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摘要： 目的：通过化学方法合成铜绿假单胞菌Quorum Sensing（QS）信号分子3OC12-HSL，并鉴定其结构、纯度及其生物活性。观察不同浓度3OC12-HSL分子对肥大细胞细胞活力、细胞凋亡及胞内钙离子作用，同时观察肥大细胞释放IL-4，IL-6，组胺的释放及脱颗粒现象。
方法：采用以（L）-甲硫氨酸为基础的合成路线，经与碘甲烷成甲基硫鎓盐、水解、环合得到（S）-高丝氨酸内酯盐酸盐；（S）-高丝氨酸内酯环与相应的酰氯反应或与酰化丙二酸亚异丙酯的缩合反应制得目的物。合成产物经质谱、磁共振确定其结构，经高效液相色谱确定其纯度，并采用带lacZ为报告质粒的3OC12-HSL分子感应菌株E.coli MG4（pKDT17）检测其生物活性。通过化学合成具生物活性的3OC12-HSL分子，以不同浓度（6．25-100μM）3OC12-HSL分子作用于小鼠肥大细胞系P815，用WST-1方法观察不同时间点细胞活力改变，以Annexin V／PI双染法检测凋亡效应以及通过共聚焦观察钙离子荧光探针Fluo-3 AM方法检测胞内钙离子变化。分别用ELISA方法测定P815释放IL-4和IL-6情况，同时检测3OC12-HSL分子作用P815和HMC-1细胞后释放组胺（ELISA）情况及电镜观察脱颗粒现象。
结果：以（S）-高丝氨酸内酯盐酸盐计算，得到3OC12-HSL的收率为37．01％，它们的结构均经紫外，质谱，核磁等分析确证与天然结构相同，高效液相色谱检测3OC12-HSL纯度为99．6％。AHLs感应菌株E．coli MT102（pJBA132）经平板“T”字检测显示16h可见明显信号分子分泌，感应菌株E.coli MG4（pKDT17）显示出相似检测敏感性，通过平板检测法，人工合成3OC12-HSL分子可诱导感应菌株E.coli MG4产生与铜绿假单胞菌相似效果。细胞活力观察中，100μM浓度3OC12-HSL分子干预后的2h至24h，肥大细胞P815细胞活力持续下降；50-100μM作用12h后可明显抑制P815细胞活力（P＜0．05），50μM-100μM作用12h后显微镜下观察可见细胞明显皱缩。细胞凋亡方面，50μM浓度3OC12-HSL作用4h后，超过20%的P815细胞出现了凋亡现象，而100μM浓度3OC12-HSL作用后，有超过40％细胞出现凋亡。在100μM浓度下，3OC12-HSL分子可引起胞内钙离子浓度的升高，而在50μM浓度下，钙离子浓度变化相对100μM不显著，但与对照组和DMSO组相比仍有所升高。促细胞因子分泌观察中，经6．25-100μM浓度3OC12-HSL分子在与肥大细胞P815相互作用12和24h后，IL-4的释放相比对照组并未产生显著变化。P815细胞在经6．25-12μM浓度3OC12-HSL分子刺激24h时，IL-6表达较对照组显著升高（P＜0．05），在25，50及100μM刺激中，IL-6呈逐渐下降趋势（P＜0．05）。而在刺激的第12h时，变化并不显著。脱颗粒观察中，P815细胞经100μM浓度3OC12-HSL分子刺激P815细胞30min后，并未检测出其组胺分泌的差异，但HMC-1细胞经100μM 3OC12-HSL刺激后其组胺释放较对照组显著升高（P＜0．05）。电镜观察显示P815细胞所含颗粒较HMC-1少，形态上不具备成熟肥大细胞的典型特征。HMC-1细胞经3OC12-HSL刺激后可观察到明显脱颗粒现象。
结论：成功合成了具有与天然铜绿假单胞菌QS信号分子相同结构的3OC12-HSL分子，该分子具备天然生物活性。3OC12-HSL分子可抑制肥大细胞活力，细胞凋亡是造成活力抑制的原因之一，而胞内钙离子的升高可能参与了这一过程。3OC12-HSL分子可刺激小鼠肥大细胞释放IL-6，并可使典型肥大细胞释放组胺且发生脱颗粒现象，提示肥大细胞可能参与了铜绿假单胞菌感染免疫过程，3OC12-HSL分子在其中发挥了一定作用。
关键词: 铜绿假单胞菌 ；密度感应系统 ；3OC12-HSL ；化学合成 ；肥大细胞 ；细胞凋亡 ；钙离子 ；脱颗粒 ；细胞因子
被引量
2
摘要： 【背景】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)耐药性问题日趋严重的重要原因之一是细菌生物被膜的产生,群体感应(quorum sensing,QS)系统在其生物被膜形成过程中发挥了重要作用。QS抑制剂能够抑制生物被膜的形成和毒力因子的分泌,成为解决细菌耐药性问题的新策略。【目的】通过化学方法对las系统信号分子N-(3-氧十二烷基)-L-高丝氨酸内酯[N-3-(oxododecanoyl)-L-homoserine lactone,OdDHL]的母核和酰基侧链同时改变,合成N-十一烷酰基环戊酰胺,命名为Y0-C11-HSL,探讨其对P.aeruginosa生物被膜形成和毒力因子分泌的作用潜力和分子机制。【方法】采用结晶紫染色和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)评价Y0-C11-HSL对生物被膜形成和结构的影响,通过测定毒力因子的产生和运动试验评析Y0-C11-HSL的抑制活性,通过傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR)研究Y0-C11-HSL对胞外聚合物(extracellular polymers,EPS)表面化学基团的影响,采用分子对接进一步解析Y0-C11-HSL的作用机制。【结果】与对照组相比,在10−200μmol/L浓度梯度下,Y0-C11-HSL能够减少P.aeruginosa生物被膜形成,且在200μmol/L时减少率达24.1%(P<0.01)。此外,在200μmol/L处理下,Y0-C11-HSL能够显著抑制绿脓菌素、鼠李糖脂、胞外多糖和水解蛋白酶的分泌,抑制率分别为34.7%(P<0.01)、33.1%(P<0.01)、27.3%(P<0.01)和37.3%(P<0.01),抑制swarming和twitching运动,抑制率分别为45.6%(P<0.01)和51.7%(P<0.01),影响了EPS表面化学基团。分子对接结果表明,Y0-C11-HSL能与OdDHL结合的LasR受体蛋白竞争性结合。【结论】Y0-C11-HSL能与OdDHL结合的LasR受体蛋白竞争性结合,对转录蛋白产生影响,进而下调P.aeruginosa QS相关基因的表达。
关键词: 铜绿假单胞菌 ；生物被膜 ；毒力因子 ；群体感应抑制剂 ；Y0-C11-HSL
摘要： 目的通过化学合成铜绿假单胞菌密度感应（quorum sensing，QS）信号分子OdDHL，并观察该分子对小鼠肥大细胞生物学作用。方法通过化学方法合成OdDHL分子，经质谱、磁共振和高效液相色谱确定其结构和纯度，并采用OdDHI．分子感应菌株检测其生物活性。以不同浓度OdDHL分子作用于小鼠肥大细胞系P815，观察不同时间点细胞活力改变、凋亡现象以及胞内钙离子变化。结果成功合成具有生物活性的OdDHL分子，该分子能以时间、剂量依赖方式抑制细胞活力，并能诱导细胞凋亡，同时可卜调胞内钙离子浓度。结论铜绿假单胞菌OdDHL分子可诱导P815细胞凋亡并上调胞内钙离子浓度。
关键词: 铜绿假单胞菌 ；密度感应系统 ；自体诱导分子 ；肥大细胞
摘要： 目的:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一种革兰阴性非发酵菌,是临床常见的条件致病菌,可以引起呼吸道、泌尿道、皮肤、腹腔和血液等多个部位的感染。且PA在抗生素的影响下可以通过突变等机制产生获得性耐药,使临床治疗面临极大的困境。而质粒介导的耐药基因水平转移是PA产生耐药性的重要机制。细菌在生长过程中向周围释放特定的信号分子,以感知菌群密度变化,当信号分子随着细菌密度增加而积累到一定浓度,达到特定阈值时,信号分子会与受体蛋白相结合,使受体蛋白构象或基团发生变化,启动一系列基因表达,进而调节细菌的群体行为,这种现象被称为群体感应(Quorum sensing,QS)。在革兰阴性杆菌中存在以酰基高丝氨酸内酯(acyl homoserine lactone,AHL)类物质作为信号分子的QS系统,AHL可以与细菌的LuxR类蛋白受体结合,实现对下游一系列基因的调控。有些细菌例如大肠埃希菌、霍乱弧菌等基因组内不含有QS系统,不能产生AHL类信号分子,但是却表达LuxR类蛋白同源分子—SdiA蛋白,可以与周围环境中的AHL结合,同时SdiA也是转录因子,可以通过SdiA box与基因启动子结合,调控基因的表达。接合(Conjugation)是细菌以性菌毛为桥梁进行基因水平转移(horizontal gene transfer,HGT)的过程,是由质粒介导耐药基因传播的主要机制。传统观念认为,接合主要由质粒携带的接合性元件调控。本课题组前期通过构建大肠埃希菌-铜绿假单胞菌接合模型,研究受体菌PA在接合调控中的作用,发现PA QS系统的信号分子AHL具有抑制质粒接合性转移的重要作用。本部分实验利用同样的接合模型,观察在抗生素干预下接合效率的变化,以及QS系统关键基因lasI、rhlI,接合关键基因traI的表达水平的变化,并以细菌非编码小RNA为切入点探讨在抗生素干预下接合表型及相关基因产生变化的具体机制。方法:本实验构建的接合模型是以SM10λπ作为供体菌。该菌的染色体上整合了接合性质粒RP4(含有基因traI),且菌体内含有重组质粒pUCP24T,该质粒是由本实验室构建,以质粒pUCP24为骨架,通过基因重组的方法,插入质粒pCVD442基因组内控制接合反应的起始序列oriT片段,该片段含有松弛酶识别位点,是决定质粒能否进行接合转移的关键,质粒pUCP24T含有庆大霉素(Gm)抗性基因,可以作为接合子筛选的标记。此外有以SM10λπsdiA基因敲除株SM10λπΔsdiA作为供体菌的接合模型,蛋白sdiA是大肠埃希菌内QS系统信号分子的受体蛋白,AHL与SdiA结合后,可以通过sdiA box抑制接合相关基因traI的表达。本实验使用SM10λπΔsdiA突变株,可以排除受体菌所分泌的信号分子对供体菌以及接合效率的影响。