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1. 认领

【学位/硕士】 • 李文浩 • 延边大学 • 导师：闵俊哲 • 2018年

摘要：目的:本文采用UPLC-FL(荧光),开发人体唾液中N-acetyl-D-leucine(N-Ac-D-Leu)和N-acetyl-L-leucine(N-Ac-L-Leu)的光学异构体检测新方法。并将其方法应用于健康人和糖尿病患者唾液中N-Ac-D-Leu和N-Ac-L-Leu光学异构体的含量测定,分析健康人和糖尿病患者唾液中Ac-D,L-Leu定量值与D/L的变化,考察糖尿病诊断中的有效性。方法:以 N-acetyl-L-norleucine(Ac-L-Nle,IS)为内标物,将 N-Ac-D-Leu 和 N-Ac-L-Leu 与荧光衍生化学试剂(R)-(-)-4-(N,N-dimethylaminosulfonyl)-7-(3-aminopyrrolidin-l-yl)-2,1,3-benzoxadiazole[(R)-(-)-DBD-APy]进行衍生化反应。使用反相色谱柱进行分离,利用UPLC-FL(荧光)进行衍生化产物的检测,对手性拆分分析条件进行优化,最终筛选出最佳分离条件、检测灵敏度以及线性关系。将优化后的分析条件应用于健康人和糖尿病患者唾液中,进行Ac-D,L-Leu定量分析及D/L的比较。结果:UPLC-FL优化条件为流动相A:0.1%甲酸水溶液;流动相B:0.1%甲酸-甲醇和乙腈(40:60)混合溶液,以B=35%溶液等度洗脱15 min,Ac-D-Leu和Ac-L-Leu分离度为1.93,达到了完全分离。并且Ac-D-Leu和Ac-L-Leu在10-300μM范围内线性关系良好(R2≥0.9999),检测灵敏度分别为0.004pmol和0.01 pmol。Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的平均回收率分别为104.68%和102.48%;日内、日间精密度范围分别为3.36-5.96%和3.32-7.39%。使用本方法检测了 39名健康人唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的含量,结果显示健康女性唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu 的平均含量分别为 21.07±14.98pmol/mL 和 21.96±19.41 pmol/mL;而在健康男性中的平均含量分别为54.95±51.73 pmol/mL和34.81±52.37 pmol/mL。检测16名糖尿病患者唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的含量,结果显示女性糖尿病患者的Ac-D-Leu和Ac-L-Leu平均含量分别为12.32±9.04 pmol/mL和10.82±4.19pmol/mL;而在男性糖尿病患者中的平均含量分别为25.62±20.20和10.55±6.91 pmol/mL。健康人唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的平均含量分别是29.99±32.30pmol/mL 和 25.35±31.22 pmol/mL,均高于糖尿病患者(分别为 19.48±16.41 pmol/mL和10.68±5.52pmol/mL);健康人唾液中Ac-D-Lue的平均含量约为糖尿病患者的1.54倍,健康人唾液中Ac-L-Lue的平均含量约为糖尿病患者的2.37倍。根据Ac-D-Leu和Ac-L-Leu含量计算D/L比值,发现男性D/L平均值高于女性,并且健康人D/L平均值高于糖尿病患者。结论:通过对手性拆分分析条件的优化,可有效分离Ac-D-Leu和Ac-L-Leu。本方法对健康人唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu含量的检测,证实优化后的分析方法灵敏度高且重现性好。男性唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的平均含量均高于女性,健康人唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的平均含量均高于糖尿病患者,并且本方法可用简便的D/L比值反映Ac-D-Lue和Ac-L-Lue的定量结果。

