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摘要： 目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-comD、E.coliBL21DE3pET42a-comE和E.coli BL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶8。ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。
关键词: 链球菌,肺炎/遗传学 ；聚合酶链反应 ；信号传导 ；β内酰胺酶类 ；抗药性,细菌 ；基因表达 ；重组蛋白质类 ；基因表达调控,细菌
被引量
7
摘要： 目的 构建肺炎链球菌comD基因敲除突变株,了解comD基因与细菌β-内酰类抗生素耐药性的相关性,探讨氯氰碘柳胺下调comD、comE和comC基因mRNA的作用.方法 构建用于comD基因敲除的自杀质粒pEVP3comD,通过同源重组及插入失活获得肺炎链球菌ATCC6306株comD基因敲除突变株comD-.采用PCR及免疫荧光法对comD-突变株进行鉴定.采用实时荧光定量RT-PCR检测氯氰碘柳胺处理前后comD-突变株及野生株comD、comE和comC基因mRNA水平变化.采用二倍琼脂稀释法测定comD-突变株及野生株对青霉素G和头孢噻肟的敏感性.结果 测序及免疫荧光试验结果证实,所构建的comD-突变株染色体DNA中comD基因被插入失活.50μmol/L或100 μmol/L的氯氰碘柳胺能明显下调comD、comE和comC基因mRNA水平（P＜0.05）,25μmol/L的氯氰碘柳胺则否.comD-突变株对青霉素及头孢噻肟最低抑菌浓度（MIC）值均为32μg/ml,明显高于野生株的0.06 μg/ml和1 μg/ml.结论 本研究成功地构建了肺炎链球菌comD基因敲除突变株.comD基因与细菌对β-内酰类抗生素耐药性密切相关.氯氰碘柳胺可通过下调comD、comE和comC基因的转录水平,从而对细菌感受态形成产生影响.
关键词: 肺炎链球菌 ；ComD/ComE二元信号传导系统 ；β-内酰胺类抗生素 ；耐药性 ；氯氰碘柳胺 ；表达调控
被引量
3
摘要： 肺炎链球菌感染可引起细菌性肺炎、中耳炎和脑膜炎等疾病,临床上常采用β-内酰胺类抗生素、大环内酯类和喹诺酮类抗生素进行治疗。近年来,肺炎链球菌感染性疾病发病率不断升高,究其原因主要是耐药或多重耐药菌株日趋流行。肺炎链球菌不产β-内酰胺酶,该菌对β-内酰胺类抗生素耐药主要是青霉素结合蛋白(PBPs)突变,其次是与PBPs突变无关的调控感受态ComD/ComE二元信号传导系统(TCSS)以及调控细胞壁合成或完整性的CiaH/CiaR-TCSS和StkP-PhpP信号偶联相关基因突变。肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要是ErmB甲基化酶对药物作用的核糖体靶点甲基化修饰和MefA/E药物外排泵功能增强。肺炎链球菌对喹诺酮类抗生素的耐药机制是DNA回旋酶和/或拓扑异构酶Ⅳ中喹诺酮类耐药决定区域(QRDR)变异和药物外排作用增强。肺炎链球菌19F和19A血清型在中国优势流行且对多种抗生素耐药。
关键词: 肺炎链球菌 ；抗生素 ；耐药性
被引量
18
摘要： 目的：构建肺炎链球菌ciaH基因敲除（ΔciaH）突变株，了解肺炎链球菌二元信号系统CiaH／CiaR中ciaH基因与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性。方法采用PCR 扩增肺炎链球菌ATCC6306株ciaH基因片段，T-A克隆后测序。构建用于敲除ciaH基因的自杀质粒pEVP3ciaH ，CaCl2法将其转化入肺炎链球菌ATCC6306株，通过同源重组、插入失活及氯霉素筛选获得肺炎链球菌ATCC6306株ciaH基因敲除突变株ΔciaH。采用PCR、测序及激光共聚焦显微镜法对ΔciaH突变株进行鉴定。采用二倍琼脂稀释法测定并比较青霉素G（ PCN）或头孢噻肟（ CTX）对ΔciaH突变株和野生株最低抑菌浓度（ MIC）及其差异。采用实时荧光定量RT-PCR（ qRT-PCR）检测1／4 MIC PCN或CTX作用前后ciaH-mRNA水平变化。结果 PCR和测序结果显示，所构建的ΔciaH突变株染色体DNA中ciaH基因被插入失活；免疫荧光法检测结果显示，ΔciaH突变株不表达CiaH蛋白。 PCN和CTX对ΔciaH突变株MIC分别为32μg／ml 和64μg／ml，明显高于野生株的0．06μg／ml 和1μg／ml （ P＜0．01）。1／4 MIC PCN或CTX作用后，肺炎链球菌ciaH-mRNA水平显著升高（P＜0．01）。结论肺炎链球菌CiaH／CiaR二元信号系统中CiaH与其对β-内酰胺类抗生素耐药性有关。
关键词: 肺炎链球菌 ；二元信号传导系统 ；CiaH蛋白 ；β-内酰胺类抗生素 ；耐药性
被引量
6
摘要： 目的 确定肺炎链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶StkP与耐药相关性及其胞外区与β-内酰胺类抗生素结合的能力.方法 采用插入失活法构建肺炎链球菌ATCC6306株stkP基因敲除（ΔstkP）突变株.采用E-test检测青霉素（PCN）和头孢噻肟（CTX）对Δstkp突变株及其野生株的最低抑菌浓度（MIC）.采用生物信息学软件确定肺炎链球菌ATCC6306株丝氨酸/苏氨酸激酶编码基因（stkP）胞外区（EC-StkP）、构建EC-StkP三维空间结构模型、分析EC-StkP结构与功能关系.采用PCR扩增stkP基因胞外区片段（EC-stkP）,T-A克隆后测序.构建EC-stkP原核表达系统,SDS-PAGE联合凝胶图像分析系统检查目的重组蛋白（EC-rStkP）表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯EC-rStkP.采用等温滴定量热法（VT-ITC）和表面等离子共振法（Biacore）检测EC-rStkP与PCN和CTX结合能力.结果 肺炎链球菌ATCC6306株对PCN和CTX敏感（MIC=0.06和0.12 μg/ml）,但ΔstkP突变株对PCN和CTX高度耐药（MIC=16和32 μg/ml）.肺炎链球菌ATCC6306株StkP C端295 aa片段为胞外区,该胞外区有4个青霉素结合蛋白和丝氨酸/苏氨酸激酶相关（PASTA）功能结构域.克隆的stkP胞外区序列与GenBank中相应基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.6%和100%.构建的EC-stkP原核表达系统可表达可溶性EC-rStkP.PCN和CTX均能与EC-rStkP结合,但后者结合EC-rStkP能力强于前者.结论 肺炎链球菌stkP基因与β-内酰胺类抗生素耐药性密切相关,其表达产物丝氨酸/苏氨酸激酶StkP具有识别并结合β-内酰胺类抗生素的能力.