本实验受体菌选用铜绿假单胞菌野生株PAO1,以及其lasI、rhlI基因敲除株PAO1ΔrhlI、PAO1ΔlasI,其中rhlI、lasI基因分别调控QS系统信号分子C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的合成和分泌,且PAO1对于氨苄西林(APM)天然耐药,只有获得质粒pUCP24T的接合子才同时具有Gm和APM抗性,才能在Gm+APM筛选平板上生长。为了观察在没有QS系统的情况下,抗生素对于接合效率的影响,本实验以同为大肠埃希菌的SM10λπ、EC600分别作为供体菌和受体菌,利用EC600对于利福平(RIF)天然耐药的特性,选用Gm+RIF抗性平板筛选接合子。分别将供体、受体菌培养至对数生长期,使用全自动尿液分析仪测量菌液浓度,按照1:1比例将供、受体菌混合,使其终浓度为1.0×10～7CFU/mL,取200μL混合菌液,37℃,共培养6h。用抗生素平板筛选接合子并计数,计算其接合效率。收集共培养后的混合菌液,提取RNA并逆转录为cDNA,以cDNA作为模板,使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测QS系统关键基因lasI、rhlI以及接合相关基因tarI的相对表达量。PA基因组不含有tarI基因,而大肠埃希菌基因组没有QS系统,因此使用两种菌的混合菌液提取的全RNA组,不会对qPCR的结果产生影响。利用生物信息学软件IntaRNA对PA中已注释过的sRNA进行靶基因预测,筛选QS系统相关sRNA,qPCR检测筛选到的候选sRNA与QS系统关键基因的相互关系。通过无痕同源重组的方法敲除铜绿假单胞菌PAO1株的prrH基因。利用PCR扩增prrH基因上下游同源臂片段,连接到载体pGSM(含有庆大霉素抗性基因aacC1片段、蔗糖敏感基因sacB片段以及接合转移基因mob片段)上,构建质粒pGSM-PrrHAB,并转化入大肠埃希菌SM10λπ感受态细胞。后者通过接合反应将质粒转移到PAO1株,利用抗生素选择压力实现同源重组,然后利用蔗糖选择压力去除抗性筛选标记。利用PCR、DNA测序等方法对突变株进行鉴定,最后测定突变株的生长曲线和生化反应。结果:在对受体菌造成生存压力的抗生素干预下,PAO1中lasI、rhlI基因表达显著下调,SM10λπ中traI表达上调,SM10λπ-PAO1接合频率增高10倍左右(P<0.01),通过敲除lasI/rhlI或sdiA阻断AHLs-SdiA-TraI信号通路可削弱抗生素诱导的接合。另一方面,对于SM10λπ-EC600接合体系,可能由于缺乏QS信号分子产生基因而无以上效应(P<0.01)。通过生物信息学分析发现QS系统多个关键基因如qscR、lasI、rhlI、rhlR等受到相关sRNA的潜在调控,并筛选出5条对QS系统具有潜在调控功能的sRNA,即PrrF、PrrH、CrcZ、RgsA、P34,其中sRNA PrrF和PrrH可能靶向LasI;RhlI及C4-HSL受体RhlR分别是sRNA RgsA、CrcZ或P34的潜在靶基因。成功构建了PAO1 prrH基因敲除株。结论:本实验以所构建的两种接合模型为基础,从表型和基因两个层面证明了抗生素胁迫可以使QS系统表达下调,通过降低对接合反应的抑制作用而促使细菌获得外源性耐药基因以适应环境。
关键词: 铜绿假单胞菌 ；抗生素 ；接合反应 ；群体感应系统 ；细菌非编码小RNA
被引量
1
摘要： 近年来,膜生物反应器(MBR)因其良好的处理效果、较小的占地面积、更低的污泥产量等优点,已被广泛用作高效的污水处理装置。然而,膜生物污染是该技术发展中亟待解决的关键问题。群体猝灭(Quorum quenching,QQ)作为一种新型抗膜污染策略开始被应用在膜生物反应器中。因此,本研究旨在富集筛选出一株具有良好性能的群体猝灭菌,并通过固定化的方式将其应用于实际的MBR反应器中,同时对该菌进行深入研究,确定其抗膜污染的深层机理。
本研究通过利用N-己酰-高丝氨酸内酯(N-Hexanoyl-L-homoserine lactone,C6-HSL)作为唯一碳源富集培养,从活性污泥中分离出一株新型QQ菌——皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii HITSZ001),同时测定出该菌分泌的三种群体猝灭酶。此外通过使用液体培养基中的生物传感器菌株紫色杆菌CV026建立了一种新型的生物学检测方法对信号分子进行定量,并将其与常见的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌进行共培养实验,发现在该QQ菌存在时,铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)和PA14(Pseudomonas aeruginosa PA14)的生物膜生产量减少了32.97%和22.63%,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物膜量减少了54.47%和22.56%,表明它对生物膜的形成具有良好的抑制作用。
为了更好地应用该菌株,将其封装在海藻酸钠-氯化钙小球内,海藻酸钠良好的凝胶性能可保证营养物质进入小球,而球内的微生物不外泄。结果表明,固定化菌株HITSZ001具有良好的群体猝灭性能,在p H为7.0左右、温度为30℃时猝灭效果最佳;在连续60 min的化学冲击实验中,未发现明显细菌泄露,在重复利用4次的情况下仍能保持50%以上的AHL降解率。通过荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜对小球的生物膜抑制实验表征发现其对MBR中存在的典型生物膜形成菌(铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌)膜污染的抑制效果。
本研究为了确定该菌深层的群体猝灭机理,选取了11种文献中有效的功能基因进行检测,最终确定了一种ahlm基因为该菌所含的群体猝灭功能基因。通过逆转录-聚合酶链反应实验,检测了该菌对铜绿假单胞菌群体感应(Quorum sensing,QS)系统相关基因的调控功能。加入QQ菌后,铜绿假单胞菌PAO1中群体感应基因las I、las R、rhl I、rhl R的表达分别下调了49.61%、62.17%、75.91%和79.50%,而在铜绿假单胞菌PA14中也有类似的结果,las I、las R、rhl I、rhl R基因的表达分别下调了19.66%、56.55%、37.79%和13.37%。
为了确定该菌在实际污水处理系统中的应用效果,本研究设计了间歇式生物膜过滤实验,该实验中QQ球组比不加任何小球的空白组生物膜量减少了65.07%,膜通量提升了1.58倍。此外,通过两个周期的MBR运行实验,发现QQ球可以在不影响出水水质和系统内污泥生化反应的条件下,抑制MBR内胞外聚合物和可溶性微生物产物的分泌,有效延缓膜污染。
关键词: 群体猝灭 ；膜生物反应器 ；膜污染 ；细菌固定化 ；功能基因
被引量
1
摘要： 近年来,抗生素滥用导致产生耐药性细菌,在临床上治疗由耐药菌引起的感染性疾病面临很大挑战,因此寻找新型抗菌药物具有重要意义。研究发现细菌可通过群体感应系统（Quorum Sensing,QS）调控生物被膜及毒力因子的产生,增加其致病性与耐药性。因此,以QS为靶点的群体感应抑制剂（Quorum Sensing Inhibitor,QSI）的研发是针对耐药性细菌感染的新思路与新方法。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是医院内主要机会致病菌,本文分别以AHL（Acyl-homoserine Lactones,AHLs）和AI-2（autoinducer-2）类QS信号分子为靶点设计了系列新型化合物,分两个部分系统研究了这些化合物对铜绿假单胞菌PAO1群体感应的影响。第一部分,本文设计、合成并分析了18个新型噁唑烷酮类化合物对革兰氏阴性菌AHL类QS的影响。首先,我们以前期工作合成的4-对氯苯氧基-N-（2-氧噁唑烷酮-3-基）-丁酰胺（ZS-12）为先导化合物,设计合成了系列新型噁唑烷酮类化合物,紫色色杆菌CV026为报告菌种初步筛选出化合物YXL-13具有较强的AHL类QS抑制活性(IC50=3.686±0.579μM)。然后,以致病性铜绿假单胞菌PAO1为实验菌种评估YXL-13的QS抑制活性。体外实验表明,YXL-13对PAO1生物被膜的形成、毒力因子的产生及swarming运动有明显的抑制作用。此外,YXL-13增加了PAO1生物被膜细胞对抗生素的敏感性。最后,以野生型秀丽隐杆线虫N2为模型生物通过体内实验表明YXL-13对PAO1 QS有明显的抑制作用从而延长了受感染线虫的寿命。第二部分,自诱导分子AI-2为信号分子的QS在多菌种之间的相互交流及细菌耐药性中发挥着重要的作用,本文对AI-2类QSI的QS抑制活性进行了评价。首先,我们以AI-2信号分子受体LuxP作为靶标通过虚拟筛选技术对来自In-house化合物库的8600个小分子化合物筛选,通过哈氏弧菌BB170作为报告菌种初步筛选出化合物Str7410具有较强QS抑制活性(IC50=0.3724±0.1091μM)。然后,我们以致病性铜绿假单胞菌PAO1和金黄色葡萄球菌ATCC25923为测试菌种通过体外、体内研究测试化合物Str7410对两种菌种间QS的抑制作用。体外实验表明Str7410对两菌种共同培养时混合菌种生物被膜的形成有明显抑制作用。Str7410与抗生素联用可显著提高混合菌种生物被膜细胞对于抗生素的敏感性。体内实验表明Str7410对种间QS有明显的抑制作用,明显延长了共同感染了PAO1和金黄色葡萄球菌ATCC25923线虫的寿命。接下来,我们研究了Str7410在PAO1与金黄色葡萄球菌ATCC25923共同培养时对PAO1毒力因子和swarming运动的影响,结果表明Str7410明显减少了PAO1毒力因子的产生和swarming运动。最后,我们初步评估了Str7410对种间QS的抑制机制,实时荧光定量PCR（Q-PCR）定量分析发现Str7410能够使PAO1与金黄色葡萄球菌ATCC25923共同培养时PAO1 QS相关基因下调表达,证明化合物通过抑制混合菌种PAO1对种间AI-2的感应下调QS相关基因的表达而产生对种间QS的抑制作用。综上所述,本文从体外和体内实验对两种QSI的QS抑制活性进行了评估。证实了新型噁唑烷酮类化合物YXL-13与化合物Str7410分别是较好的AHL类与AI-2类QSI。本研究不仅在理论上为抗菌药物发现提供新思路,而且在实践上为临床耐药菌感染治疗寻找新方法。