摘要译文

关键词: 糖尿病 ；唾液；Ac-D,L-Leu ；(R)-(-)-DBD-APy ；UPLC-FL

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2. 认领

【学位/硕士】 • 杨苗 • 华东师范大学 • 导师：朱安伟 • 2020年

摘要：众所周知,人体中诸多生理和病理过程都有糖类的参与,在所有糖类中,对葡萄糖的量化是全世界研究者们最感兴趣的课题之一。本世纪最大的健康威胁——糖尿病也是由于葡萄糖代谢失调,血液中葡萄糖浓度不断积累而形成。对于糖尿病患者而言,规律检测血糖已成为日常。但手指反复穿刺给患者带来的痛苦和压力给予研究者们更大的动力去探寻无创监测技术。唾液葡萄糖因为与血糖浓度存在一定的关系,所以测量唾液中的葡萄糖进行检测是可取的。然而,它们在唾液中相对较低的浓度和共存的化学物质对检测的灵敏性和选择性都提出了挑战。本文主要分为两个部分,在第一部分中,主要合成苯硼酸功能化单体,将苯硼酸功能化单体与NIPAAm共聚,合成具有刺激响应的聚合物聚(3-(丙烯酰胺硫脲)苯基硼酸-co-N-异丙基丙烯酰胺),并对其进行表征。在第二部分中,利用Au-S相互作用,将共聚物修饰在镀金的玻璃纳米孔内壁,合理设计并构建了一种具有良好分析性能的唾液葡萄糖传感器。这项研究搭建了唾液中葡萄糖检测的新平台,并有望为检测生物液体中的其他分子提供一种新的策略。具体来说,本论文包括以下三个方面的工作。第一章绪论本章首先介绍了纳米孔,根据所使用的材料的不同,对纳米孔进行分类阐述,分为生物纳米孔和人工固态纳米孔。并着重阐述了人工固态纳米孔中的玻璃纳米孔的制备、改性及应用。我们还总结了刺激响应聚合物的设计思路和作用原理,以及刺激响应聚合物依托人工固态纳米孔所制造的新型传感器的有关应用。另外,还介绍了葡萄糖浓度检测方法,重点介绍了基于硼酸的电化学检测方法。最后阐明了本论文的研究思路、意义与主要内容。第二章苯硼酸功能化聚合物的合成与表征遵循刺激响应聚合物的设计思路和原则,我们首先合成了具有糖类响应的单体分子3-丙烯酰胺基硫脲基苯硼酸。然后设计合成了以苯硼酸为识别单元,N-异丙基丙烯酰胺为功能单元,硫脲为介导单元的三单元刺激响应聚合物。为了验证成功合成了相关单体和聚合物,对其进行核磁共振氢谱、红外、XPS表征。第三章基于苯硼酸共聚物修饰的玻璃锥形纳米孔对唾液中葡萄糖的检测在这一部分,我们将刺激响应聚合物修饰在玻璃锥形纳米孔内表面进行改性,建立了一种高选择性、高灵敏性检测唾液中葡萄糖的电化学检测方法。将刺激响应聚合物利用Au-S作用,修饰在镀金的玻璃纳米孔的内壁。此聚合物膜的成功修饰可以通过XPS,AFM,I-V曲线来证明。葡萄糖诱导的反应性共聚物中硼酸官能团的pKa移动及其润湿性变化提高了玻璃纳米孔的检测灵敏度。此外,利用多价硼酸-葡萄糖相互作用和硫脲单元的协同作用,也可以实现唾液环境中对葡萄糖的良好选择性。本章工作不仅为提供唾液中的葡萄糖检测提供了一种新的方法,而且为电化学分析中纳米孔内表面化学的合理设计提供了新的思路。