关键词: 肺炎链球菌 ；丝氨酸/苏氨酸激酶 ；β-内酰胺类抗生素 ；结合 ；基因敲除/耐药
被引量
6
【会议论文】 • 崔生辉
会议名称： 第二届全国细菌耐药监测与临床专题学术会议
会议时间： 2006-07-01
摘要： 由于氟喹诺酮类(Fluoroquinlones,FQs)药物的杀菌谱广,可以大量人工合成,结构上具有可塑性,该抗生素在控制人和动物细菌感染中得到了广泛应用.目前其年销售量占抗生素市场总份额的20％左右,仅次于β-内酰胺类抗生素居第二位.氟喹诺酮类药物的广泛应用也导致世界各地不同菌属,如沙门菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌及金黄色葡萄球菌等均出现了程度不同的耐药性.大肠埃希菌中已知的氟喹诺酮类药物耐药机制主要有拓扑异构酶的突变、喹诺酮耐药性质粒、外排泵的过度表达以及膜通透性的改变.大部分拓扑异构酶的突变集中在GyrA,GyrB,ParC和ParE亚单位的喹诺酮耐药决定区(theQuinoloneResistance-DeterminingRegions,QRDRs)中.将带有点突变的拓扑异构酶基因克隆到多拷贝质粒上,在细菌内通过基因的显性测试(Dominanttest)初步证明了这些点突变的功能,但由于多拷贝质粒上的基因在表达量、表达调控等方面区别于细菌染色体上的单拷贝基因,这一方法不能准确反映这些点突变的功能,另外,显性测试也不能阐明不同点突变间的相互作用机制.到目前为止,通过基因重组技术在细菌染色体上对拓扑异构酶上不同点突变功能进行准确测定的研究仅限于空肠弯曲菌gyrA基因,没有研究通过基因重组技术在细菌染色体上对大肠埃希菌中不同拓扑异构酶上不同点突变的功能进行准确测定.
关键词: 肠杆菌 ；氟喹诺酮 ；耐药机制
摘要： 目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统(TCS)基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。建立肺炎链球菌comD基因敲除突变株,了解comD基因与细菌β-内酰类抗生素耐药性的相关性,探讨氯氰碘柳胺下调comD、comE和com(?)基因mRNA的作用。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。构建用于comD基因敲除的自杀质粒pEVP3comD,通过同源重组及插入失活获得肺炎链球菌ATCC6306株comD基因敲除突变株comD.采用PCR及免疫荧光法对comD突变株进行鉴定。采用实时荧光定量RT-PCR检测氯氰碘柳胺处理前后comD—突变株及野生株comD、comE和comC基因1nRNA水平变化。采用二倍琼脂稀释法测定comD—突变株及野生株对青霉素G和头孢噻肟的敏感性。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3 pET42a-comD、E.coli BL21DE3 pET42a-comE和E.coli BL21DE3 pET32a-comC(?)有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1：4、1：4和1：8。ComD和／或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。测序及免疫荧光试验结果证实,所构建的comD突变株染色体DNA中comD基因被插入失活。50μmol/L或100μmol/L的氯氰碘柳胺能明显下调comD、comE和com(?)基因mRNA水平(P＜0.05),25μmol/L的氯氰碘柳胺则否。comD突变株对青霉素及头孢噻肟MIC值均为32μg/mL,明显高于野生株的0.06和1μg/mL。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。成功地构建了肺炎链球菌comD基因敲除突变株。comD基因与细菌对p-内酰类抗生素耐药性密切相关。氯氰碘柳胺可通过下调comD, comE和com(?)基因的转录水平,从而对细菌感受态形成产生影响。
关键词: 肺炎链球菌 ；ComD/ComE二元信号传导系统 ；β-内酰胺类抗生素 ；耐药性 ；氯氰碘柳胺 ；表达调控
被引量
1
摘要： 第一部分我国东部地区淋病奈瑟菌临床菌株porB基因分型与耐药相关性研究
背景：淋病奈瑟菌感染引起的淋病不仅是我国发病率最高的性传播性疾病(STD),也是严重的全球性公共卫生问题。淋病奈瑟菌多种外膜蛋白在细胞膜上形成孔道,又称孔蛋白(Porin, Por).其中PorB占细菌外膜蛋白总量的60%以上,根据PorB免疫原性的差异,可分为PorB1A和PorB1B两类,其氨基酸序列相似性为65%～80%。PorB1A和PorB1B由一个等位基因编码,故一株淋病奈瑟菌仅含有porB1A或porB1B等位基因中的一种。国外文献报告,分别有10%～30%和70%～90%淋病奈瑟菌临床菌株分别表达PorB1A或PorB1B。采用单克隆抗体均可将PorB1A或PorB1B分为若干血清型,其中porB1B基因遗传多样性和重组变异率明显高于porB1A基因,且不同地区优势流行的porB1A和porB1B基因型有明显差异。近年文献报道,PorB1B分子中第120和121位氨基酸残基G120D/K/R/P和/或A121D/H/P变异,与淋病奈瑟菌对青霉素和四环素耐药性增高相关,但PorB1A分子中第120和121位氨基酸替换突变与细菌对两种抗生素的耐药性关系不大,因此确定不同地区淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PorB编码基因变异程度及其优势基因型分布具有现实意义,但国内未有类似研究报道。
