴结转移状况和肿瘤微血管密度等临床病理学因素与肿瘤预后密切相关,且早期远处转移和复发是肿瘤致死的主要原因。因此,迫切需要寻找一个敏感、能早期预测乳腺癌复发转移的分子生物学标志物及抑制其复发转移的基因治疗靶点,为临床对乳腺癌的复发和转移的早期预测提供一定的参考依据。 近年来,随着免疫学和分子生物学技术的飞速发展,对乳腺癌标志物其意义的研究也不断增加,从大分子蛋白质标志物到肿瘤基因标志物等达几十种之多,如c-er-B-2,ER, PR, uPA,VEGF, BRCA, muc-1,CD44, maspin, mdr1等,其中对c-erbB-2(HER-2)、ER、PR的研究尤为深入,在乳腺癌的预后评价和治疗中应用最多。但c-erbB-2、ER和PR作为乳腺癌特异性诊断及预测指标,其特异性及灵敏性均不够理想。有必要寻找更好的与预后相关的分子标志物,为临床了解乳腺癌生物学行为、指导治疗提供帮助。 近年来,Eph家族在肿瘤发生和发展过程中的作用受到越来越多的关注,从而为细胞信号传导在肿瘤中的作用机制的深入研究开辟了一个崭新的领域。Eph(erythropoitin producing hepatocellular carcinoma)受体家族是已知最大的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)家族亚家族,至今已有16个成员,Eph受体的配体Ephrin (Eph family receptor interacting proteins)已克隆有9个成员。Eph与其配体Ephrin是细胞排斥和粘附的关键调节因子,又是建立、维持及重塑细胞组织形态的基础。功能分析表明,该家族在包括神经网络形成、神经管和轴旁中胚层的成型(patterning)、细胞迁移和神经轴突导向、血管发生等方面具有重要的功能。Eph受体及其配体也与肿瘤发生有关,最近一些基因缺失及体内外血管形成实验表明,Eph和Ephrin基因在各种肿瘤中不同程度的表达与肿瘤的恶性进展有关,如：侵袭力增强,更易于发生转移,血管化程度更明显等,由此而导致患者预后差。 EphA2是Linsberg于1990年从人角化细胞cDNA文库中筛选得到的Eph亚家族成员,是该亚家族成员被发现的具有酪氨酸激酶活性的第一个基因,它在成人上皮细胞中低水平表达,存在于细胞一细胞粘附部位。已证实它在神经元发育、细胞侵袭、黏附调控等方面具有重要作用。与Eph家族其他成员相比,EphA2广泛高表达于不同的肿瘤组织和细胞系,如：乳腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌和食管癌等。许多证据表明,在肿瘤的血管形成、肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程中,EphA2发挥着重要作用。已经证实EphA2的高表达能诱导非转化乳腺上皮细胞在体内和体外的恶性转化并促进其侵袭转移。而应用EphA2蛋白的抗体靶向抑制试验,下调EphA2蛋白表达的同时,也抑制了肿瘤细胞的生长,进而降低肿瘤的恶性程度。 EphrinA1是该亚家族第一个被发现的配体,是从肿瘤坏死因子(TNF-a)诱导的人奇静脉内皮细胞中克隆产生。EphrinA 1配体的结合有利于EphA2受体的自身磷酸化。EphrinA1在肿瘤中表达模式的研究刚刚开始,EphA2及EphrinA1共表达于多种肿瘤组织且二者表达明显相关。活化的内生型EphA2与EphrinA1配体相结合,能抑制整合素调节细胞的粘附作用,从而降低细胞粘连,引起高度的组织侵袭性,同时发现EphrinA1配体的密度决定了EphA2介导的整合素调节的细胞粘附作用。这些结果提示EphA2及其配体EphrinA1参与了肿瘤的发生和发展。 新的研究报道EphA2的高表达与许多肿瘤的组织学分级、淋巴结转移及患者的预后有关,在肿瘤治疗方面有潜在的预后价值。但EphA2高表达与各种临床病理学特征的关系在不同类型的肿瘤中表现不一,肺癌组织中高水平的EphA2表达提示患者脑转移的风险增高,但前列腺癌组织却显示EphA2高表达与肿瘤转移无关。