摘要译文

关键词: 玻璃锥形纳米孔；葡萄糖浓度检测；生物传感；电化学；刺激响应聚合物

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3. 认领

【学位/硕士】 • 王婧 • 延边大学 • 导师：闵俊哲 • 2021年

摘要： 糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍导致的以高血糖为特征的代谢性疾病。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身组织器官,尤其对眼和肾的损害较大,导致其功能障碍并衰竭。糖化终产物中间体乙二醛（Glyoxal,GO）、甲基乙二醛（Methylglyoxal,MGO）和3-脱氧葡萄糖苷（3-Deoxyglucosone,3-DG）的含量与糖尿病及其并发症密切相关。迄今为止,因糖化中间体GO,MGO和3-DG稳定性较差,在已报道的分析方法中,柱前衍生化法是目前在不同样品中量化糖化中间体的最有效的方法。因衍生化后不仅可以增加糖化中间体的稳定性,而且可以提高疏水性,可在廉价的反相色谱柱中提高保留时间和灵敏度。另外、人体唾液作为不同于血液、尿液的非侵袭性生物样品,具有采集方便、感染性低、前处理简便、易于大众接受等特点。鉴于此,我们开发了一种基于柱前衍生化同时检测人体唾液中3种糖化中间体的UHPLC-MS/MS新方法并应用于健康人及糖尿病患者的唾液中。以4,5-Dimethyl-1,2-phenylenediamine（DMPD）作为衍生化试剂,以2,3戊二酮（PTD）为内标,DMPD与GO,MGO和3-DG在60℃下反应2 h。以BEH C18（50 mm×2.1 mm,1.7μm）为色谱柱,流动相A为0.1%甲酸水溶液,B为0.1%甲酸乙腈溶液,在梯度为B%=10-65%（0-6 min）下对3种糖化中间体标准品进行了分析,并应用于健康人和糖尿病患者唾液中糖化中间体含量的比较。结果表明,在6 min内3种糖化中间体衍生化产物达到良好的分离。在0.1-62.5 pmol范围内线性关系良好（R2>0.9992）;检测限LOD（S/N=3）为0.80-2.67 fmol,定量限LOQ（S/N=10）为2.0-16.67 fmol;日内、日间精密度为4.28-11.32%;健康人唾液中的添加回收率为90.00-108.85%。在健康人及糖尿病患者唾液中均检测到GO,MGO和3-DG 3种糖化中间体,糖尿病患者组唾液中GO,MGO和3-DG含量均高于健康志愿者,且具有显著性差异（p<0.01）。本研究建立了一种基于DMPD柱前衍生化同时检测人唾液中3种糖化中间体的UHPLC-MS/MS新方法。本方法具有灵敏度高、分析时间短、准确度高等特点,为非侵袭性人体唾液中糖化中间体及羰基代谢物的检测及糖尿病预警筛查提供了一种新的分析策略。