关键词: 耐药性 ；抗生素 ；群体感应系统 ；群体感应抑制剂
被引量
10
摘要： 目的:群体感应（Quorum Sensing,QS）是指细菌通过感知菌群密度变化来调控自身重要基因表达的群体行为。N-（3-氧代十二烷酰基）-L-高丝氨酸内酯(N-（3-oxododecanoyl）-L-homoserine lactone,AHL)是最具代表性的一类群体感应分子,由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.a）分泌。研究指出AHL对宿主细胞具有非常广泛的生物学调节作用。例如,AHL可通过损伤细胞线粒体或激活膜表面死亡受体来诱导细胞凋亡;AHL还有广泛的免疫调节功能诸如破坏上皮细胞连接、诱导免疫细胞趋化、激活核因子-κB（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）介导的炎症反应。另一方面,口腔内存在多种细菌,通常情况下菌群之间相互平衡维持的共生关系并不致病,但在某些重症牙周炎和持续性根尖周病等以骨缺损为主要症状的口腔疾病中,机会致病菌P.a会被特征性的检出,且有学者提出牙周主要致病菌合并P.a感染显著增加了牙周病的炎症和骨破坏的程度,因此,P.a与骨损伤之间可能存在因果关系。此外,P.a常以生物膜的形式存在,有研究指出,AHL在P.a体外生长的生物膜中大量积累,其浓度可高达300-600μM。因此,鉴于AHL强大的生物调节活性,AHL是否在牙源性骨破坏的相关疾病中发挥了重要的作用,引发了我们的关注。成骨细胞代谢是一个协调良好的生理过程,包括成骨细胞向骨细胞的分化以及成骨细胞的自身凋亡,二者相互平衡,这对于维持骨骼的质和量至关重要。成骨细胞分化通过上调成骨关键基因如Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）和Osterix的表达来提升成骨功能蛋白如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,Bsp）的表达,以此促进骨形成。而成骨细胞凋亡的发生主要是通过激活线粒体介导的内源性凋亡信号,启动细胞程序化死亡过程,清除受伤或多余的成骨细胞,以保证成骨细胞的分化平衡,从而维持了成骨细胞代谢的稳定性。成骨细胞的分化和凋亡相互制约,但又同时受某些上游信号分子例如钙离子(Calcium ion,Ca2+)的调节。Ca2+是成骨细胞功能的重要调节剂,细胞内Ca2+水平的升高连同下游信号通路的激活可以促进成骨细胞分化;但如果细胞内Ca2+超负荷又会诱导活性氧的产生并触发成骨细胞的凋亡。在正常的生理条件下,成骨细胞分化和凋亡受到严格调控,相互协调以维持成骨细胞的代谢平衡。然而作为细胞内的第二信使,Ca2+信号会受到某些细菌分泌物的干扰,进而导致成骨细胞代谢异常。同时,AHL已被证明可以通过调控Ca2+信号,诱导人血小板和肠杯状细胞中活性氧的释放、导致精子顶体的过早丢失、促进气道上皮细胞促炎性细胞因子的产生、或抑制上皮细胞间隙连接的细胞间通讯。因此,AHL是否也可以通过调控细胞内Ca2+来影响成骨细胞的代谢引发了我们的关注。在本研究中,我们检测了AHL对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1凋亡和分化的影响,探讨AHL诱导的胞内Ca2+释放模式对成骨细胞凋亡和分化的共同调控作用,揭示AHL对成骨细胞代谢潜在的影响机制,以期为牙源性骨缺损的治疗提供更多的理论支持。研究方法:1.实验方法1.1、AHL对成骨细胞凋亡的影响1.1.1不同浓度AHL（10、20、30、40、50μM）作用MC3T3-E1细胞1、3、5 d,显微镜拍照观察细胞形态,CCK-8检测细胞活性。1.1.2不同浓度AHL作用MC3T3-E1细胞24 h,TUNEL（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated d UTP Nick-End Labeling）法荧光标记凋亡细胞,荧光显微镜检测凋亡细胞并统计每mm2凋亡细胞数。1.1.3 AHL（50μM）作用MC3T3-E1细胞1、3、6、12、24 h或用不同浓度的AHL作用MC3T3-E1细胞3 h,Western blotting检测Cleaved-Caspase-3和CleavedPARP的蛋白表达。1.1.4红色线粒体荧光染料预染MC3T3-E1细胞线粒体,再加入绿色荧光标记的AHL（30、50μM）作用15 min,使用共聚焦激光扫描显微镜系统观察AHL与线粒体的共定位情况。1.1.5 AHL（30、50μM）作用MC3T3-E1细胞15 min,采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位。1.1.6红色线粒体荧光染料预染MC3T3-E1细胞线粒体1 h,加入AHL（30、50μM）作用3 h,再行细胞色素c荧光染色,使用共聚焦激光扫描显微镜系统观察细胞色素c由线粒体到胞质的异位情况。1.1.7 AHL（30、50μM）作用MC3T-E1细胞3 h,分离线粒体及胞浆蛋白,Western blotting检测细胞色素c蛋白在线粒体和胞浆中的表达。1.2、AHL对成骨细胞分化的影响1.2.1含不同浓度AHL（10、20、30、40、50μM）的成骨分化培养液作用MC3T3-E1细胞7、10、14及17 d,显微镜拍照观察细胞状态,检测ALP染色。1.2.2含不同浓度AHL的成骨分化培养液作用MC3T3-E1细胞3、7、10、14及17d,检测ALP活性。1.2.3含不同浓度AHL的成骨分化培养液作用MC3T3-E1细胞21 d,茜素红染色检测矿化结节。1.2.4含不同浓度AHL的成骨分化培养液作用MC3T3-E1细胞7、10、14及17 d,Real-time PCR检测Runx2、Osterix、Bsp和OCN的m RNA表达。1.3、AHL调节胞内钙离子释放模式影响成骨细胞凋亡和分化1.3.1绿色荧光标记的AHL（30、50μM）作用MC3T3-E1细胞15 min,再行内质网（Endoplasmic reticulum,ER）膜蛋白Calreticulin的免疫荧光染色,使用共聚焦激光扫描显微镜系统观察AHL与ER共定位情况。1.3.2双荧光Ca2+探针预处理MC3T3-E1细胞,在共聚焦激光扫描显微镜的监测下,加入AHL（30、50μM）,观察胞内Ca2+荧光强度变化,使用Image J进行荧光强度的比例分析,绘制胞内Ca2+水平的变化曲线。1.3.3方法同1.3.2,在共聚焦激光扫描显微镜的监测下,在加入或不加入钙调蛋白拮抗剂W7（10μM）情况下,监测AHL（30、50μM）对MC3T3-E1细胞胞内Ca2+释放模式的影响。1.3.4将W7（10μM）和AHL（30、50μM）同时加入MC3T3-E1细胞作用3 h,Western blotting检测Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP的蛋白表达。1.3.5将W7（10μM）和AHL（30、50μM）同时加入MC3T3-E1细胞分化培养10d,检测ALP染色和ALP活性、Real-time PCR检测Runx2、Osterix、Bsp和OCN的m RNA表达。2.统计方法实验至少重复3次,所有数据均以平均值±标准差表示。多组之间的比较采用单因素方差分析和Dunnett t检验进行统计学分析。P<0.05（*）具有统计学差异,P<0.01（**）具有显著性的统计学差异。结果:1、AHL诱导成骨细胞发生线粒体依赖的内源性凋亡与对照相比,AHL（20-50μM）逐渐降低成骨细胞CCK-8的OD值,具有浓度依赖性,但随着时间延长,OD值有所回升;TUNEL法荧光标记凋亡细胞,随着AHL浓度升高,绿色荧光标记的阳性凋亡细胞数逐渐增多;Western检测凋亡标志蛋白,可见Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP的蛋白表达量在3 h到达高峰,并具有浓度依赖性;荧光检测AHL在成骨细胞内定位,可见绿色荧光标记的AHL与红色荧光标记成骨细胞线粒体影像重合;JC-1检测线粒体膜电位,AHL降低了线粒体膜电位,具有浓度依赖性;绿色免疫荧光标记细胞色素c,红色荧光染料标记成骨细胞线粒体,可见AHL组细胞色素c脱离线粒体遍布整个胞质区;分离线粒体和胞浆蛋白,Western检测AHL作用下细胞色素c蛋白的表达,可见细胞色素c蛋白在线粒体中表达降低,在胞浆中表达升高。2、不同浓度AHL对成骨细胞分化有双向调节作用50μM AHL抑制了成骨细胞ALP染色、ALP活性、矿化结节的产生,并下调了成骨分化功能基因Runx2、Osterix、Bsp和OCN的m RNA表达;30μM AHL在3 d时抑制了ALP活性,但在7-17 d时,却促进了ALP活性及矿化结节的产生,并上调了Runx2、Osterix、Bsp和OCN的m RNA表达。其余浓度的AHL组,成骨细胞ALP活性及成骨分化功能基因存在一定范围内的正负向波动。3、AHL通过调节胞内钙离子释放模式同时影响成骨细胞凋亡和分化荧光检测AHL在成骨细胞内定位,可见绿色荧光标记的AHL与红色荧光标记成骨细胞ER影像重合;双荧光探针标记成骨细胞胞内Ca2+,可见AHL快速诱导胞内Ca2+水平爆发式升高。钙调蛋白拮抗剂W7完全阻断了AHL诱导的胞内Ca2+瞬间爆发式升高的释放模式,改为持续平缓的上升模式,并最终维持在更高（与只用AHL作用细胞相比）的水平;此外,W7有效抑制了AHL诱导的成骨细胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP的表达,并部分恢复（50μM AHL）或促进（30μM AHL）了AHL作用下成骨细胞的ALP染色或ALP活性。结论:AHL通过调控胞内Ca2+的释放方式,同时影响着成骨细胞凋亡和分化。50μM的AHL会诱导胞内Ca2+的瞬间爆发,导致成骨细胞发生不可逆的线粒体依赖的内源性凋亡反应,大量细胞死亡使成骨细胞代谢平衡被打破,分化功能被严重抑制。30μM的AHL诱导胞内Ca2+爆发程度减弱,引起的凋亡反应相对缓和,Ca2+回落到静息水平后开始匀缓慢的升高则有助于成骨分化信号的激活,加之AHL的促凋亡作用随着细胞培养时间的延长逐渐减弱,细胞活性逐渐恢复,从而出现部分节点的成骨分化增强。本实验采用的所用浓度的AHL在早期均导致成骨细胞不同程度的凋亡,且50μM AHL对成骨细胞分化的抑制作用贯穿实验始终。然而,本实验采用的AHL浓度仍相对较低,相比之下,在P.a被检出的感染中,P.a常常以生物膜的形式存在以逃避宿主免疫,受群体感应影响,生物膜中可产生高浓度的AHL;同时,在重症牙周炎或持续的根尖周感染病灶周围,成骨细胞已经受到了主要致病菌的损伤,处于炎症或免疫状态,这很有可能导致成骨细胞与AHL间的力量失衡,AHL通过干扰Ca2+信号扰乱成骨细胞的代谢平衡,加重骨破坏或使骨再生受阻。因此,对于重症牙周炎或持续型根尖周炎,重新审视机会致病菌以及其群体感应分子对骨的负向调控作用将为疾病的治疗带来帮助。