目前,国内少见有关EphA2和其配体EphrinA1在乳腺癌中的研究报道。 乳腺癌的发生、发展与人体内雌激素的增加、孕激素的减少密切相关,性激素的代谢素紊乱促进了某些乳腺癌的生长,但其确切发病机制目前尚不清楚。新近在对乳腺癌细胞中EphA2表达状况的研究中,越来越多的证据表明EphA2与ER之间存在相互影响。但是对于EphA2、EphrinA1及ERα、ERβ、PR在乳腺癌中的联合检测,国内外少见报道。 新辅助化疗是对非转移性肿瘤局部治疗之前进行的全身性、系统性细胞毒性药物治疗。目前新辅助化疗已成为局部晚期乳腺癌的标准治疗。国际上关于乳腺癌新辅助化疗的多中心随机临床实验结果显示：新辅助化疗与辅助化疗同样有效。对新辅助化疗敏感的乳腺癌比不敏感者预后好,特别是在局部进展期乳腺癌的应用中已取得良好的效果。新辅助化疗后许多病理学和生物学指标都发生了改变,很多基因表达均发生了改变。寻找出能够预测新辅助化疗疗效并帮助选择内分泌治疗、化疗方案、判断乳腺癌预后的肿瘤分子标记物已经成为目前研究的热点之一,对于EphA2及ER、PR在新辅助化疗前后乳腺癌中的表达的研究,国内外少见报道。 我们通过免疫组织化学技术联合检测了EphA2、EphrinA1及ERα、ERβ、PR的蛋白在乳腺癌中的表达及各自与临床病理学因素的关系；采用免疫组织化学技术检测EphA2和ER, PR在新辅助化疗前后的乳腺癌组织中的表达情况；用RT-PCR技术研究了EphA2及其配体EphrinA1各自的mRNA在乳腺癌中的表达及各自与临床病理学因素的关系；应用逆转录病毒载体介导的RNAi技术抑制EphA2在MCF-7细胞中的表达,以期寻找出能帮助选择有效治疗方案及预测乳腺癌预后的有效指标,并探讨EphA2在乳腺癌中的作用机制及预后价值,以期为乳腺癌的基因治疗提供新的思路。本研究分为四章： 第一章乳腺癌中EphA2,EphrinA1及ERa, ERβ, PR蛋白的表达及其意义 目的 研究EphA2,EphrinA1及ERa, ERP, PR等的蛋白在乳腺癌中的表达及其意义。 方法 1.用免疫组织化学SP法检测130例乳腺癌组织中EphA2, EphrinA1, ERa,ERβ及PR等各自蛋白的表达水平及其与临床病理因素的关系。 2.统计学处理：用spss 13.0 for windows统计软件包对所有资料进行统计学处理。采用卡方检验(chi-square),t(studert t)检验,方差分析(ANVOA),相关性检验等。显著性标准为P<0.05。 结果 1.EphA2,EphrinA1主要位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆中、少量位于炎性细胞的胞浆中,呈棕黄色或棕褐色；ERα、ERβ和PR主要位于细胞核,呈棕黄色或棕褐色,灶性、片状和散在分布,强表达时胞浆也着色。 2.130例乳腺癌组织中,EphA2蛋白阳性表达94例,阳性率72.31%；EphrinA1蛋白阳性表达77例,阳性率59.23%；ERα蛋白阳性表达82例,总阳性率63.08%；ERβ蛋白阳性表达69例,总阳性率53.08%；PR蛋白阳性表达76例,总阳性率58.46%。 3.EphA2蛋白在乳腺癌的阳性表达率与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小和病理类型均无显著相关(P>0.05)；而与临床分期、淋巴结转移和组织学分级显著相关(P<0.05)。临床分期较晚者、淋巴结转移组、组织学分级较高组EphA2蛋白的阳性率分别显著高于临床分期较早者、无淋巴结转移组、组织学分级较低组EphA2蛋白的阳性率。 4.EphrinA1蛋白的阳性表达率与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、病理类型和淋巴结转移无显著相关(P>0.05)；而与临床分期、组织学分级显著相关(P<0.05),临床分期较晚者和组织学分级较高组EphrinA1蛋白的阳性率分别显著高于临床分期较早者和组织学分级较低组EphrinA1蛋白的阳性率。 