摘要译文

关键词: 糖化中间体；唾液；DMPD ；柱前衍生化；LC-MS/MS

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4. 认领

【学位/硕士】 • 危新俊 • 温州医科大学 • 导师：颜景斌 • 2016年

摘要：目的：　　1.建立快速筛查快速、准确、无创、低成本的线粒体糖尿病MT3243A＞G位点突变的筛查方法;2.分析线粒体糖尿病患者外周血中MT3243A＞G突变对线粒体基因及线粒体功能的影响;3.分析唐氏综合征(DS)患者外周血单个核细胞中线粒体基因及核编码的线粒体基因的表达变化。　　方法：　　1.1以采集自上海市儿童医院和上海市第六人民医院已确诊的6例线粒体糖尿病患者及50例正常对照为研究对象，采用焦磷酸测序方法检测并比较不同来源样本（血液、唾液及尿沉渣）中MT3243A＞G突变位点的杂合度水平。　　1.2建立两步法MT3243A＞G突变位点快速筛查体系:应用高分辨率熔解曲线（high resolution melting curve analysis，HRM）技术对来自上海市4个社区的1070例糖尿病患者尿沉渣样本中的MT3243A＞G突变位点进行快速筛查，阳性样本进一步采用焦磷酸测序技术进行验证，并定量检测突变位点的杂合度水平。　　2.研究线粒体糖尿病患儿线粒体功能的改变:采用qRT-PCR检测来自于上海市第六人民医院的4例线粒体糖尿病患者以及7例年龄配对的正常对照样本中线粒体基因表达;同时检测这些样本外周血单个核细胞中线粒体功能的改变情况（ATP含量、ROS含量及膜电位变化）。　　3.研究唐氏综合征患儿线粒体功能的改变:采用qRT-PCR检测8例唐氏综合征患儿及6例正常对照外周血样本中线粒体DNA拷贝数及线粒体基因的表达;采用基因芯片技术检测2例DS双胞胎患者及2例正常对照外周血线粒体基因及能量代谢通路和氧化磷酸化通路中线粒体相关基因的表达;采用PCR-Array技术检测3例DS患者及3例正常对照外周血单个核细胞中的线粒体相关基因的表达。　　结果：　　1.建立了基于HRM和焦磷酸测序技术的线粒体糖尿病MT3243A＞G位点突变两步法快速筛查方法。　　1.1对比实验发现，6例线粒体糖尿病患者尿沉渣中MT3243A＞G突变位点的杂合度均高于唾液和血液2-7倍，唾液中突变杂合度略高于血液;50例正常对照的血液、唾液及尿沉渣样本中均未检出MT3243A＞G位点突变。　　1.2在1070例糖尿病尿沉渣样本的筛查实验中，应用HRM筛查出2例疑似MT3243A＞G位点突变的样本，经焦磷酸测序验证后确认为MT3243A＞G位点突变，两个患者尿沉渣样本中MT3243A＞G位点杂合度分别为33.32％和14.67％。　　2.经qRT-PCR检测4例线粒体糖尿病患者以及7例正常对照样本外周血单个核细胞中13个线粒体基因的表达后发现，患者组的13个线粒体基因中ND3、ATP6、ATP8、COⅪ、COⅫ、COⅩⅢ基因的表达水平略高于正常对照组，其他基因表达略低于正常对照组，但均无统计学差异(P＞0.05);线粒体糖尿病患者外周血单个核细胞中空腹和餐后120min时平均ATP含量低于正常对照组(1.83E+04vs2.67E+04;1.32E+04 vs2.09E+04)，且差异显著(P＜0.05);线粒体糖尿病患者外周血单个核细胞中空腹和餐后120min时平均ROS含量高于正常对照组(0.114vs0.077，0.113 vs0.075)，且差异极显著(P＜0.01);与正常对照组相比，线粒体糖尿病患者外周血单个核细胞中膜电位受到一定的损伤。　　3.采用RT-PCR检测8例DS及6例正常对照的外周血样本发现DS患者中mtDNA拷贝数明显高于正常对照组，且差异显著(P＜0.05);在两组13个线粒体基因表达的比较中，DS患者中COⅪ、COⅩⅢ、ATPase6的表达略低于正常对照组，其他基因表达略高于对照组，但均无统计学差异(P＞0.05);基因芯片检测分析，DS中13个线粒体基因的表达无显著变化，能量代谢通路中涉及的84个线粒体相关基因中只有TOMM40基因表达下调。氧化磷酸化复合物中的84个线粒体相关基因中ATP5J和ATP50表达上调;经PCR-Array技术检测的3例DS患者与3例正常对照相比，外周血单个核细胞中84个线粒体相关基因中共有49个基因表达下调。　　结论：　　1.尿沉渣样本取材方便、无创、突变杂合度高，可以作为人群中MT3243A＞G位点突变筛查的首选样本;HRM技术使用成本低，可以实现点突变的快速筛查，焦磷酸测序技术检测灵敏度高、定量精确。我们将两者的优势相结合，建立了两步法快速筛查检测线粒体糖尿病MT3243A＞G位点突变的新方法。　　2.线粒体糖尿病MT3243A＞G突变对患者体内ATP水平、ROS及线粒体膜电位有一定的影响。　　3.唐氏综合征患者外周血单个核细胞中线粒体基因的表达未受影响，但是部分线粒体相关基因表达受影响。