关键词: N-(3-氧代十二烷酰基)-L-高丝氨酸内酯 ；成骨细胞代谢 ；凋亡 ；分化 ；钙离子
被引量
1
摘要： 膜生物反应器(membrane bioreactor,MBR)具有占地面积小、出水水质高、易操作等突出优点,近年来发展迅猛,已经成为备受关注的废水处理工艺。但膜污堵的瓶颈问题制约了MBR技术的进一步发展。膜污堵是由于微生物在膜材料表面附着、聚集并形成生物膜(biofilm),而生物膜的形成受到细菌群体感应(quorum sensing,QS)机制的调控。QS是细菌通过细胞与细胞之间的分子通讯调控细菌群体行为(如生物膜的形成、生物发光、毒力因子的表达等)的现象。不同细菌产生不同类型的信号分子进行通讯,革兰氏阴性菌主要的信号分子为N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones,AHLs)、革兰氏阳性菌为自诱导信号肽(autoinducing peptide,AIPs)、而革兰氏阳性和阴性菌间共享的信号分子为自诱导物-2(autoinducer-2,AI-2)。
群体感应淬灭(quorum quenching,QQ)策略能通过干扰、破坏、灭活群体感应信号分子等方式干扰或抑制菌间通讯。近年来,QQ策略被证明能够有效抑制MBR中的QS(QQ-MBR),延缓MBR膜污堵的形成,有望从根本上解决膜污堵的问题,已经成为该领域的研究热点。前期QQ-MBR相关的研究较多关注单一类型信号分子的淬灭,但活性污泥中菌群构成复杂,信号分子类型多样,种内、种间QS并存。同时淬灭种内交流及种间交流信号分子是否能更有效的延缓膜污堵的形成有待研究。
红球菌Rhodococcus sp.BH4(BH4)和不动杆菌Acinetobacter sp.DKY-1(DKY-1)分别是当前QQ-MBR领域研究最为透彻的淬灭种内交流AHLs和种间交流AI-2的QQ菌。因此,本研究选取BH4和DKY-1为对象,探究了种内与种间群体感应淬灭细菌联用的MBR膜防污堵的效果,同时与单独QQ菌的膜防污效果进行了对比。
为此,本研究探究了QQ菌组合条件及优化、QQ菌联用对典型QS细菌生物膜形成的抑制作用、固定化保护后的QQ菌组合对实验室规模MBR膜防污堵的效果、以及对活性污泥微生物群落结构的影响,旨在全面分析同时阻断种内与种间交流时,QQMBR的有效性。主要研究结果如下:
BH4与DKY-1共存时没有明显的相互抑制或拮抗作用,能有效共存。BH4和DKY-1组合对典型QS细菌铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PAO1(AHL型)和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(AI-2)型的混合生物膜的抑制率高达85.67%,显著强于单一QQ菌。两株菌固定化保护后仍保持高信号分子降解活性,BH4微球与DKY-1微球最佳组合比为5:5。
组合QQ微球较单一QQ微球具有更强的膜防污堵能力。单一BH4微球、AI-2微球及组合BH4和AI-2微球分别将MBR膜污堵的形成时间延长了1.45倍、1.68倍和1.98倍。组合QQ-MBR中与生物污堵及生物膜形成有关的核心组分胞外聚合物(Extracellular polysaccharide,EPS)含量也显著低于单一QQ微球组。其中EPS中的蛋白质含量分别较单一BH4组、单一DKY-1组、空微球组及不含QQ微球的对照组中降低了15.52%、8.26%、33.84%及34.31%,多糖含量分别降低了26.01%、15.85%、42.48%及46.17%。此外,组合QQ-MBR活性污泥中的QS信号分子AHL也显著低于其它对照组,而污水处理的出水水质保持稳定,不受QQ微球的影响。
16S rRNA基因扩增子分析表明五组MBR之间菌群丰度及分布差异不显著(P>0.05)。五组MBR中得到有效注释的OTUs(operational taxonomic units)平均数量为1658个。组合QQ组中种内多样性分析(α多样性)指数Chao,Ace及Simpson指数均略高于其它对照组,而Shannon指数略低于其它对照组。表明组合QQ组中菌群均一度低于其它对照组。五组MBR之间具有共同的核心菌群,平均丰度最高的菌门,依次为变形菌门(Proteobacteria)(44.69%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(17.69%)、浮霉菌门(Planctomycetes)(11.04%)、酸杆菌门(Acidobacteria)(0.36%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(2.52%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)(1.88%)、拟杆菌门(Firmicutes)(1.28%)以及疣微杆菌门(Verrucomicrobia)(1.41%)组间多样性分析(β多样性)分析结果表明30天及75天时菌群组成具有显著差异(P<0.05),但五组MBR之间的差异性不显著,表明QQ菌联用总体菌群组成及分布不构成显著影响。
总之,本研究证明了种内与种间QQ菌联用比单一QQ菌膜生物污堵防控效果更佳,研究成果进一步拓宽了QQ-MBR技术,并为产业化应用奠定理论基础。
关键词: 膜生物反应器 ；膜防污堵 ；群体感应淬灭 ；信号分子 ；微生物群落
摘要： 群体感应(quorum sensing,QS)是一种由自身产生的小分子化合物介导的微生物通讯系统,它参与调控许多动植物病原细菌的致病过程,其中以酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactones,AHLs)介导的群体感应系统研究最为深入。群体感应淬灭(quorum quenching,QQ)是指通过干扰或阻断群体感应系统的正常通讯从而降低植物病原菌毒力的一种有效手段。目前从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等生防细菌中鉴定出许多经典的群体感应淬灭酶,这些经典的群体感应淬灭酶不需要进入到病原细菌中,可以通过直接降解环境周围的群体感应信号分子来实现群体淬灭达到防控病害的目的。 产酶溶杆菌OH11(Lysobacter enzymogenes OH11)是一株分离于辣椒根际土壤的革兰氏阴性生防细菌,它对许多病原真菌、卵菌引起的植物病害具有很好的防控作用,其中次生代谢产物HSAF(Heat-stable antifungal factor,HSAF)是主要的生防因子,然而目前对革兰氏阴性细菌的生物防治研究较少。产酶溶杆菌OH11不能直接降解AHL,但是它能通过Ⅳ型分泌系统向病原细菌体内注射Ⅳ型效应蛋白来抑制病原菌生长从而发挥生防效果。本研究以产酶溶杆菌OH11为研究材料,进一步探索了Ⅳ型效应蛋白是否可以作为一种天然的群体感应淬灭蛋白进入到受体菌体内,从源头上减少群体感应信号分子的产生从而实现种间群体淬灭。通过挖掘与鉴定新型的群体感应淬灭蛋白可为群体感应淬灭剂的开发和应用提供新材料,为植物病害的生物防治提供理论基础和基因资源。具体研究结果如下: (1)Ⅳ型效应蛋白LqqE1是一种产酶溶杆菌向病原细菌自然转运的“非经典”群体感应淬灭蛋白:实验室前期研究发现,产酶溶杆菌OH11基因组中编码了16个预测的Ⅳ型效应蛋白,本研究成功将其中13个Ⅳ型效应基因表达于具有典型AHL合成酶的荧光假单胞(Pseudomonas fluorescens)2P24中并检测对其AHL产量的影响。其中发现Le1288的表达能够显著抑制2P24中AHL的产生,并且对与OH11同生态位的假单胞菌A8(Pseudomonas chlororaphis)具有相同的AHL淬灭效果。因此本研究将Le1288定义为LqqE1(Lysobacter quorum-quenching effector 1)。进一步以OH11-2P24为工作模型证明了产酶溶杆菌OH11能通过Ⅳ型分泌系统将LqqE1直接转运到2P24的细胞质中,LqqE1不同于经典的群体感应淬灭酶,它不能直接降解AHL信号分子,而是通过与AHL合成酶Pco I相互作用,并进一步干扰Pco I与AHL合成底物SAM的结合来抑制AHL的产生。其中第68位的谷氨酸和第126位的丝氨酸对于LqqE1发挥AHL淬灭效果至关重要。接下来本研究以人类条件致病菌铜绿假单胞PAO1(Pseudomonas aeruginosa)以及植物病原菌青枯雷尔氏菌EP1(Ralstonia solanacearum EP1)为例,进一步证明了LqqE1在控制细菌毒力方面的潜力。