5.ERβ和Pβ蛋白的阳性表达率与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、病理类型、临床分期、淋巴结转移和组织学分级均无显著相关(P>0.05)。 6.ERβ蛋白的阳性表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、病理类型、临床分期和淋巴结转移均无显著相关((P>0.05),ERβ蛋白的阳性表达与组织学分级显著相关(P<0.05),组织学分级较低者ERβ蛋白的阳性率显著低于组织学分级较高者的阳性率。 7.EphA2和EphrinA1蛋白阳性染色共同定位于大致相同的肿瘤区域和血管内皮细胞,二者在乳腺癌组织中的分布基本一致。经统计学分析,二者在乳腺癌组织中的阳性表达显著相关(P<0.05)。 8.EphA2蛋白在乳腺癌中的阳性表达与PR蛋白在乳腺癌中的阳性表达无显著性相关(P>0.05)。EphA2蛋白在乳腺癌中表达的阳性率与ERα蛋白在乳腺癌中的阳性率显著相关(P<0.05),即EphA2蛋白表达的阳性率随着ERα蛋白阳性率的增高呈下降趋势,EphA2蛋白的阳性表达率在乳腺癌ERα蛋白阴性组显著高于ERα蛋白阳性组(P<0.05)。EphA2蛋白在乳腺癌中表达的阳性率与ERβ蛋白在乳腺癌中的阳性率呈显著性相关(P<0.05),即EphA2蛋白表达的阳性率随着ERβ阳性率的增高呈升高趋势。 结论 1.在乳腺癌组织中检测到EphA2、EphrinA1、ERα、ERβ和PR的蛋白的表达,提示他们可能与乳腺癌的发生发展有关。 2.EphA2蛋白在乳腺癌的表达与临床分期、淋巴结转移和组织学分级显著相关,EphrinA1蛋白在乳腺癌的表达与临床分期、组织学分级显著相关,ERβ蛋白在乳腺癌的表达与组织学分级相关,提示其潜在的预后价值并有可能成为乳腺癌预后评估的肿瘤标志物。EphA2蛋白高表达与乳腺癌淋巴结转移有关,提示其可能参与乳腺癌的转移机制。 3.EphA2和EphrinA1在乳腺癌中的蛋白表达分布的一致性提示在乳腺癌中,EphrinA1是EphA2受体的主要配体之一,二者可能在乳腺癌细胞信号传导过程中协调发挥作用。EphA2和EphrinA1共同定位于肿瘤细胞和乳腺癌的血管内皮细胞,提示二者可能协同参与了乳腺癌的血管生成,二者有望成为乳腺癌基因治疗的新靶向。 4.乳腺癌组织中有较高的ERα蛋白和ERβ蛋白阳性表达,提示乳腺癌是性激素依赖性肿瘤,可根据受体的含量指导临床进行内分泌治疗。 5.乳腺癌细胞EphA2与EphrinA1的表达显著相关,提示EphrinA1的表达受EphA2诱导,EphrinA1可以通过自分泌和／或旁分泌环作用于相应的EphA2受体促进癌细胞增殖及血管形成。 6.在乳腺癌中,EphA2蛋白的表达与ERα蛋白负相关,和ERβ蛋白正相关相关,提示ERα可能副性调控EphA2的表达,而ERβ可能正性调控EphA2的表达。 7.EphA2和EphrinA1的检测可作为乳腺癌预后的评估指标。 第二章EphA2、ER、PR在新辅助化疗前后乳腺癌中的表达及意义 目的 研究乳腺癌中ER、PR和EphA2的表达在新辅助化疗前后的变化及临床意义。 方法 采用免疫组化SP法检测ER、PR和EphA2在52例新辅助化疗前后的乳腺癌组织中的表达情况。 结果 ER、PR和EphA2的表达均与疗效相关；新辅助化疗后的乳腺癌组织中EphA2的阳性表达率显著下降(P<0.05);ER、PR的阳性表达率则无明显变化(P>0.05)。 结论 新辅助化疗能抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,显著降低EphA2的阳性表达,而对ER, PR的表达无显著影响。 第三章乳腺癌中EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA的表达及其意义 目的 研究EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA在乳腺癌中的表达及其意义。方法 1.选择40例乳腺癌冰冻标本,分别经免疫组化证实有不同级别的EphA2蛋白表达和EphrinA1蛋白表达,