方法：采用纸片酸度定量法测定菌株的β-内酰胺酶,筛选出β-内酰胺酶检测结果阴性即不产青霉素酶淋病奈瑟菌临床菌株。以淋病奈瑟菌临床菌株porB全基因核苷酸序列测定为基础建立多重PCR(mPCR)用于对淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码等位基因porB分型,对倍稀释法检测淋病奈瑟菌临床菌株对青霉素和四环素的药物敏感性。
结果：315株临床菌株中检出porB1A基因型98株(31.1%)、porB1B基因型217株(68.9%)。98株porB1A基因型菌株血清型均为IA6, porB1A+菌株中88.8%不发生120和121位氨基酸突变,11.2%发生D120G突变,且所有98株菌株对青霉素和四环素均敏感。217株带有porB1B基因菌株中,分别有26.7%(58/217)、22.6%(49/217)和11.5%(25/217)属IB3、IB3/6和IB4血清型；有35.5%(77/217)5’端与IB3/6相似,3’端与IB2相似,属IB3/6-IB2嵌合血清型,且其中有15株第121和122位氨基酸缺失；另有3.7%(8/217)5’和3’端序列类似IB2血清型,中间序列类似IB4血清型。212株(97.7%)porB1B基因编码的氨基酸序列发生120和／或12l突变,其中163株(76.9%)为双突变。尤其是77株porB1B+IB3/6-IB2血清型临床菌株有15株发生A121和N122删除突变。上述所有发生突变的212株porB1B+菌株药敏试验结果对青霉素和四环素均呈现不同程度的耐药。
结论：我国东南部流行的淋病奈瑟菌主要携带porB1B基因,检出porB1B型菌株血清型有5型类型,以IB3/6-IB2嵌合、IB3和IB3/6血清型常见,IA6为porB1A型菌株优势血清型。淋病奈瑟菌临床菌株株携带的porB基因类型与青霉素和四环素耐药密切相关, porB1B型120和121位突变常见且与两种抗生素耐药密切相关。所建立的mPCR临床应用证明可用于淋病奈瑟菌porB1A和porB1B基因的分型,检测阳性率90%以上,分型准确率97.9%以上。
第二部分肺炎链球菌二元信号系统CiaR/H、Pkn2与β-内酰胺类抗生素耐药相关性研究
背景：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是人类肺炎主要病原体,也可引起脑膜炎、中耳炎等疾病。近年来,肺炎链球菌感染性疾病的发病率一直居高不下,全球每年死于肺炎链球菌感染的人数约为300-500万人。众所周知,β-内酰胺类抗生素是临床上治疗肺炎链球菌等革兰阳性菌感染性疾病的一线药物。业已肯定,肺炎链球菌对p-内酰胺类药物耐药性不断增强及耐药菌株广泛流行,是该菌所致疾病发病率不断升高的根本原因。肺炎链球菌对β-内酰胺耐药机制复杂,已有研究认为PBPs突变介导耐药,PBPs的本质是参与细菌细胞壁合成的转肽酶、羧肽酶和内肽酶类,肺炎链球菌有6种PBP。然而,有文献报道,除PBPs突变外,还有些与PBPs无关的基因也与肺炎链球菌β-内酰胺耐药相关,肺炎链球菌二元信号传导系统(TCSS) CiaH/CiaR也与β-内酰胺类抗生素耐药密切相关,ciaH基因突变菌株可出现高水平的耐药性。又2004年Echenique等发现,肺炎链球菌具有一种跨膜真核型丝氨酸／苏氨酸(Ser/Thr)激酶Pkn2,其磷酸化位点位于N端胞内区,C端胞外区含有PBP功能结构域(PBP-domain)、两者构成PBP-Ser/Thr激酶联合功能结构域(PASTA-domain).最近Dias等(2009)报告,Pkn2介导肺炎链球菌产生与PBPs突变无关的β-内酰胺类抗生素耐药性,但未研究其作用机制。
方法：采用PCR扩增全长ciaR、ciaH和pkn2基因,并建立其原核表达系统,SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rCiaR.rCiaH和rPkn2表达量。免疫家兔制备rCiaR、rCiaH和rPkn2抗血清及IgG。检测IgG胞外或胞内封闭肺炎链球菌菌株CiaH和CiaR后,细菌对青霉素和头孢噻肟耐药性的变化。构建用于ciaH和pkn2基因敲除的自杀质粒pEVP3ciaH和pEVP3pkn2,通过同源重组及插入失活获得肺炎链球菌ATCC6306株ciaH和pkn2基因敲除突变株ciaH-和pkn2-。采用PCR测序及免疫荧光法对ciaH-和pkn2突变株进行鉴定,"transformation test"测定野生株与ciaH-和pkn2-突变株进行感受态测定,实时荧光定量RT-PCR检测ciaH和pkn2基因敲除前后相关基因mRNA水平变化,用二倍琼脂稀释法测定菌株基因敲除前后对青霉素G或头孢噻肟MICs的变化,采用电泳迁移率检测(ESMA)确定CiaR-P调控的pbps等靶基因、p-内酰胺类抗生素信号激活CiaH/CiaR和Pkn2/PhpP通路及其介导的生物学效应差异。