研究发现LqqE1同样可以通过与PAO1中AHL合成酶Rhl I直接相互作用来抑制AHL的产生,并显著降低了Rhl I群体感应系统调控的毒力因子绿脓菌素以及鼠李糖脂的产生。同时,研究发现LqqE1也可以通过与EP1中AHL合成酶Ras I直接相互作用来抑制AHL的产生,并显著抑制了Ras I群体感应系统调控的swimming能力。 (2)LqqP1和LqqP2是产酶溶杆菌中新发现的“非经典”群体感应淬灭蛋白:为了进一步鉴定在OH11中其他的非经典群体感应淬灭蛋白。本研究以荧光假单胞2P24(P.fluorescens 2P24)中典型的AHL合成酶Pco I为诱饵靶标,建立了一个通过蛋白-蛋白互作直接“钓取”产酶溶杆菌OH11基因组中具有AHL淬灭效果蛋白的实验系统。通过该系统在产酶溶杆菌OH11中找到了一个基因Le0959,它在荧光假单胞2P24中的表达显著抑制了AHL的产生。因此,本研究将Le0959定义为LqqP1(Lysobacter quorum-quenching protein 1)。研究发现LqqP1同样不同于经典的群体感应淬灭酶,它通过直接与AHL合成酶相互作用,并减少体内AHL合成酶的蛋白丰度来抑制AHL的产生,其中第78位半胱氨酸对于LqqP1结合Pco I并抑制AHL的产生具有至关重要的作用。同时,研究发现LqqP1也能通过靶向铜绿假单胞菌PAO1(P.aeruginosa PAO1)中AHL合成酶Rhl I来减少Rhl I依赖的AHL产生,并且显著降低了Rhl I群体感应系统调控的毒力因子绿脓菌素、鼠李糖脂的产生以及运动性能力。本研究还发现LqqP1在产酶溶杆菌中不仅能够正调控生物膜的形成,而且还负调控抗真菌次生代谢产物HSAF的产生。同时,产酶溶杆菌能将LqqP1外泌至胞外。 此外,本研究还通过建立一个涉及比较基因组学、遗传筛选和生化研究的实验系统,在产酶溶杆菌OH11中鉴定到了另一个新型的AHL群体淬灭蛋白LqqP2。研究发现LqqP2也不同于经典的AHL降解酶,它能通过与多种AHL合成酶直接相互作用来抑制AHL的产生,其中包括来自荧光假单胞2P24(P.fluorescens 2P24)的Pco I、软腐果胶杆菌PccS1(Pectobacterium carotovorum PccS1)的Car I和变棕溶杆菌OH21(Lysobacter brunescenns OH21)的Lbs I。进一步研究发现LqqP2通过蛋白-蛋白相互作用减少了AHL合成酶Car I的蛋白丰度从而抑制了其AHL的产生,并且在PccS1中表达lqqP2显著降低了多种毒力相关的胞外酶产生,同时也显著影响了对大白菜的侵染能力。此外,第70位和第84位的精氨酸对于LqqP2发挥AHL淬灭作用至关重要。 综上所述,本研究表明产酶溶杆菌OH11中Ⅳ型效应蛋白LqqE1可以作为一种天然的非经典AHL群体感应淬灭蛋白,并证明了LqqE1在防控植物病害方面的生防潜能。此外,本研究还通过蛋白-蛋白互作、比较基因组学等方法鉴定了另外两种非经典的新型群体感应淬灭蛋白LqqP1与LqqP2。总而言之,本研究的发现可以为利用群体感应淬灭手段防控病害提供新材料和新思路。
关键词: 产酶溶杆菌 ；群体感应(QS) ；酰基高丝氨酸内酯(AHLs) ；群体感应淬灭(QQ) ；Ⅳ型分泌系统(T4SS)
摘要： 水产品是人类赖以生存的重要食物来源之一。随着水产养殖业的迅猛发展,微生物引起水产养殖病害日益突出,铜绿假单胞菌是一种重要的食源性病原菌以及水产品常见的腐败菌,除了健康后果之外,由铜绿假单胞菌引起的食物腐败可能给消费者和生产者带来巨大的经济损失。铜绿假单胞菌的致病作用与群体感应（quorum sensing,QS）密切相关。因此,从干扰细菌QS角度出发,寻找群体感应淬灭剂来干预细菌QS所参与或调控的生理活动,是控制微生物致病性的一条新途径。乳酸菌是一种安全有效的生物防腐剂,其作为群体感应淬灭（quorum quenching,QQ）菌的研究在国内外还十分鲜见。本文从自然环境中筛选具有N-酰基高丝氨酸内酯类（N-acylated homoserine lactones,AHLs）降解活性的乳酸菌,并对其进行生理生化反应和16S r DNA测序鉴定。利用气相色谱-质谱（GC-MS）分析活性乳酸菌对几种革兰氏阴性菌常见的AHLs信号分子的降解作用。此外研究ZHG 2-1粗提物（CE）处理对QS调控的胞外多糖、绿脓菌素、几丁质酶等毒力因子以及细菌运动的影响;定量实时聚合酶链反应（q RT-PCR）分析了ZHG 2-1 CE处理后对QS相关基因las I/R,rhl I/R表达的影响,流式细胞仪分析了ZHG 2-1 CE对铜绿假单胞菌感染后小鼠巨噬细胞毒力的影响。最后,通过96孔板法结合扫描电子显微镜（SEM）分析ZHG 2-1粗提物、阿奇霉素以及二者组合使用时对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用和预先形成的生物膜的清除作用。主要结果如下:1.应用96孔板法、琼脂扩散法从传统发酵食品、鱼类肠道及植物根部等生态环境分离的156株乳酸菌中筛选对铜绿假单胞菌群体感应AHLs信号分子具有较强降解活性的菌株。结果表明来源于阜新彰武酸黄瓜的菌株ZHG 2-1,降解活性最强接近100%,经生理生化反应和16S r DNA测序鉴定菌株ZHG2-1为面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum）。GC-MS分析结果表明,菌株ZHG 2-1 CE可以显著降解铜绿假单胞菌中两种常见的信号分子C4-HSL和3-oxo-C12-HSL,此外,对革兰氏阴性菌常见的几种AHLs信号分子如:C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL以及C14-HSL均具有较强的降解作用,对长链信号分子的降解活性强于短链信号分子。菌株ZHG 2-1 CE对铜绿假单胞菌的最小抑制浓度（MIC）为4.0 mg/m L,三个亚抑制浓度（sub-MIC）即1.0、2.0和3.0 mg/m L的ZHG 2-1 CE不影响铜绿假单胞菌的生长,并且对紫色杆菌产生的紫色菌素具有降解作用。2.评估菌株ZHG 2-1 CE在sub-MIC对铜绿假单胞菌的群体感应毒力因子以及运动性的影响。结果表明:质量浓度1.0、2.0和3.0 mg/m L的ZHG 2-1 CE对铜绿假单胞菌蛋白酶,几丁质酶,绿脓菌素,鼠李糖脂,海藻酸盐和胞外多糖的抑制率分别为28.37%-70.26%,29.63%-63.34%,42.16%-71.84%,25.36%-59.47%,24.25%-59.47,39.83%-79.54%。q RT-PCR反应分析表明,3.0mg/m L的ZHG 2-1 CE处理后,调控群体感应的基因las I/R和rhl I/R的表达下调,下调接近70%,其中rhl I的下调最为显著,接近80%。ZHG 2-1 CE对鞭毛介导的群集运动以及菌毛介导的泳动运动具有较强的抑制作用。以上所有效果均显示出剂量依赖性。此外,流式细胞仪分析结果表明,3.0 mg/m L菌株ZHG 2-1 CE可降低铜绿假单胞菌对小鼠巨噬细胞Ana-1细胞的毒力作用。3.通过96孔板法测定单独使用ZHG 2-1粗提物、阿奇霉素以及二者组合使用时对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用和预先形成的生物膜的清除作用。结果表明,阿奇霉素单独使用时,作用效果并不显著,ZHG 2-1单独使用具有一定的生物膜抑制作用,但是当二者组合使用时,ZHG 2-1粗提物可以显著提高阿奇霉素对生物膜的敏感性,sub-MIC处理的抑制率为58.4-90.3%。SEM图片结果表明,ZHG 2-1粗提物与阿奇霉素的组合可破坏生物膜的结构,并且减少预先形成的成熟生物膜的厚度,经过葡聚糖酶处理过的生物膜的细胞存活率进一步证实了上述结果。此外,ZHG 2-1粗提物与阿奇霉素单独使用以及组合使用时,对浮游细胞的存活没有影响。表明ZHG 2-1可以作为有潜力的抗生物膜制剂以及抗生素促进剂。
关键词: 面包乳杆菌ZHG2-1 ；铜绿假单胞菌 ；群体感应淬灭 ；毒力因子 ；生物膜
被引量
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摘要： 群感效应(Quorum sensing,QS)是细菌根据密度大小进行的细胞内或细胞间的信息交流(Cell-cell communication),协调群体行为和调控基因表达的一种重要的行为方式。N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHL)作为群感效应系统的信号分子,在其中起到重要作用。当环境中的AHLs的浓度达到一定阈值时,QS系统的相关基因的启动子才会被激活,进而调控其表达。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都受群体感应系统的调控。QS系统参与调控了许多重要的生物学功能:如参与抗生素合成、生物膜的形成、生物发光、生物群游现象和质粒结合转移等。在生活中,革兰氏阴性细菌是主要的致病菌,其致病因子就是通过细菌的群体感应系统来进行调控。铜绿假单胞菌(革兰氏阴性细菌)生成的生物膜也是受群体感应系统调控。其生物膜的生成与铜绿假单胞菌在机体内产生耐药性有很大的关系。在医疗实践上,当植入体进入人体之后会发生细菌感染的问题,其中一个主要原因是由于植入体表面形成了生物膜,阻止抗生素和杀菌药物的渗透以及免疫细胞对细菌的吞噬,从而导致植入体表面抗生素和机体免疫机制的失灵。因此在医疗植入物的特定表面抑制QS,有利于阻止生物膜形成,提高抗生素和机体对于黏附细菌的清除。AiiA基因是细菌群感效应的猝灭基因。苏云金芽孢杆菌中的AiiA基因表达产物为N-酰基高丝氨酸内酯酶(AHL-Lactonase),是一种具有降解AHLs分子能力的水解酶,能够降低相对封闭环境中的AHLs的量,导致革兰氏阴性细菌的群体感应系统被阻滞甚至破坏,从而极大地减弱致病菌的危害能力。这种方法有望成为生物防治革兰氏阴性病原菌的新手段。为了解决植入体表面细菌感染的问题,可以通过固定的N-酰基高丝氨酸内酯酶来降解或修改植入体特定区域的QS信号来实现。