关键词: EphA2 ；EphrinA1 ；ERα ；ERβ ；PR ；乳腺癌 ；免疫组织化学 ；新辅助化疗 ；RT-PCR ；逆转录病毒载体 ；RNA干扰 ；Western-blot ；MCF-7
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摘要： 脑、脊髓等CNS(central nerve system,中枢神经系统)损伤后可遗留严重的神经功能障碍,威胁人类健康,影响人们生活质量,并且目前尚无有效的治疗方法。研究表明,脑、脊髓损伤后神经传导束无法再生是导致神经功能难以恢复的重要因素之一。CNS损伤后局部环境中存在神经元轴突生长抑制物,包括Nogo-A、MAG(myelin-associated glycoprotein,髓磷脂相关糖蛋白)和星形细胞分泌的CSPG(Chondroitin sulphate proteoglycans,硫酸软骨素蛋白多糖)。这些抑制分子与轴突顶端的生长锥接触后,可与神经元细胞膜上的Nogo受体等结合后激活Rho随后活化Rho相关激酶(Rho-associated kinase,ROCK),导致神经元细胞骨架结构发生变化,继而引起生长锥塌陷、回缩,神经轴突停止生长。MicroRNA是一类内源性非编码RNA,能够识别其靶基因3’UTR区的互补位点并与之结合,通过转录后途径调控靶基因蛋白的表达,其在CNS发育过程中具有重要作用。最近,越来越多的研究发现miRNA在神经细胞轴突生长、分叉、导向和再生中也扮演重要角色,比如miR-34a可调控小鼠轴突生长和脊髓形态、功能,miR-124a与轴突分叉密切相关,而lin-4 mi RNA等则与神经轴突导向、靶细胞定位等相关。研究报道miR-133b在多种肿瘤组织中差异表达,包括前列腺癌、肺癌和消化道肿瘤。在中枢神经系统中,miR-133b在人类及小鼠的中脑组织中表达增高,并且能够通过调控靶基因Pitx3的表达在中脑多巴胺神经元的分化中起重要作用。另外Yu等人发现miR-133b与脊髓损伤后神经功能恢复有关,而且与卒中后功能恢复也密切相关,但是miR-133b在神经细胞中对于轴突生长的作用及相关机制尚未有研究,另外miR-133b是否与CNS损伤后轴突生长抑制分子对神经传导束再生的抑制作用相关亦无报道。目的:探讨miR-133b对神经细胞轴突生长的调控作用及其分子机制。方法:第一部分:制备miR-133b过表达和miR-133b inhibitor以及相应对照慢病毒,并通过gfp(greenfluorescentprotein,绿色荧光蛋白)表达量筛选最佳转染效率。首先分别转染mir-133b过表达和对照慢病毒,qrt-pcr方法检测两组细胞中mir-133b表达量,并进一步分析两组细胞轴突生长情况;其次通过mir-133binhibitor干扰细胞内mir-133b表达并观察其对轴突生长的影响;另外,利用tunel和mtt方法检测mir-133b对pc12细胞凋亡和增殖的影响;最后利用ngf(nervegrowthfactor,神经生长因子)进一步探究mir-133b是否与神经分化相关。第二部分:制备rhoa特异性sh-rna和rhoa过表达质粒及相应对照质粒。利用westernblot和qrt-pcr的方法检测过表达或抑制mir-133b对rhoa蛋白及mrna表达的影响及相互关系。通过sh-rna抑制细胞内rhoa蛋白表达,进一步研究rhoa蛋白对pc12细胞轴突生长的影响,最后通过补救实验验证mir-133b对促进pc12细胞轴突生长的作用机制是否呈rhoa依赖性。