结果：与报道序列比较,所克隆的ciaR、ciaH和pkn2基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%-100%和100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-ciaR、 E.coli BL21DE3pET42a-ciaH和E.coli BL21DE3pET32a-pkn2能有效表达目的重组蛋白rCiaR、rCiaH和rPkn2,其产量分别为细菌总蛋白的23%、28%和25%。rCiaR、 rCiaH和rPkn2抗血清免疫双扩散效价分别为1：4、1：4和1：8,IgG免疫双扩散效价都为1：1。CiaR和／或CiaH被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。PCR测序及免疫荧光试验结果证实,所构建的ciaH-和pkn2-突变株染色体DNA中ciaH和pkn2基因被插入失活。感受态测定结果野生株转化效率为0.08,而ciaH和stkP-突变株中转化效率为O。RT-PCR检测结果ciaH基因敲除突变株(ciaH-)的ciaR和pkn2mRNAs水平明显低于野生株(P<0.01),pkn2基因敲除突变株(pkn2-)的ciaH和ciaR mRNAs水平也明显低于野生株(P<0.01)；ciaH-突变株pbps mRNAs水平明显低于野生株(图3-4A),pkn2-突变株pbps mRNAs水平也明显低于野生株；0.001-0.004μg/mL青霉素或0.5-2.0μg/mL头孢噻肟37℃作用肺炎链球菌ATCC6306株30mmin后,ciaH和pkn2和几乎所有的pbps的mRNAs水平均较抗生素作用前明显下降(P<0.05)。ciaH-和stkP-突变株对青霉素及头孢噻肟MIC值分别为40μg/mL、50μg/mL和25μg/mL、30μg/mL明显高于野生株的0.06和1μg/mL。感受肽鉴定结果ciaH-和stkP-突变株转化效率为O。ESMA结果显示纯化的CiaR蛋白可以和pbp1a、pbp1b和pbp2b基因的启动子结合。
结论：肺炎链球菌二元信号系统CiaR/H和Pkn2参与p-内酰胺类抗生素耐药性调控。
关键词: 淋病奈瑟菌 ；porB基因 ；序列分析 ；多重PCR ；耐药 ；突变 ；肺炎链球菌 ；二元信号传导系统 ；β-内酰胺类抗生素 ；耐药性 ；表达调控
摘要： 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种革兰氏阳性微生物,可引起多种感染的重要病原体,其在机体上呼吸道定植,并在世界范围内引起一系列致命性感染,如肺炎、中耳炎、菌血症和脑膜炎等。肺炎链球菌也是导致社区获得性肺炎和患者住院治疗的主要病原体之一,在婴幼儿、老年人及其他疾病患者中发病率极高,诱发条件包括如无脾、慢性疾病和免疫缺陷性疾病。传统抗生素被认为是肺炎链球菌感染临床治疗的第一选择,但随着全球抗生素滥用导致抗生素耐药菌的出现,细菌耐药性已经加快了肺炎链球菌的进化和传播,其中β-内酰胺类抗生素的抗性分布尤为广泛,对青霉素不敏感的肺炎链球菌分离株在2004年时已经达到35%,此外,对氯喹诺酮和大环内酯类不敏感的菌株引起的病例数量也在增加。同时,肺炎链球菌作为一种耐药细菌,甚至已经对万古霉素产生耐药性。肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,PLY)是肺炎链球菌现已明确的主要毒力因子之一。这一毒素是胆固醇依赖性溶细胞素的成员,胆固醇参与诱导肺炎链球菌溶血素形成多亚基复合物,即多聚体,通过在膜上形成孔而裂解宿主细胞。目前对溶血素的致病性研究已十分清晰,PLY是肺炎链球菌必需的毒力因子,可以穿透宿主细胞的物理防御、刺激宿主细胞凋亡、具有炎症性质,并激活补体系统。除红细胞外,PLY还可作用于机体上皮细胞、巨噬细胞,具有免疫逃避和损伤DNA链的作用。不表达PLY的肺炎链球菌缺失菌株致病力显著降低,在感染试验动物中仅表现为弱毒性,表明溶血素在肺炎链球菌引发的侵袭性感染中有利于增强其致病力。PLY在肺炎球菌致病过程中发挥的重要作用使得该毒力因子成为治疗肺炎球菌感染的最有潜力的靶标之一。药用植物中的天然化合物为药物研发提供了广泛来源,而依据抗毒力策略针对病原体主要毒力因子进行的药物筛选也主要依赖于天然化合物。本研究以肺炎链球菌PLY为研究靶标,从多种药用植物有效成分中筛选出β-谷甾醇和毛蕊花糖苷两个天然化合物单体,通过红细胞裂解试验、最小抑菌浓度测试、免疫印迹分析、寡聚化分析、以蛋白3D结构为基础的计算生物学分析、药物对肺上皮细胞的保护效果以及对肺炎链球菌肺炎小鼠模型的保护作用,对两种受试药物中和PLY生物学毒性的能力和机制进行了分析,为天然化合物抗毒力防控病原体感染,降低抗生素对微生物的生存压力,减缓细菌多药耐药进化进程提供了研究基础。研究中使用纯化的重组蛋白(recombinant PLY,r PLY),在十余个天然化合物中筛选得到的β-谷甾醇和毛蕊花糖苷均可在较低剂量下直接中和r PLY对红细胞的裂解作用。将受试药物与肺炎链球菌野生型菌株D39共培养,药物浓度高于2048μg/ml时依然不影响细菌生长,表明β-谷甾醇和毛蕊花糖苷对肺炎球菌不具备抗菌活性。收集与受试化合物共培养菌液中的菌体进行Western Blot试验,PLY的特异性条带粗细均一,结果表明随着药物浓度增高,细菌表达PLY的能力不受影响,即受试药物不影响肺炎球菌PLY的基因转录和翻译过程,其抑制作用是直接与毒素特定结构结合使PLY失活或封闭活性位点的结果。本研究为进一步探讨此两种化合物抑制PLY溶细胞活性的机制,应用分子对接和分子动力学模拟的方法,以已知3D结构的同源蛋白为模板构建PLY的结构模型,分别与β-谷甾醇和毛蕊花糖苷进行对接,选择优势构象,并对结果实施分子动力学计算。评估数据后结果表明,游离PLY在溶液中活动自由,蛋白与毛蕊花糖苷结合后显示较弱的灵活性,表明PLY残基由于与毛蕊花糖苷结合后增加刚性,毛蕊花糖苷结合在PLY结构域3和结构域4之间的裂口处,该区域在蛋白寡聚过程中发挥作用,结合位点处的稳定性主要是残基Asp471、Asn470、Glu277、Tyr358和Arg359所提供;β谷甾醇-PLY复合物中,由于β-谷甾醇C25的烷基链引起相对较大空间位阻,阻碍了化合物与PLY残基Thr459、Leu460之间的密切相互作用,它和Thr459、Leu460之间的距离长于蛋白与天然受体胆固醇的距离,但作为胆固醇结构类似物β-谷甾醇与PLY的结合方式基本与胆固醇一致。