但进入人体游离的N-酰基高丝氨酸内酯酶会向不同周围环境扩散,从而影响其效果。通常,酶可以通过化学或物理手段固定化,通过修饰酶或支持物/载体来使彼此之间产生特定的相互作用,保持其浓度,例如亲和标签结合,载体上的吸附,包埋,交联,共价键。然而,常规融合标签之间的相互作用依赖于环境的pH,盐度和离子强度,这可能不适合标记酶的活性。本论文希望基于磁性蛋白MagR介导的AiiA酶的固定化,从而创立一种新的酶固定化方法,以克服蛋白质传统固定方法的缺点,从而用于预防和清除医疗植入体表面的细菌黏附。本文的研究结果如下:(1)AiiA-MagR重组蛋白的表达构建。将人工合成的AiiA基因与MagR基因的pET28a质粒进行酶切、连接、纯化等分子生物学操作,得到重组表达质粒pET28a[AiiA-MagR],并用菌落PCR、测序进行验证。对构建正确的重组质粒进行目标蛋白的诱导表达研究,并对表达条件进行优化(培养基、温度、时间、IPTG浓度),获得目标蛋白。(2)AiiA-MagR重组蛋白固定化研究及相关表征。优化表达后的融合蛋白与磁珠在室温下相互作用,得到IB@[AiiA-MagR]。SDS-PAGE电泳和BCA蛋白浓度法均证实蛋白确实结合在磁珠上。Zeta电势,FTIR光谱和SEM电镜结果也一致证实融合蛋白AiiA-MagR确实固定在磁性纳米颗粒(IB)上了。(3)IB@[AiiA-MagR]的酶活性和抑制生物膜功能的研究。通过定性和定量的CV026简单生物测定实验,证实IB@[AiiA-MagR]具有酶活性。在铜绿假单胞菌生物膜的实验中,证实了IB@[AiiA-MagR]存在抑制生物膜的功能,保留有AiiA蛋白的生物学活性。
关键词: 群体感应信号 ；水解酶 ；AiiA ；MagR ；磁固定
摘要： 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的院内感染菌,多种机制参与细菌致病性和耐药性的产生。N-乙酰高丝氨酸内酯（N-acyl Homoserine Lactone,AHL）是铜绿假单胞菌群体感应的（Quorum Sensing,QS）信号分子之一,包括las系统产生的N-（3-氧代十二烷基）-L-高丝氨酸内酯(3-oxo-C12-HSL,Od DHL)和rhl系统产生的N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯（C4-HSL,BHL）,对应的受体分别为Las R和Rhl R。AHL参与细菌毒力因子合成和生物被膜的形成,调节铜绿假单胞菌致病性和感染能力。本研究以AHL类似物T3为目标化合物,分析其对铜绿假单胞菌QS的抑制作用。
第一部分,检测T3对铜绿假单胞菌PAO1 QS相关表型的作用。T3抑制紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）CV026紫色色素合成(IC50=9.26±3.72μM)。然后研究T3对铜绿假单胞菌PAO1 QS的作用,结果表明,在不影响细菌生长的浓度下,T3抑制PAO1生物被膜形成、毒力因子的产生和swarming运动。此外,T3与妥布霉素具有协同作用,不仅增加生物被膜细菌对抗生素的敏感性,还通过抑制PAO1 QS系统,增加妥布霉素的作用效果,提高PAO1感染线虫（Caenorhabditis elegans）的存活率。同时T3不影响RAW 264.7细胞的增殖。上述结果表明T3抑制铜绿假单胞菌PAO1 QS。
第二部分,评估T3对铜绿假单胞菌临床分离株QS相关表型的作用。在不影响细菌生长的条件下,T3对三种临床分离株PA1、PA2、PA3生物被膜、绿脓菌素、swarming运动具有不同的抑制效果。在体内实验中,T3增加妥布霉素的作用效果,提高临床分离株感染线虫的存活率。上述结果表明T3抑制铜绿假单胞菌临床分离株QS。
第三部分,探究T3抑制铜绿假单胞菌群体感应的机制。T3抑制PAO1-las B-gfp和PAO1-rhl A-gfp的荧光,实时定量PCR结果显示T3抑制QS相关基因表达,分子对接结果表明T3对AHL受体LasR和RhlR有作用。以野生型及AHL受体缺失菌株Δlas R、Δrhl R为研究对象,研究T3在受体突变后的作用。在不影响细菌生长的前提下,T3对野生型及AHL受体缺失菌株的绿脓菌素、鼠李糖脂、弹性蛋白酶和生物被膜均有抑制作用,与野生型相比,T3对AHL受体缺失菌株抑制率降低。总之,T3通过与Las R和Rhl R的作用抑制铜绿假单胞菌QS。
综上所述,本论文以AHL信号分子作为药物靶点,研究AHL类似物T3对铜绿假单胞菌QS的抑制作用。结果表明,T3通过作用于Las R/Rhl R受体,抑制铜绿假单胞菌QS信号传导,同时增加妥布霉素的治疗效果。
关键词: 铜绿假单胞菌 ；群体感应 ；AHL类似物 ；QS突变型菌株 ；耐药性
被引量
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摘要： 细菌群体感应(Quorum sensing,QS)的通信机制在微生物和微生物群落中无处不在,调控生物群体活动增加其致病性与耐药性进而适应外部环境。近年来,以中草药成分作为群体感应抑制剂(Quorum sensing inhibitors,QSI)的研究成为干扰或阻断QS途径的主要方向之一。丹皮酚作为植物药的一种单体成分,来源于牡丹皮的小分子酚类化合物,具有多种药理作用,应用前景广阔。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)多功能性的代谢产物、内在和获得性抗生素耐药性、生物被膜的形成以及多种毒力因子的产生,使其成为临床医院主要机会性致病菌,可造成多种急性和慢性感染。由于铜绿假单胞菌中的QS系统调节其毒力因子和抗生素耐药性,研发靶向N-酰基高丝氨酸内酯(N-Acyl homoserine lactone,AHL)群体感应系统的新型抗菌药物,能为抗感染药物的研发提供可靠的参考。本课题靶向铜绿假单胞菌的QS系统,筛选具有AHL类群体感应抑制活性的中药单体,进一步研究丹皮酚作用于铜绿假单胞菌群体感应机制,研究内容如下:(1)丹皮酚对铜绿假单胞菌毒力因子的影响采用群体感应抑制剂筛选模式菌株紫色杆菌ATCC12472(C.violaceum ATCC12472)证实丹皮酚的群体感应抑制活性;测定丹皮酚对铜绿假单胞菌PAO1的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和生长曲线,探究亚抑菌浓度范围内丹皮酚对铜绿假单胞菌绿脓菌素、LasB弹性蛋白酶、LasA水解蛋白酶、鼠李糖脂产量的影响。结果显示,丹皮酚在128-512μg/mL对其生长没有显著影响;丹皮酚在128-512μg/mL时显著降低PAO1绿脓菌素、LasA水解蛋白酶、LasB弹性蛋白酶、鼠李糖脂的产生,且呈浓度和时间依赖性(p<0.05或p<0.01);(2)丹皮酚对铜绿假单胞菌生物膜的影响测定丹皮酚对铜绿假单胞菌的运动影响,结晶紫染色、银染法评估其对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响,扫描电镜进一步观察生物膜超微结构变化。丹皮酚(128-512μg/mL)显著抑制4株铜绿假单胞菌(PAO1、ATCC 27853、ATCC 9027和PAO3401)生物膜的形成和群集泳动(p<0.05或p<0.01),且不同菌株抑制作用效果不同,生物膜的致密性和结构被显著破坏,呈浓度依赖性;(3)丹皮酚对铜绿假单胞菌群体感应作用及机制研究采用报告菌株CV026检测丹皮酚对PAO1信号分子的影响,qPCR检测QS信号分子、毒力基因、生物膜和运动相关基因表达水平,以线虫感染模型评估抗感染作用。结果表明,丹皮酚128-512μg/mL)极显著抑制PAO1 AHL信号分子的合成和活性(p<0.01),显著降低QS信号分子lasI/R、rhlI/R、pqsA/R mRNA的表达量,显著抑制毒力基因phzA、phzM、phzH、phzS、lasA、lasB、rhlA、rhlC mRNA的表达量(p<0.05或p<0.01),显著降低胞外多糖调控基因pelA、pslB和运动基因fliA、pilA mRNA的表达量(p<0.05或p<0.01);丹皮酚(128-256μg/mL)提高受PAO1感染线虫的存活率;(4)丹皮酚对铜绿假单胞菌感染巨噬细胞的作用机制研究丹皮酚浓度低于256μg/mL对RAW264.7细胞活性无影响(p<0.01),建立铜绿假单胞菌感染巨噬细胞模型,随着细菌MOI值的升高和感染时间的延长,PAO1对巨噬细胞的黏附和侵入效率显著升高(p<0.05或p<0.01);基于QS系统,丹皮酚(32-128μg/mL)对PAO1感染巨噬细胞具有治疗作用,显著下调PAO1 QS信号分子lasI/R、rhlI/R、pqsA/R mRNA的表达量;显著抑制毒力基因phzA、phzM、phzH、phzS、lasA、lasB、rhlA、rhlC mRNA的表达量(p<0.05或p<0.01)。丹皮酚(32-128μg/mL)显著降低细胞上清液中释放的LDH含量,显著提高细胞活性并降低黏附率、侵入率,缓解细胞损伤(p<0.05或p<0.01);与PAO1模型组相比,丹皮酚治疗组(32-128μg/mL)显著抑制炎症因子mRNA的表达量,上调促炎因子mRNA的表达量(p<0.05或p<0.01);显著下调TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关基因的表达(p<0.05或p<0.01)。综上所述,丹皮酚下调QS系统信号分子、毒力基因、生物膜基因进而抑制毒力因子、运动和生物膜的形成。丹皮酚通过减弱铜绿假单胞菌的QS,缓解其诱导的细胞毒性损伤并提高细胞活力,抵抗铜绿假单胞菌的黏附和侵入,介导TLR4/MyD88/NF-κB信号通路进而抑制巨噬细胞调控的炎症反应。
关键词: 丹皮酚 ；铜绿假单胞菌 ；群体感应 ；生物膜 ；RAW264.7
被引量