第三部分:利用westernblot方法检测mir-133b过表达是否能促进某些轴突生长相关通路的激活(如mapk和pi3k/akt等);接着干扰细胞内mir-133b观察这些通路可否被抑制,另外利用通路特异性抑制剂抑制关键分子磷酸化验证mir-133b对轴突生长的调控是否是通路依赖性;最后利用sh-rna等技术观察mir-133b靶基因的表达是否与这些通路的激活相关。第四部分:体外提取、培养、纯化大鼠原代神经元细胞,通过慢病毒调控神经元内mir-133b表达,观察其是否神经元神经轴突生长相关。另外利用cspg体外模拟cns损伤后对轴突生长的抑制作用,观察mir-133b能否减弱轴突生长抑制因子对神经轴突生长的抑制作用。结果:第一部分:在pc12细胞中,mir-133b调控其轴突的生长,过表达mir-133b促进轴突生长,相反,下调pc12细胞中mir-133b表达抑制轴突生长,但是mir-133b不影响pc12细胞的神经分化。第二部分:过表达mir-133b抑制pc12细胞中rhoa蛋白的表达,但是对mRNA没有影响。利用质粒介导的shRNA干扰PC12细胞内RhoA表达能够模拟miR-133b对轴突生长的促进作用,而共转染RhoA质粒和可消除miR-133b对PC12细胞轴突生长的促进作用。第三部分:miR-133b的过表达促进了ERK1/2和Akt丝氨酸473位点的磷酸化,但是对p38的磷酸化没有影响,而且加入PI3K抑制剂LY294002和MAPK激酶MEK1抑制剂PD098059可以分别消除miR-133b对轴突生长的促进作用。和过表达miR-133b类似,抑制RhoA蛋白的表达也促进了ERK1/2和Akt(Ser473)的磷酸化。第四部分:在大鼠原代皮层神经元中,过表达mi R-133b能够通过抑制RhoA蛋白的表达促进神经轴突的生长;神经轴突的生长在CSPG包被的培养皿中受到抑制,而miR-133b可以逆转其抑制作用促进轴突生长。结论:综上所述,本实验发现miR-133b可以促进神经轴突的生长,可能的机制是miR-133b抑制了神经细胞中RhoA蛋白的表达和RhoA/ROCK信号通路,并减弱了CSPG对神经轴突生长的抑制作用,同时激活了MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路,从而促进了神经轴突的生长。
关键词: miR-133b ；RhoA ；PC12细胞 ；神经元 ；轴突生长
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摘要： 第一部分Slit/Robo信号通路在卵巢肿瘤组织及卵巢癌细胞系中表达和意义的实验研究 研究背景： Slit/Robo家族最早在中枢神经系统中被发现。Slit蛋白是一类分泌性糖蛋白,脊椎动物中包括三个Slit成员(Slit1-3),它通过受体Roundabout(Robo)发挥其作为神经元迁移的排斥性因子和神经轴突导向的作用。哺乳动物的Slit蛋白结构由一个N-端信号肽,四个富含亮氨酸的重复序列(LRRs),九个EGF样重复序列和一个C-端的半胱氨酸结组成,LRRs是Slit与受体Robo结合必需的区域。Slit在蛋白水解过程中产生N-末端和C-末端两个片段,只有全长和N-末端Slit能与细胞膜受体Robo结合发挥作用。Robo属于免疫球蛋白超家族的跨膜信号分子,在脊椎动物中有四个成员Robo1-4。Robo1,2,3胞外区是由5个Ig样功能区和3个Ⅲ型纤维连接蛋白(Fibronectin)样结构域组成；Robo4结构与其他成员差异较大,胞外区只有两个Ig样功能区。 Slit/Robo在人类多种肿瘤中均发现有表达,关于其作用的报道则是不一致的。有研究表明,Slit/Robo可作为肿瘤抑制因子,例如在肺癌和乳腺癌中可检测到ROBO1基因纯合子缺失；Slit2可抑制乳腺及直肠肿瘤细胞的生长,在乳腺癌、肺癌、直肠癌、及脑癌等多种肿瘤中Slit/Robo启动子基因甲基化导致其失去活性；与正常组织或低度恶性肿瘤组织相比,Slit/Robo的表达在包括肺癌、乳腺癌、宫颈癌及前列腺癌等多种肿瘤中均有下降。