PLY属于胆固醇依赖性细胞毒素,目前对该家族蛋白已有深入研究。较高浓度的PLY可以无需借助细胞膜或胆固醇在溶液中自发组装形成多聚体,我们通过高效液相色谱法,分析预处理过的药物-蛋白混合样品,结果指出β-谷甾醇不影响PLY的自寡聚,而毛蕊花糖苷则显著抑制PLY寡聚体的形成,这也与我们计算生物学的结果一致。肺炎球菌D39引起肺上皮细胞凋亡,而PLY可直接引起肺上皮细胞、巨噬细胞等裂解坏死。PLY具有基因毒性,能够在不严重破坏宿主细胞膜的情况下诱导DNA损伤,造成核内离散的γ-H2AX病灶。本研究将PLY与人肺腺癌上皮细胞A549共培养样品按浓度梯度分别混合β-谷甾醇和毛蕊花糖苷,使用激光共聚焦仪器观察荧光染色后样品中细胞状态、并评估乳酸脱氢酶释放量,实验结果表明胆固醇类似物β-谷甾醇和针对寡聚化结构域的毛蕊花糖苷均可在较低浓度下显著抑制PLY对A549细胞损伤,降低靶细胞坏死率。免疫荧光实验显示,在受试药物存在条件下暴露于PLY的A549细胞核出现DNA损伤的频率显著降低。这些结果表明,通过阻止PLY的寡聚化或阻止其与膜胆固醇的初始结合,可抑制其对真核上皮细胞的细胞毒性、减弱遗传毒性。建立肺炎链球菌肺炎小鼠模型后,考察β-谷甾醇和毛蕊花糖苷对肺炎球菌肺炎的治疗效果。实验结果表明,β-谷甾醇和毛蕊花糖苷的治疗均可显著提高致死性肺炎小鼠的存活率,降低肺炎链球菌感染小鼠肺部细菌定植数,有利于机体对病原体的清除,缓解实验小鼠的肺组织充血、炎症和损伤症状。综上所述,β-谷甾醇结合于PLY胆固醇结合位点阻碍毒素与膜的结合、毛蕊花糖苷结合在PLY寡聚化相关位点抑制其多聚成孔,从而抑制了毒素的细胞毒性和基因毒性、保护靶器官上皮细胞、缓解侵袭性感染对机体的损伤、为机体提供保护,从而在药物无抗菌活性的情况下起到有效的抗感染效果。本研究为药用植物有效成分的药理活性提供了补充,并为依据抗毒力思路抗感染提供了理论基础和先导化合物。
关键词: 肺炎链球菌 ；溶血素 ；肺炎 ；β-谷甾醇 ；毛蕊花糖苷 ；寡聚化 ；DNA损伤
被引量
31
摘要： 草绿色链球菌(Viridans Streptococci, VS)作为口腔、上呼吸道、胃肠道的常驻菌群,早期被认为是人体正常菌群的组成部分。但近年来VS引起的口腔颌面软组织、生殖道感染、心内膜炎等的病例不断增多。最常见VS全身性感染——感染性心内膜炎,可以由牙科治疗,甚至刷牙导致的VS一过性菌血症产生,并引发体内免疫反应；VS也是癌症、骨髓移植、免疫缺陷肺炎等患者重要的感染源,当感染造成败血症时常常引发感染性休克导致死亡；牙源性间隙感染为常见颌面部严重感染之一,可继发海绵窦血栓性静脉炎、脑脓肿、败血症、纵膈炎等严重并发症,危及患者生命,而VS现在被视为牙源性间隙感染常见病原菌之一,参与了深部脓肿的形成。近年来牙周炎与冠心病的相关性研究显示：VS可促进血小板聚集,加快血凝,形成血栓,从而可能引发低血性心血管疾病的发生。其机制可能是VS分泌血小板聚集相关抗原(platelet aggregation-asso-ciated protein, PAAP),与血小板聚集有关；PAAP是一种毒力因子,还可充当热休克蛋白促发自身免疫反应而引发早期动脉粥样硬化损伤。VS及其代谢产物还可诱导脉管细胞异常增殖,影响和改变脉管细胞生理功能,直至细胞死亡进而促发局部急性缺血。而且VS通常处于斑块不稳定部位,可能影响粥样斑块的进展,预示斑块的破裂,触发急性冠脉综合征或缺血性中风。近年来监测报告显示：VS对常用抗生素药物敏感性均有明显降低,其中青霉素耐药率达到22.4%,头孢唑啉耐药率为17.9%,呋喃妥因、利福平耐药率近50%,环丙沙星、四环素、克林霉素、复方磺胺甲噁唑、红霉素耐药率60%-80%以上。2009-2012年国内权威监测报告显示：VS对β-内酰胺类抗生素的耐药率超过了高致病性β-溶血性链球菌。耐药VS的快速出现,导致临床筛选敏感抗生素压力增大,感染治疗困难,病程迁延。自然界中90%以上的细菌以生物膜(bacterial biofilm, BF)的形式生活,超过65%的人类细菌感染与生物膜有关。生物膜能通过多种机制对膜内细菌起屏障保护作用,避免或减少药物和机体免疫系统对细菌进行处理,显著增加生物膜细菌的致病力与耐药性。研究亚急性心内膜炎发现：VS能够在受损心内膜表面形成类似生物膜的细菌赘生物；邹彬彬等在尿路感染患者导尿管内获得了VS生物膜,该生物膜的耐药性超过浮游菌。上述研究提示VS具有形成生物膜的能力,生物膜是VS耐药的重要影响因素。目前认为生物膜细菌耐药机制包括：(1)生物膜屏障机制,即胞外多糖基质阻止抗生素药物接触生物膜细菌;(2)营养限制,即生物膜细菌生长速度减慢,膜内营养物质、氧气的消耗以及代谢废物的聚集促使细菌进入一种非生长状态,该状态下细菌对抑制其生长的抗生素药物几乎完全不敏感；(3)β-内酰胺酶,细菌产生的β-内酰胺酶在生物膜表面基质内高浓度聚集,迅速水解渗透进入的β-内酰胺类抗生素,有效保护深部细菌不被β-内酰胺类抗生素药物灭活；(4)密度感应,细菌通过监测群体细胞密度来调节特定的基因表达,以保证生物膜中营养物质的运输和废物的排出,避免细菌过度生长而造成空间和营养物质缺乏。密度感应(Quorum Sensing, QS)是一种根据密度对细菌基因表达进行调控的机制。自体诱导物(Autoinducer, AI)信号分子由细菌在胞内合成,分泌至胞外环境：自体诱导物的浓度随着生物膜中细菌数量的增加而不断升高。细菌通过对外环境中自体诱导物浓度的感应而进行周围细菌“计数”；当自体诱导物浓度达到阈值,AI与细菌表面信号受体蛋白结合,直接或间接调控细菌目的基因表达。