摘要译文

关键词: 线粒体糖尿病 ；外周血细胞；线粒体基因；功能损伤；位点突变；疾病筛查

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5. 认领

【学位/硕士】 • 易小娟 • 重庆医科大学 • 导师：袁拥华 • 2023年

摘要： 糖尿病是由多病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病群。糖尿病通常伴随着多样的并发症，糖尿病易累及微血管及大血管病变，导致肾、眼、神经系统、心血管系统等的并发症，这是糖尿病患者致死致残的主要原因。糖尿病的早期诊断和持续监测对于糖尿病患者生活质量的提高以及致残率的降低具有极大的临床意义。临床常用的糖尿病疾病诊断几乎都是基于生化分析仪进行血糖以及相关疾病标志物的检测，这需要专业的操作人员和设备，因此使用受到限制。有效的血糖管理在糖尿病患者的病情控制中起到了非常大的作用，因此本研究设计了并构建了比色传感器和适体传感器，将其用于糖尿病患者疾病标志物的检测。具体研究内容如下：　　第一部分基于功能化乙炔黑构建的纸基传感器联合智能手机进行血糖检测研究　　目的：建立基于纳米酶功能化的纸基比色传感器用于血糖的检测。方法：首先，利用氯高铁血红素(hemin)对乙炔黑(AB)进行功能化，制备出活性优异的纳米酶。得到的具有良好类过氧化物酶活性的纳米酶被用于修饰滤纸。AB的串珠样结构为hemin提供了极大的附着位点，同时二者的协同作用使得复合物的类酶活性和分散性都极大程度的提高了。纳米酶的良好分散性使得修饰后的纸基仍然呈现出白色背景，因此放大了比色信号。同时便携式的纸基可以用于即时传感(POCT)，能够联合智能手机进行比色信号读取。结果：该便携式纸基传感器结果显示在0.2mM~30mM之间呈良好的线性关系，R值为0.9937;检测限为0.06mM;平均回收率为95.7%~112%;RSD为0.860%~3.20%。结论：构建的纸基比色传感器在检测血糖的应用中具有良好的重现性、特异性和稳定性，这为糖尿病的早期诊断和后续血糖监控提供了一种新方法。　　第二部分基于ZrMOF负载的金属氧化物掺杂聚苯胺的导电纳米酶用于糖化白蛋白的检测分析研究　　目的：建立基于导电纳米酶的三明治夹心型电化学适体传感器用于糖化白蛋白的检测。方法：首先，通过将氯铂酸原位还原在N-CNTs表面制备N-CNTs@Pt作为传感平台的基底材料。该基底材料的管状多层结构为捕获探针(Ap1)提供了丰富的结合位点，同时提供了增强的导电性，利于电子传递。其次，以金属锆有机框架(Zr-MOF)作为载体，搭载四氧化三钴掺杂的聚苯胺(PANi@Co3O4)，通过羧基-氨基共价结合的方式固定适配体2(Ap2)形成信号探针。该纳米复合物具有大的比表面积供Ap2结合，同时导电的ZrMOF@PANi@Co3O4具有氧化酶活性，能够催化TMB为氧化态TMB，表现出特征性的DPV信号峰。三明治杂交反应后，信号探针被固定在传感平台上，能够催化表征液里面的TMB产生信号峰。DPV用于记录与不同浓度糖化白蛋白(GA)结合前后的信号变化。结果：基于多重信号放大策略构建的免疫传感器在1pM~100nM之间呈现良好的线性关系，R值为0.9975;检测限为0.507pM;平均回收率为87.82%~102.3%;RSD为1.26%~2.00%。结论：制备的电化学适体传感器具有良好的特异性和稳定性，且在临床唾液样本检测中获得了可接受的结果。