与之相反的说法是,某些Slit/Robo成员在很多肿瘤中的表达明显增高。Wang等报道显示,中和阻断Robo1可缩小体内恶性黑色素瘤体积并降低肿瘤的微血管密度,表明Slit/Robo可通过促进血管的生成加剧癌症的发生及发展。因此,依据不同的肿瘤类型,Slit/Robo发挥促进或者抑制肿瘤发展的作用。 Slit/Robo在多种肿瘤中的表达和作用已被探讨,且证实SLIT1、SLIT2、SLIT3、ROBO1基因在一系列上皮性恶性肿瘤中均作为候选肿瘤抑制基因。在卵巢恶性肿瘤中,约90%为上皮性卵巢癌,但是Slit/Robo家族在卵巢肿瘤中的表达及功能却未有报道,鉴于此,我们首次应用卵巢肿瘤组织芯片对Slit/Robo家族主要成员(Slit2/3及Robo1/4)在正常卵巢组织及不同组织学类型的卵巢肿瘤组织中的表达情况进行检测,并利用增殖和迁移实验探讨Slit/Robo信号通路是否对卵巢癌细胞OVCAR-3和SKOV-3增殖侵袭能力产生影响。 研究目的： 1.检测Slit/Robo信号通路的主要成员在正常卵巢组织和不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤组织及卵巢癌细胞系中的表达； 2.探讨Slit2对卵巢癌细胞OVCAR-3和SKOV-3增殖、迁移能力的影响； 3.研究Slit2对卵巢癌细胞OVCAR-3和SKOV-3细胞内ERK1/2和AKT1磷酸激酶的影响。 研究方法： 1.免疫组织化学方法：检测在正常卵巢组织和不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤中Slit2/3和Robo1/4的表达,分别以山羊和兔IgG代替—抗作为阴性对照；采用半定量法判定结果,使用ImageJ和Meta Morph图像分析软件测得图片OD值；SigmaStat统计软件分析不同组织学类型肿瘤组织之间数值的统计学差异； 2. Western Blot分析法：检测在人卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞中Slit2/3和Robo1/4蛋白的表达；以GAPDH和(3-actin作为内参照物； 3.24孔-Transwell系统：检测Slit2处理后卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞的侵袭能力； 4.结晶紫实验：检测Slit2处理后卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞的增殖能力； 5.细胞划痕试验：检测Slit2处理后卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞的增殖迁移能力； 6. Western Blot分析法：检测Slit2处理后卵巢癌细胞内ERK1/2和AKT1的磷酸化水平。 结果： 1. Slit2/3和Robo1/4在正常卵巢组织和卵巢肿瘤组织中的表达：8例正常卵巢组织和8例癌旁正常组织合为一组称正常对照组,共16例,各不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤组织称为研究组,共192例。在对照组中可检测到Slit2、Slit3和Robo1呈不同程度的阳性表达,主要分布在卵巢基质细胞；在研究组中Slit2/3和Robo1/4可见不同程度的阳性表达；阴性对照组均未见有着色。 1) Slit2:在正常对照组、高低级别浆液性囊腺癌、卵黄囊瘤、颗粒细胞瘤和无性细胞瘤中可见阳性着色(OD＞2000±680),阳性率分别为75%(12/16),69%(79/115),100%(21/21),100%(6/6),75%(3/4)和80%(4/5)。正常对照组中OD=1971±681,在低级别浆液性囊腺癌中OD=6048±2216,卵黄囊瘤OD=4797±1369,统计分析结果显示OD值增高较正常对照组有统计学意义(p≤0.05)； 2)Slit3：无性细胞瘤OD=17562±4463,阳性率为100%(5/5)；卵黄囊瘤OD=16627±6986,阳性率为100%(6/6)。