细菌密度感应调控普遍存在于G+、G-细菌中,生物膜结构的稳定、细菌毒力因子表达、耐酸性和耐药性都受AI信号分子的调控。在感染建立过程中发挥重要作用,因此干扰密度感应调控降低生物膜细菌致病力与耐药性,从而用较低的抗生素浓度治疗或通过宿主防御系统自然消除感染已经成为目前研究的一个主要热点。常见QS调控机制可分为三种类型：①G+细菌QS调控以寡肽类物质作为信号分子,寡肽信号分子是前导肽在细菌细胞内经过修饰处理而成,细菌种属不同形成的寡肽类物质不同,ATP结合区(ATP-binding cassette, ABC)转运系统负责细菌体内寡肽信号分子的输出,双组份识别系统负责感应寡肽信号分子；②G-细菌中存在Luxl/LuxR QS调控机制,酰基高丝氨酸环内酯类物质(acyl-homoserine lactone, AHL)作为信号分子,即AI-1; LuxⅠ类蛋白酶是AI-1合成所必需的,LuxR类结合蛋白则进行AI-1的识别和基因调控；③G+、G-细菌中共同存在的信号分子,呋喃酰硼酸二酯(furanosyl borate diester),即AI-2信号分子,其合成主要依赖LuxS基因编码的LuxS蛋白酶。寡肽信号分子和AHL信号分子主要介导细菌种内信号识别,AI-2则是细菌种间交流的通用信号分子。AI-2信号所控制的细胞间信息交流已被证实在细菌生长过程中发挥重要作用,影响生物膜的形成、发展及其功能发挥。对牙周病致病菌培养液的检测显示AI-2信号分子的存在,任一细菌AI-2信号分子的产生都有助于种间交流和混合种生物膜的形成。LuxS基因广泛存在于不同细菌,高度保守。LuxS基因编码的蛋白酶是AI-2合成的必需催化物,LuxS基因被认为是合成AI-2信号分子的标志性基因。AI-2信号分子,呋喃酮酰硼酸二酯(furanosyl borate diester),其双五圆环结构具有对称性,腺苷甲硫氨酸(SAM)是其合成的起始底物,中间产物为S-核糖基同型半胱氨酸(SRH),AI-2信号分子前体物,4,5-二羟基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2, 3-pentanedione, DPD)则由LuxS蛋白酶催化SRH形成,最后在硼离子作用下发生重排,形成AI-2。A1-2信号分子与细菌胞膜上的跨膜蛋白受体胞外区结合,自激酶活性磷酸化跨膜蛋白受体胞浆区,激活胞内同源调控因子,调控特定基因的表达。研究变异链球菌生物膜证实：可以通过LuxS基因突变干扰AI-2密度感应信号,影响生物膜的形成和耐酸性。另有研究指出AI-2密度感应信号对革兰阴性沙雷氏菌、铜绿假单胞菌成熟生物膜的抗生素敏感性具有重要影响。本研究通过敲除VS多药耐药野生株LuxS基因,阻断LuxS/AⅠ-2密度感应信号分子合成,干扰VS生物膜细菌密度感应调控,影响VS生物膜形成和耐药性：探讨LuxS/AⅠ-2密度感应信号在VS多药耐药野生株生物膜形成,p-内酰胺类、喹诺酮类及四环素类抗生素药物耐药中的作用与机制；从分子水平理解VS生物膜形成和耐药的产生,为降低细菌致病力,治疗生物膜感染,提供新思路、新途径和新靶标。第1章VS多药耐药野生株的分离与鉴定目的 获得研究所需目标菌株——草绿色链球菌多药耐药临床分离野生株。方法临床标本通过血平板培养、革兰染色、药敏试验筛选出疑似目标菌株；纯培养后行生理、生化试验,提取细菌基因DNA,多聚酶链式反应(PCR)扩增16SrDNA,测序后上传至NCBI数据库与已知序列比较,行16S rDNA序列同源性分析。结果临床分离多药耐药野生株(327045号),革兰染色阳性链球菌：a溶血；生化实验提示D群链球菌,缓症链球菌可能性大；16S rDNA序列同源性分析显示与缓症链球菌(S.mitis)同源性最高,99.58%。结论临床分离野生株(327045号)属于草绿色链球菌多药耐药野生株。成功获得本研究所需目标菌株。第2章 VS多药耐药野生株的致病力检测目的 了解目标菌株——草绿色链球菌多药耐药临床分离野生株的致病力,为下一步比较实验获取基线数据。方法 通过野生株上清液诱导V. harveyibb170报告菌株生物发光实验检测VS多药耐药野生株AI-2信号分子的存在与活性：酶标仪测量VS多药耐药野生株形成生物膜的吸光光度值,了解其生物膜形成能力；定量分析不同时间、不同类型、不同浓度抗生素对VS野生株生物膜形成量的影响,了解其耐药性,数据输入SPSS 17.0统计学软件,进行析因资料方差分析和单因素方差分析；Fluorecein Stain、18909 Calcofluor White Stain、 DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain荧光染色后,激光共聚焦显微镜扫描观测VS多药耐药野生株生物膜结构、胞外多糖分布、死活菌分布,全面了解VS多药耐药野生株的致病力表型。结果析因资料方差分析显示抗生素种类与浓度(P=0.034)、抗生素种类与干预时间(P<0.001)、抗生素浓度与干预时间(P=0.010)皆存在交互作用；主效应分析显示抗生素类型(P<0.001)、抗生素浓度(P=<0.001)、干预时间(P<<0.001)均可影响VS多药耐药野生株的BF形成。经单因素方差分析Dunnett t-tests多重比较显示初始期,环丙沙星耐药浓度(P=0.001)、中敏浓度(P<0.001)、敏感浓度(P<<0.001),四环素耐药浓度(P=0.012)、中敏浓度(P=0.009)、敏感浓度(P--0.001)实验组中抗生素均有效减少了VS多药耐药野生株BF的形成;中间指数期,实验组BF形成量与菌液对照组均不存在显著性差异(P>0.05)。生物膜结构复杂,且不均一；胞外多糖、死活菌分布特点多样,可受抗生素干预因素影响。