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摘要： 近年来,随着抗生素的广泛应用,临床病原细菌的耐药性问题日益突出,己对人类健康构成严重威胁。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)作为一种革兰氏阴性机会致病菌,能够在临床中引发严重感染,是导致病人院内感染的第三大致病菌。由于其内在的高抗药性及获得性抗药性,由铜绿假单胞菌引发的感染己越来越难以治愈。研究铜绿假单胞菌的致病性和耐药机制,进而从新的角度防治铜绿假单胞菌引起的感染已变得极为重要。 铜绿假单胞菌的致病性受信号传递系统的调控。本研究涉及的与铜绿假单胞菌致病性相关的调控通路包括铜绿假单胞菌的群体感应调节系统、低于抑制浓度抗生素信号分子及自诱导信号分子AI-2(Autoinducer-2)。铜绿假单胞菌的致病因子受菌种特异的(Species-specific)高丝氨酸内酯(Acyl-homoserine Lactone, AHL)介导的群体感应系统(Quorum Sensing Systems, QSS)和以喹诺酮(Quinolone)为信号分子的群体感应系统的调节。铜绿假单胞菌拥有两个基于AHL的系统,一个是Las系统,另一个是Rhl系统,而基于喹诺酮的群体感应系统的信号分子为PQS (Pseudomonas Quinolone Signal)和HHQ (2-heptyl-4-quinolone)。抗生素除了传统的杀菌或抑菌功能外,低于抑制浓度抗生素也可作为细菌间相互作用的信号分子,参与铜绿假单胞菌的基因调控。研究还表明,细菌通用(Universal)群体感应系统的信号分子A1-2可以调控铜绿假单胞菌的致病性。这些信号传递系统不仅能够调控铜绿假单胞菌的致病性,它们之间也存在着相互作用。细菌细胞间相互作用方面的研究不仅有利于了解病原菌的致病机理,而且也是以此为靶点开发新型药物的重要基础。 本课题重点研究信号传递系统对铜绿假单胞菌致病性的调控机制以及信号传递系统之间的相互作用,其主要工作包括以下四个部分： (1)在低于抑制浓度抗生素对铜绿假单胞菌致病因子调控的研究中,由于前期研究表明,铜绿假单胞菌吩嗪化合物受低于抑制浓度四环素的调节。本课题在此基础上系统地研究了铜绿假单胞菌吩嗪合成受多种低于抑制浓度抗生素的调控作用。在基因组水平,利用饱和转座突变方法,筛选并研究了对吩嗪合成操纵子PhzA1B1C1D1E1F1G1(phzA1)和phzA2B2C2D2E2F2G2(phzA2)有调节作用的基因及其调控途径,尤其是与低于抑制浓度的壮观霉素调节相关的基因及调控途径。同时,以吩嗪合成操纵子为报道子,探索了群体感应调节系统与低于抑制浓度抗生素调节系统之间的关系。 实验发现,低于抑制浓度的壮观霉素(Spectinomycin, Spc)可以激活phzA1和phzA2操纵子的表达。在加入壮观霉素的条件下,phzA1的表达比不加壮观霉素时高出30倍,phzA2的表达则提高了4倍。在低于抑制浓度壮观霉素的调节机理研究中,通过筛选约30,000个转座突变体,在铜绿假单胞菌PAO1的全基因组中寻找到了参与壮观霉素调节phzA1/phzA2表达的基因。其中lasI、mvfR、vqsM、pqsE属于正调节phzA1和phzA2表达的基因,与已知结果一致。实验同时还筛选得到8个基因,这8个基因的突变不同程度地影响了壮观霉素对phzA1/phzA2的调节,表明这些基因可能参与这一调节过程。其中,基因ppk和基因pcnB被破坏之后,壮观霉素对phzA1的表达比不加壮观霉素时有明显的升高,基因ppk编码多磷酸激酶,而pcnB编码poly(A)聚合酶。在以phzA2为报道子筛选的转座突变体中,基因pilH、 pilY和pilX的突变使壮观霉素对phzA2的激活增加,并且这些基因都与IV型菌毛合成蛋白有关。基因algC突变之后,壮观霉素对phzA2的激活降低,该基因编码磷酸甘露糖变位酶。基因truA和基因rsaL突变之后,壮观霉素对phzA2的激活作用消失,即在该突变体中,加入壮观霉素和不加的条件下,phzA2的表达没有变化,truA是tRNA假尿嘧啶合成酶I的编码基因,而rsaL编码的产物是铜绿假单胞菌内与QS系统有关的调节蛋白。 (2)探究了铜绿假单胞菌群体感应调节系统对致病因子吩嗪合成操纵子调控的机制。现有研究表明,在铜绿假单胞菌PAO1的两个操纵子phzA1B1C1D1E1F1G1(phzA1)和phzA2B2C2D2E2F2G2(phzA2)中,大部分吩嗪合成是由操纵子phzA1负责完成。为进一步了解phzA1和phzA2在PAO1中的分工和不同调节系统对这两个操纵子作用的具体机制及其差别,本课题构建和收集了多个调节系统突变体,并通过实验在这些突变体中检验了两个操纵子表达的变化。结果表明在lasl/rhll和pqsR缺失的突变体中,phzAl和phzA2的表达均受到了抑制。而在双组分调控基因(Two-Component Regulatory System) gacA缺失的突变体中,phzA1的表达降低而phzA2的表达增强,从而表明gacA正调节phzA1而负调节phzA2。在△vqsR、ΔPA0011和ΔPA1243突变体中,phzA2受壮观霉素的调节增强,而phzA1受壮观霉素的调节作用不明显。上述结果揭示phzA1和phzA2调节系统的差异可能与这些基因相关。另外,在针对调节子LasR、RhlR以及PqsR与phzA1相互作用的研究中,发现调节蛋白LasR和RhlR并非直接结合在phzA1的启动子区域上的。 (3)相关研究表明操纵子phzA1上游的启动子区域含有一个las-box元件,是群体感应调节系统的调控应答元件。而实验室前期研究表明低于抑制浓度的四环素对phzA1的调控也依赖于这一元件,含有las-box启动子的表达比不加las-box时的表达有所升高。因此,本课题证实了las-box与四环素的直接作用,las-box作为phzA1基因表达的活性位点,同时也是四环素直接调节phzA1表达的元件,本研究结果进一步证实了群体感应调节系统与低于抑制浓度抗生素调节系统之间的关系。 (4)研究了信号分子AI.2对铜绿假单胞菌致病性的影响及其机理,结果表明加入外源的A1.2可对铜绿假单胞菌致病性产生重要影响。大鼠肺部感染动物模型实验结果显示,AI-2能够加重铜绿假单胞菌肺部感染对肺组织的破坏。与铜绿假单胞菌单独感染相比,AI-2的存在可使肺组织破坏程度加重。对AI-2作用机理的研究表明,AI-2能够调节铜绿假单胞菌中的Rhl系统,对基因rhlI、rhlR和rhlAB的表达有激活作用,同时还发现AI.2能够增加与Rh1系统相关的泳动能力。尽管A1-2能够激活Rh1系统中的主要基因,实验发现,当存在AI-2时,Rh1群体感应系统的信号分子C4-HSL对Rhl系统的激活作用降低。表明AI-2与Rhl系统中的信号分子C4-HSL具有竞争关系,从而使得AI-2存在的情况下,C4-HSL的活性降低。这些结果揭示AI.2对铜绿假单胞菌致病因子的调节很可能是通过Rhl群体感应系统实现的。
关键词: 铜绿假单胞菌 ；壮观霉素 ；吩嗪 ；自诱导信号分子 ；群体感应调
被引量
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摘要： 群体感应(Quorum-sensing,QS)是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种调节机制。铜绿假单胞菌中N-acylhomoserine lactone(AHL)类信号分子介导QS系统由lasI和rhlI合成的信号分子3-氧代十二烷酰高丝氨酸内酯(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone,3OC12-HSL)和N-丁酰高丝氨酸内酯(N-(butanoyl)-L-homoserine lactone,C4-HSL)以及各自的受体蛋白lasR、rhlR组成,它们以级联方式调控多个基因表达。
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate,PHA),是一类由多种微生物在碳、氮营养失衡的条件下作为碳源和能源贮存而合成的热塑性和生物降解性较理想的生物高聚物。Sun等研究发现调控系统信号分子的受体LuxR是哈氏弧菌合成PHB所必须的,初步表明细菌QS参与胞内PHA的合成。随后关于这方面的研究较少,目前文献报道只能间接的表明QS参与PHA的调控,因此,根据相关文献报道,我们以铜绿假单胞菌为材料,进一步研究QS系统与菌体合成PHA的关系。
本文利用铜绿假单胞菌PAO1及其QS突变株通过气相色谱、荧光定量PCR在生理和分子水平研究QS对聚羟基脂肪酸酯的调控。同时构建pphaC1:lacZ的转录融合结构,将含有该结构的报告载体转录铜绿假单胞菌PAO1及其lasI突变株中,检测QS缺失基因对phaC1转录水平的调控作用。为进一步确认PHA的生物合成是受QS系统调控,我们将含有lasI/lasR基因的穿梭载体分别导入QS突变株PAO55、PAO56。结果显示:1)铜绿假单胞菌PAO1中C4-HSL合成酶基因rhlI缺失突变株PAO210胞内PHA积累量与野生型无差别;而3OC12-HSL合成酶基因lasI缺失突变株PAO55、3OC12-HSL受体合成酶基因lasR缺失突变株PAO56以及lasI/lasR双缺失突变株PAO57胞内PHA含量与野生型相比明显减少;2)lasI和lasR的突变株体内PHA合成酶基因phaC1的表达量显著降低,信号分子3OC12-HSL回补实验使phaC1的表达量可恢复到野生株水平,但只可部分恢复lasI缺失导致的胞内PHA合成。3)通过对含有pphaC1:lacZ的转录融合结构PAO2和QS突变株PAO552菌株中β-半乳糖苷酶酶活性的检测,发现PAO552中β-半乳糖苷酶酶活明显低于野生型,表明在lasI基因缺失后,phaC1转录水平与野生型相比明显降低,间接说明QS对phaC1基因的转录具有正调控作用。4)通过基因回复,发现lasI/lasR基因互补突变株PAO551、PAO562胞内PHA含量可部分恢复,但未达到到野生株水平。
由此推测,铜绿假单胞菌群体感应系统中QS系统参与胞内聚羟基脂肪酸脂酯合成的调控。
关键词: 铜绿假单胞菌 ；细菌群体感应 ；聚羟基脂肪酸酯
被引量