正常对照组OD=1248±789,统计分析结果显示在无性细胞瘤和卵黄囊瘤中OD值增高较对照组相比差异有统计学意义(p≤0.05)； 3) Robol:在对照组和研究组均有较强阳性着色(OD＞9640±640),阳性率均为100%。低级别浆液性囊腺癌OD=33025±3513,高级别浆液性囊腺癌OD=23268±1744,粘液性囊腺癌OD=15336±2213,无性细胞瘤OD=32667±9646,卵黄囊瘤OD=40824±4033,与正常对照组OD=9640±640相比,OD值明显增高,差异有统计学意义(p≤0.05)； 4) Robo4:无性细胞瘤OD=7100±6200,阳性率为80%(4/5)；卵黄囊瘤OD=1570±6980,阳性率为100%(6/6)。与正常对照组OD=452±301相比,OD值明显增高,差异有统计学意义(p≤0.05)。 2. Slit2/3和Robo1/4蛋白在人卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞中的表达：Slit2抗体在～50KDa左右检测到蛋白条带,该位置对应于Slit2 C-末端,与阳性对照(human hepatoblastoma cells)一致；Slit3抗体在～45和～65KDa左右检测到蛋白条带,对应于Slit3 C-末端,与阳性对照(mouse thyroid extract)结果一致；均未检测到全长Slit2/3(-200KDa)和N-末端(～140KDa)。Robo1/4抗体分别在～250KDa和～170KDa左右检测到蛋白条带,对应于全长Robo1/4。 3.人重组Slit2蛋白对卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞增殖侵袭能力的影响：5,10,100 ng/ml Slit2蛋白作用4d后,与对照组(增殖率为100%)相比,OVCAR-3细胞的增殖率分别为111%,113%,113%；SKOV-3细胞增殖率分别为109%,103%,97%；与对照组相比差异均无统计学意义(p>0.05)。100 ng/ml Slit2蛋白处理OVCAR-3和SKOV-3细胞16h后,SKOV-3细胞迁移数目为985±77,对照组为1020±84,两组相比细胞迁移数目差异无统计学意义(p>0.05);OVCAR-3细胞无迁移。 4.人重组Slit2蛋白对卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞内ERK1/2和AKT1磷酸激酶的影响：Slit2蛋白处理细胞0,10m,30m, 1h,3h后,与对照组(设为1)相比,OVCAR-3细胞内ERK1/2磷酸化水平分别为1.0±0.0,2.44±0.9,1.5±0.7,1.3±0.3,1.8±0.7;AKT1磷酸化水平分别为1.0±0.0,3.44±2.1,3.3±±1.8,2.7±0.8,2.9±1.3；SKOV-3细胞内ERK1/2磷酸化水平分别为1.0±0.0,1.2±0.3,2.1±0.7,2.2±1.0,1.3±0.4；AKT1磷酸化水平分别为1.0±0.0,1.1±0.4,1.8±0.9,1.0±0.2,1.0±0.3。统计分析结果显示两组相比差异无统计学意义(p＞0.05)。 结论： 1. Slit/Robo信号通路中主要成员Slit2/3和Robo1/4在卵巢癌组织中的阳性表达显著高于正常卵巢组织中的表达水平； 2.人重组Slit2蛋白对卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞生长增殖、侵袭迁移能力无明显促进作用； 3.人重组Slit2蛋白未激活卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞内ERK1/2和AKT1磷酸激酶。 