结论 VS多药耐药野生株具有极强的生物膜形成能力和多重耐药性,致病力高,值得临床关注；抗生素治疗应遵循实验室检查结果。第3章VS LuxS基因突变株的构建目的通过同源重组法敲除VS多药耐药野生株的LuxS基因,构建VS LuxS基因突变株,为进一步研究LuxS基因在VS生物膜形成与耐药性变化中的作用做准备。方法运用同源重组法设计合成引物,分别以质粒PMG36E、VS多药耐药野生株(327045)DNA为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增得到红霉素抗性(Erm.)基因DNA片断和LuxS基因上下游序列,经双酶切反应插入pUC19质粒的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌感受态细胞,氨苄青霉和红霉素培养基筛选,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的VS多药耐药野生株(327045)中,利用红霉素抗性培养基筛选出LuxS基因缺陷突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)检测。结果PCR凝胶电泳结果显示：红霉素抗性基因和LuxS基因两侧同源序列成功连入到Puc19质粒相应酶切位点,VS LuxS基因突变株LuxS基因完全被红霉素抗性(Erm.)基因所取代。结论成功构建VS LuxS突变株。第4章LuxS基因缺失对VS野生株致病力的影响目的 了解LuxS/AⅠ-2密度感应信号缺失对VS多药耐药野生株生物膜致病力的影响,尝试探讨可能存在的机制。方法；V.harveyi BB170报告菌株生物发光实验检测AI-2信号分子的存在与活性；吸光光度值定量分析VS多药耐药野生株与LuxS基因突变株生物膜形成量与耐药性差异；Fluorecein Stain、18909 Calcofluor White Stain、DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain荧光染色后,激光共聚焦显微镜扫描VS多药耐药野生株与LuxS基因突变株BF,比较二者在生物膜结构、胞外多糖分布、死活菌分布方面的差异；通过野生株上清液、DPD补偿生长实验确认VS突变株表型发生的原因。数据输入SPSS 17.0统计学软件,进行Kolmogorov-Smirno test非参数检验。结果Kolmogorov-Smirno test显示：VS LuxS基因突变株与野生株菌液BF形成量存在显著性差异(P<0.001)；同样条件下,氨苄西林(P<0.001)、环丙沙星(P<0.05)、四环素(P<0.001)干预VS LuxS基因突变株与野生株BF形成量均存在显著性差异。突变株菌液BF形成量与VS野生株上清液、DPD补偿实验组BF形成量,均存在显著性差异(P<0.
关键词: 草绿色链球菌 ；16S rDNA ；同源性分析 ；药敏试验 ；细菌生物膜 ；致病力 ；草绿色链球菌 ；草绿色链球菌 ；LuxS基因 ；红霉素抗性基因 ；同源重组 ；基因突变 ；细菌生物膜 ；致病力 ；密度感应 ；自体诱导物AI-2 ；LuxS基因
被引量
3
摘要： 背景:肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是人类细菌性肺炎主要病原体，也可引起中耳炎和致死性细菌性脑膜炎。肺炎链球菌不产生β-内酰胺酶，但近年来肺炎链球菌临床菌株对β-内酰胺类抗生素耐药率不断升高，青霉素结合蛋白(penicilin binding proteins，PBPs)突变被认为是主要的耐药机制。近年文献报道，肺炎链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶StkP与PBPs非依赖性耐药密切相关且与磷酸酶PhpP形成信号偶联(signaling couple)。信号传导本质是信号分子磷酸化或去磷酸化的过程。因此，证实肺炎链球菌PhpP磷酸酶活性并了解其酶动力学特性可为深入研究肺炎链球菌PBPs非依赖性耐药机制奠定基础。 目的:构建肺炎链球菌磷酸酶编码基因phpP原核表达系统，确定重组表达产物rPhpP磷酸酶活性与类型，了解亚致死量青霉素（青霉素类抗生素代表）和头孢噻肟（头孢菌素类抗生素代表）诱导肺炎链球菌phpP基因mRNA（phpP-mRNA）表达上调的作用。 方法:采用PCR扩增肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因，T-A克隆后测序。采用NCBI数据库中Conserved Domain Database(CDD)软件对上述肺炎链球菌PhpP序列中磷酸酶功能结构域进行预测及分析。以pET42a为表达载体、E.coliBL21 DE3为表达宿主菌，构建phpP基因原核表达系统。采用SDS-PAGE及凝胶图象分析系统检查目的重组表达产物rPhpP的表达情况及其可溶性。采用丝/苏氨酸磷酸酶试剂盒检测rPhpP水解PP2C型磷酸酶底物活性并测定其酶动力学参数Km和Kcat值。采用E-test测定青霉素和头孢噻肟对肺炎链球菌ATCC6306株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。采用实时荧光定量RT-PCR检测亚致死量青霉素和头孢噻肟（1/4和1/8 MIC）作用前后肺炎链球菌ATCC6306株php P-mRNA水平变化。 结果:所克隆的肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank中公布的肺炎链球菌P6株phpP基因序列完全相同。