摘要译文

关键词: 糖尿病 ；纳米材料；传感器；疾病标志物；临床诊断

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6. 认领

【学位/博士】 • 朱超 • 华东理工大学 • 导师：罗国安 • 2011年

摘要：为了实现生物体内所有代谢物的定性定量分析,代谢组学正沿着“整合化”方向不断发展。对具有不同理化性质的各类化合物的分析检测要求不同的技术平台。因此,针对不同类别化合物分别建立定性定量方法,然后整合分析所得数据,是实现全面检测生物体内代谢物的一种有效手段。稳定可靠的检测方法是代谢组学研究的关键前提。磷脂是细胞膜的重要组成部分,具有非常重要的生理功能,与人类健康和多种疾病的发生发展有着密切关系。有必要针对磷脂化合物建立一种高效的分析检测平台,对磷脂及其代谢与疾病的关系进行深入研究。本文采用液相色谱质谱联用技术(LC-MS),结合质谱数据的多元统计分析(MVA),建立了磷脂组学平台,并实现了平台的改进及应用。 1.基于正相色谱飞行时间质谱(NPLC-TOF/MS)和离子阱质谱(Ion trap/MS)技术,初步建立了磷脂组学平台并将其应用于糖尿病与糖尿病肾病的研究中。采用二醇基色谱柱和正己烷/异丙醇/水流动相等度洗脱,在45 min内实现了7大类磷脂65种化合物的同时定性定量分析。利用该平台,我们研究了中药方剂“糖肾方”对自发性Ⅱ型糖尿病鼠磷脂代谢的影响,发现糖肾方能够调节糖尿病鼠磷脂代谢,并筛选出8种磷脂化合物作为糖尿病相关的潜在生物标志物。通过对糖尿病患者和糖尿病肾病患者的磷脂组学研究,偏最小二乘显著性分析(PLS-DA)聚类结果显示糖尿病、糖肾病患者和健康人之间存在磷脂代谢差异。通过PLS-DA和方差分析(ANOVA)筛查出3种糖尿病专属标志物,8种糖肾病专属标志物,另外还发现了2种新的磷脂标志物,可以用来区分糖尿病患者、糖肾患者和正常人。最后,利用外标法确定了此两种生物标志物在各类群体中的血浆浓度范围。 2.针对初步建立的磷脂组学平台所存在的缺陷,如：样本用量高、分析时间长、保留时间飘移、无内标校正定量等,利用亲水作用色谱离子阱傅立叶转换质谱联用技术(HILIC-Ion trap-FT/MS)对原有磷脂组学平台进行了改进。首次建立了基于亲水作用色谱质谱联用技术的磷脂分离检测新方法。采用异丙醇法提取血浆中的磷脂,大大简化了样本前处理,只需10μL的血浆样本用量。采用二醇基色谱柱和乙腈/水流动相梯度洗脱,在15 min内可分离鉴定9类磷脂中的186种化合物,大大提高了检测通量和检测范围。利用此方法成功分离了不同生物样本的磷脂提取物。该方法通过了规范化的代谢组学方法学验证,证明其能够应用于血浆和肝脏组织的磷脂定性定量检测。改进后的磷脂组学平台具有简便性、高效性、稳定性和规范性等特点。 3.将改进后的磷脂组学平台应用于中枢神经系统(CNS)障碍引起的磷脂代谢紊乱的研究。通过对实验性自身免疫性脑炎(EAE)大鼠模型的研究,发现了血浆磷脂代谢紊乱与多发性硬化症密切相关,并找出多发性硬化症早期的生物标志物。整合分析血浆磷脂组学数据和脑脊液代谢组学数据,发现了大鼠血浆磷脂和脑脊液所反映的代谢状况存在一定程度上的一致性。这一研究为神经中枢系统障碍的血浆代谢组学研究提供了可参考依据。本研究为代谢组学的整合化发展提供了一个简便快捷、稳定可靠、高通量的分支平台一磷脂组学平台。

摘要译文

关键词: 磷脂组学；HILIC-Ion trap-FT/MS ；分离；定性；定量；生物标志物

引用

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