第二部分芳香烃受体(AhR)在卵巢肿瘤组织中表达及对卵巢癌细胞系增殖迁移能力影响的实验研究 研究背景： 芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AhR)是一类配体激活转录因子,它在细胞外信号激活下,通过DNA结合调控相应的基因表达,可介导多环芳烃类化合物的毒性反应(包括致癌性),还参与一些重要的生物学过程,如信号转导、细胞分化、细胞凋亡等。未与配体结合的情况下大部分AhR位于细胞胞浆内,配体结合后,通过芳香烃受体核转因子(ARNT), AhR被转运到细胞核。细胞核内的AhR与DNA上的AhR增强子序列反应元件(DRE)结合,可激活包括细胞色素酶如CYP1A1, CYP1A2和CYP1B1等下游基因的表达。CYP1A1, CYP1A2和CYP1B1是三种被广泛研究的外源性物质代谢酶,其功能主要是降解外源性有毒物质。同时AhR还会激活p53和p21等基因,从而影响细胞周期调控,以及细胞生长。 已有研究表明2—(1'H-吲哚-3'-羰基)噻唑-4-羧酸甲酯[2-(1'H-indole-3'-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester, ITE]是内源性的AhR配体,最早是从猪的肺组织中提取的。ITE可结合AhR,激活含DRE的DNA序列的报告基因,其生物效价是BNF(人工合成AhR配体)的5倍。此外,在小鼠肝癌细胞中,ITE的活性可达到TCDD的5-6倍。由于ITE是自然代谢产物无毒性作用,并能高效结合AhR,因此可作为一种潜在的抗癌药物。虽然AhR在人类卵巢癌发生发展过程中的功能仍然不清楚,但AhR在人类卵巢癌中有高表达并且其配体TCDD可以刺激卵巢癌细胞系CAOV-3的增殖等现象均表明AhR在卵巢癌进展过程中发挥一定的作用。因此,本实验我们对AhR及其配体ITE在卵巢癌发生发展机制中的作用进行探讨。 研究目的： 1.检测AhR在正常卵巢组织及不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤组织中的表达,并探讨其临床意义； 2.探讨ITE对人卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞增殖和迁移能力的影响。 研究方法： 1.组织芯片免疫组织化学方法：检测在正常卵巢组织和不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤中AhR的表达。采用半定量法判定结果,使用Image J和Meta Morph图像分析软件测得图片OD值；Sigma Stat统计软件分析不同组织学肿瘤组织之间数值的统计学差异； 2.结晶紫实验：检测ITE处理后OVCAR-3和SKOV-3细胞的生长增殖能力； 3.24孔-transwell系统：检测ITE处理后OVCAR-3和SKOV-3细胞的迁移能力。 结果： 1.AhR在正常卵巢组织和卵巢肿瘤组织中的表达：8例正常卵巢组织和8例癌旁正常组织合为一组称正常对照组,共16例,各不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤组织称为研究组,共192例。正常对照组AhR表达阴性；在192例不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤组织中AhR有阳性表达,主要分布在上皮细胞包浆内；阴性对照组均未见有阳性着色。浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、卵黄囊瘤、恶性畸胎瘤中可见较强阳性着色(OD≥5476±1864),
关键词: 卵巢癌 ；Slit/Robo ；增殖 ；迁移 ；ERK1/2 ；AKT1 ；卵巢癌 ；AhR ；ITE
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