CDD分析结果显示，肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因序列中含有PP2Cc型磷酸酶的结构功能域。所构建的工程菌株E.coli BL21DE3pET42a-phpP能有效表达可溶性的rPhpP。rPhpP能水解PP2C型丝/苏氨酸磷酸酶底物磷酸肽(RRA(pT)VA)且其活性随rPhpP浓度增加而升高，其酶学动力学参数Km和Kcat值分别为277.35μmol/L和0.71S-1。青霉素和头孢噻肟对肺炎链球菌ATCC6306株的MIC分别为0.023和0.032μg/ml。亚致死量青霉素和头孢噻肟（1/4和1/8 MICs）作用后，肺炎链球菌ATCC6306株phpP-mRNA水平显著升高(p＜0.05)。 结论:本研究成功地构建了肺炎链球菌phpP基因原核表达系统并表达了可溶性有活性的产物rPhpP。肺炎链球菌phpP基因表达产物为高活性的PP2C型丝/苏氨酸磷酸酶。亚致死量青霉素和头孢噻肟可诱导phpP基因表达上调，提示在StkP/PhpP信号偶联中PhpP可去磷酸化影响StkP功能，从而在肺炎链球菌PBPs非依赖性耐药中发挥作用。本课题研究结果为后继深入研究StkP/PhpP信号偶联介导肺炎链球菌PBPs非依赖性耐药的分子机制奠定了基础。
关键词: 肺炎链球菌 ；phpP基因 ；基因表达 ；PP2C型磷酸酶 ；酶活性
摘要： β-内酰胺类抗生素是一类广谱抗菌药物，是目前临床上最常用的药物，一直被用来治疗包括肺炎链球菌和不动杆菌等多种细菌引起的感染。然而β-内酰胺类抗生素的耐药问题目前已越来越严重。在肺炎链球菌中往往是由于抗生素作用的靶标青霉素结合蛋白发生了突变，降低β-内酰胺类抗生素的结合效力导致耐药，在不动杆菌中，是因为细菌产生了可以水解β-内酰胺类抗生素的酶，进而使抗生素失效。 针对两种重要致病菌对β-内酰胺类抗生素的耐药问题，本研究分为两部分内容，第一部分为肺炎链球菌对临床常用β-内酰胺类抗生素--头孢呋辛耐药的快速检测研究，第二部分为不动杆菌中新型β-内酰胺酶--苯唑西林酶(OXA)的鉴定。 快速检测肺炎链球菌对β-内酰胺的耐药水平具有重要的临床意义。本研究围绕肺炎链球菌青霉素结合蛋白(PBP)序列型和β-内酰胺类抗生素耐药表型的对应关系，从PBP中计算出了与耐药表型直接相关的高突变的位点（HVLs），基于机器学习的方式，建立了随机森林模型，用HVLs对头孢呋辛的耐药表型进了预测，并且基于HVLs彼此的相关性，用一个测序反应就可以测通的短序列完成了头孢呋辛耐药表型的预测，实验也验证了模型预测的准确性，本研究达到了快速检测肺炎链球菌头孢呋辛耐药表型的目的。对67株肺炎链球菌测定了临床常用抗生素头孢呋辛的最低抑菌浓度(MIC)，对编码相关PBP蛋白的基因pbp进行了测序。通过PBP系统发育树，发现肺炎链球菌的耐药表型与pbp基因型具有显著的相关性。随后从NCBI数据库中下载了6748个肺炎链球菌菌株的pbp1a，pbp2b和pbp2x基因序列，计算了3个蛋白每个位点的类别方差，通过类别方差筛选到了139个HVLs，结合67个菌株对耐药高决定系数(HCD)位点分析，发现大部分HVLs就是HCD位点，即大部分HVLs与耐药高度相关。以4300株肺炎链球菌的转肽酶结构域(TPD)序列以及对应头孢呋辛的耐药表型作为数据库，将其中80％的数据作为训练集，20％的数据作为检验集用HVLs去预测头孢呋辛的耐药表型，结果发现与用蛋白的TPD序列预测效果一样好。为了使检测更加简便，分析出HVLs之间彼此相关，基于这种相关性用PBP1a的392-641位的氨基酸序列和PBP2x的337-586位的氨基酸序列完成了耐药表型的准确预测，单独用PBP2x的337-586位的氨基酸序列也准确预测了头孢呋辛的耐药表型，而这两条短片段用一个测序反应即可测通。为了进一步验证模型预测的准确性，合成了3株被预测高耐药菌株的pbp1a和pbp2x基因，转化R6后，3对基因的转化子均获得了很高的耐药表型，这表明模型预测具有很高的准确率，可以应用于临床上快速检测肺炎链球菌对头孢呋辛的耐药。 blaoxA属于碳青霉烯类耐药基因，实验室前期经过生物信息学的方式找到了5类推测为新型的blaoxA基因，利用pET28a载体在大肠杆菌BL21进行了初步的表型实验。为了明确blaoxA基因在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌表达所导致耐药表型的差异，本研究采用穿梭质粒pKFAb重新构建了含有blaoxA的重组质粒，使其可以同时在大肠杆菌DH5α和鲍曼不动杆菌ATCC19606中表达。结果表明，这些blaoxA基因在鲍曼不动杆菌中表达时，对碳青霉烯类的美罗培兰、亚胺培兰、厄他培南有明显耐药，同时也对青霉素和阿莫西林有高耐药性。而在大肠杆菌DH5α中表达时，大多数blaoxA基因对碳青霉烯和青霉素类的耐药水平有明显提高。采用不动杆菌核心基因组构建系统进化树，发现这5类OXA酶分布在8种不动杆菌中，包括A.gyllenbergii、A.colistiniresistens、A.proteolyticus、Adisperses、A.guillouiae、A.tandoii、A.bohemicus和A.kyonggiensis。OXA-664与其突变体OXA-MT相比，在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中的碳青霉烯的耐药水平都明显提高，暗示OXA酶的突变可能是导致耐药提高的一种方式。我们的研究加深了对碳青霉烯水解的OXA类β-内酰胺酶在不动杆菌广泛分布的认识，进一步揭示了不动杆菌是OXA的储存库。
关键词: 肺炎链球菌 ；耐药检测 ；β-内酰胺类抗生素 ；不动杆菌 ；新型β-内酰胺酶-苯唑西林酶