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摘要： 目的：
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是一种重要的条件致病菌,是革兰阴性兼性厌氧非发酵菌。抗生素的广泛使用使细菌的耐药性越来越严重。PA的耐药主要分为天然耐药与获得性耐药。天然耐药由染色体介导,通常垂直传播给子代细菌,水平传播则很少或无。天然耐药性决定了一个菌种的野生表型。获得性耐药主要有三种机制：一是由于通透性降低或主动外排系统正调节导致到达靶位的抗菌药量减少；二是靶位修饰；三是产生p-内酰胺酶水解抗菌药物。基因的水平传播方式(horizontal gene transfer, HGT)是细菌之间互相交换或接受对方基因,接合(conjugation)是基因水平转移非常重要的途径。
群体感应系统(quorum sensing, QS)是细菌重要的信号系统,其作用机制为信号分子进入细胞内与胞内受体结合然后启动相关基因的表达。多种细菌通过感知某种信号分子的浓度来检测周围细菌群体的数量变化,当信号分子达到某一阈值后,就会与一些转录调节子结合,调节相关基因的表达以适应环境变化。根癌土壤杆菌质粒Ti的接合过程需要酰基高丝氨酸内酯(acylated homoserine lactones, HSL)参与,而HSL是QS系统重要的信号分子。课题组前期研究了HSL在铜绿假单胞菌接合反应中所起的作用,发现在HSL作用下,E. coli-PA接合反应频率增大,HSL通过调节多个接合相关基因的表达促进接合。
与HSL相比,抗生素对于细菌而言也是一种信号分子。《Nature》的一篇综述回顾了上个世纪的抗生素研究,认为抗生素是一种良好的探测器,能够帮助人们了解微生物的复杂性。另一方面,人们对于抗生素对于细菌的作用靶点相对了解的比较明确,而HSL涉及到全局的调控系统,具体的机制比较复杂,很难阐明。抗生素也是细菌的次级代谢产物或由其演变而来,抗生素对细菌的作用不仅仅是杀菌或抑菌那么简单。研究发现,细菌的耐药与抗生素的使用密切相关。随着抗生素使用的增加,细菌对抗生素的抗性也随之增加。这种情况不仅限于PA和E. coli等革兰阴性杆菌,革兰阳性球菌亦如此,如在减少红霉素的使用以后,发现A类链球菌抗生素抗性株数量减少。
SOS系统或者称为LexA调节子是微生物可诱导的DNA修复系统,lexA蛋白的调控网络系统帮助维持细菌DNA的完整性。已经证实亚抑菌浓度的抗生素可以激活SOS反应,有相关的文献报道抗生素对铜绿假单胞菌的作用与激活SOS反应相关。SOS反应跟细菌的接合的关系又是什么呢?细菌的接合这种生理行为涉及到细菌的很多调控系统,会不会与SOS的调控网络有很重要的相关性?我们有很多佐证,但是对于铜绿假单胞菌来说,详细的机制未明。本课题拟从铜绿假单胞菌临床常用的抗生素的亚抑菌浓度入手,先探索亚抑菌浓度的抗生素在铜绿假单胞菌的接合反应中所起到的作用。
众所周知,抗生素具有抑制乃至杀灭细菌的作用,那怎么推测它具有促进耐药基因水平转移的作用呢?其实这并不矛盾,因为抗生素发挥作用的前提是要达到有效药物浓度及作用时间。通常抗生素对细菌的作用具有浓度和时间依赖性,所以为达到抑制甚至杀灭细菌的作用,临床应用抗生素时需根据药物代谢动力学参数定时定量给药,以维持抗生素浓度大于最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)。然而,实际上有多种因素导致到达感染部位的抗生素仅达到“亚MIC"(sub-MIC)水平,其中不规范用药是一个重要原因；其次,细菌可形成了特殊结构,比如PA形成生物膜抵御抗生素；第三,人体器官的特殊结构,如血脑屏障可阻止某些药物进入脑室；第四,因药物在不同组织器官中的分布情况不同,以及受感染组织的血液供应欠佳等；第五,细菌虽然被人体吞噬细胞吞噬,但因机体免疫力较低而未被杀灭,反而吞噬细胞成为了细菌的庇护所。在亚MIC水平,抗生素杀灭不了细菌。
本课题拟从临床常用抗生素的亚抑菌浓度入手,探索亚抑菌浓度的抗生素在铜绿假单胞菌接合反应中所起的作用及相应的分子机制。
本课题拟从以下三方面展开研究：(1)首先优化课题组前期建立的供体菌E.coli与受体菌PA的接合模型,使之适合抗生素的处理研究；(2)观察比较抗生素对供体菌及受体菌的不同影响,然后研究亚MIC浓度抗生素对细菌接合反应的影响；(3)采用转录组测序技术(RNA-Seq)研究亚MIC抗生素作用下细菌的差异表达基因,筛选接合反应相关基因,进行相关通路的功能分析,并用荧光定量PCR验证转录组学的结果,从而全面阐明亚MIC抗生素对细菌接合反应的影响。
方法：
1.优化接合反应模型
①供体菌与受体菌
供体菌E. coli SM10λpir(pUCP24T),受体菌PAO1由美国罗切斯特大学Barbara H. Iglewski教授赠予。②滤膜杂交法与液体杂交法的比较
滤膜杂交法与液体杂交法在接合前增菌、药物处理等步骤是相同的,不同点体现在供体菌与受体菌定量混合后,前者放在滤膜上杂交2h,后者放在液体环境下杂交2h,最后计算接合效率。
③接合时间
接合时间的选择需要考虑影响实验结果的因素与整个实验的周期,前期处理,后续洗膜涂板,抗生素筛选,接合子长出后数板计数的时间等,尝试了1h、2h、4h。
④构建报告基因荧光检测法与数板菌落计数法的结果
荧光检测法用的是双质粒抑制系统,接合前不发光,接合后抑制性质粒丢失从而接合子中的质粒发光。菌落数板计数法用抗生素平板筛选接合子,24h后数板计数接合子的数量。
⑤接合相关的影响因素
主要考虑滤膜上的接合菌量、洗膜时间和稀释倍数这3个因素,设计两水平三因素正交试验进行实验。
2.抗生素的选择及处理方案
根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)指南的推荐,筛选临床使用的肠杆菌科与铜绿假单胞菌的A、B级药物,然后根据市场提供的抗生素标准品的情况选用替卡西林、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素、美罗培南和头孢毗肟这六种抗生素。因接合转移的主要元件在供体菌内,并经过试验的验证,实验中选择用抗生素处理供体菌E. coli SM10λpir(pUCP24T)。
3.观察抗生素对供体菌的作用及其对接合反应的影响,摸索最适的亚MIC浓度与处理时间
采用宏量肉汤稀释法与微量肉汤稀释法确定不同抗生素的亚抑菌浓度,绘制亚抑菌浓度抗生素处理的供体菌的生长曲线。因为抗生素处理的时间不同可分为两组：①在供体菌生长到对数期再用抗生素处理供体菌1h、2h；摇菌的总时间固定为10h；②从初始摇菌即用抗生素处理6h、8h、10h；观察接合效率的变化。
4.转录组测序
采用RNA-seq技术对不同亚抑菌浓度抗生素处理的供体菌E. coli SM10λpir(pUCP24T)的RNA进行测序和后续的功能性分析,包括亚抑菌浓度抗生素对接合的影响,对细菌的其它的调节作用及其可能产生的对宿主的影响。
5. qPCR检测E. coli接合相关基因的表达
采用不同亚抑菌浓度环丙沙星与左氧氟沙星处理供体菌6h、8h、10h,提取RNA逆转录为cDNA。采用荧光定量PCR检测接合相关基因traI、traG和参考基因araC的表达。
结果：
1.洗膜时菌体的稀释倍数是影响接合反应的主要因素,供、受体菌的接种量和洗膜时间是次要因素。接合实验的最佳条件为：洗膜时菌体的稀释倍数为240倍,滤膜上供、受体菌的接种量为30μL,洗膜时间为2min。接合反应的最适时间为2h。
2.抗生素的处理：
分别用替卡西林、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素、美罗培南、头孢吡肟来处理供体菌,我们以低于最低抑菌浓度的五个相对稳定的1、2递减的亚抑菌浓度1/2m、1/4m、1/8m、1/16m和1、32m为选择标准,留取了每个抗生素处理供体菌的五个亚抑菌浓度的样本做接合实验,经过计算,环丙沙星与左氧氟沙星这两种抗生素随着亚抑菌浓度的梯度变化,接合效率呈现出了规律性的变化。然而在供体菌生长到对数期时再用抗生素处理供体菌1h或2h,未能像抗生素处理10h那样呈现出规律性的变化。
3.选择环丙沙星与左氧氟沙星处理供体菌,在抗生素处理6h、8h、10h时收取菌体做接合实验,观察接合效率,结果是：随着亚抑菌浓度的变化接合效率的差异在6h未体现出,而在8h时有着比较明显的差异：随着亚抑菌浓度的增高,接合效率也增高,对照组未加抗生素处理组接合效率最低。10h接合效率与8h的变化趋势一致。
4.转录组测序的结果：采用生物信息学对转录组测序的结果进行分析,发现可将环丙沙星、左氧氟沙星作用下供体菌E. coli SM10λpir(pUCP24T)中RP4质粒相关基因的差异表达聚类为10类,部分基因表达模式一致,呈现随抗生素浓度下降而下降的趋势,重点关注了四型分泌系统(type Ⅳ secretion system, T4SS)相关的基因。5.采用不同亚抑菌浓度环丙沙星与左氧氟沙星处理供体菌6h、8h、10h,留取接合效率稳定的样本做荧光定量PCR,发现traI、traG这两个基因的表达变化较为明显。抗生素处理6h时,traI、traG的表达随着亚抑菌浓度呈上升趋势,抗生素处理8h时traI、 traG的表达明显升高,差异均有显著的统计学意义(P<0.01)
结论：
1.成功优化了接合模型。
2.亚抑菌浓度的环丙沙星与左氧氟沙星可以促进大肠埃希菌与铜绿假单胞菌之间的接合反应效率。
3.转录组测序的结果证明亚抑菌浓度的抗生素对接合反应有重要的影响,集中体现在RP4质粒接合相关过程。
4.荧光定量PCR的结果证明亚抑菌浓度的抗生素能够上调接合相关基因traI和traG。
关键词: 铜绿假单胞菌 ；大肠埃希菌SM10λpir(pUCP24T) ；亚抑菌浓度 ；接合反应
被引量
8
摘要： 目的：
细菌与细菌之间存在交流,许多种类的细菌可以根据特定信号分子的浓度来监测周围环境中自身或其它细菌的数量变化,当环境中信号分子达到一定浓度阈值时,信号分子进入细胞内与胞内受体结合启动相关基因的表达来适应环境的变化,这一调节体系即为细菌群体感应系统(Quorum Sensing System, QS)或密度感应系统,也称自诱导(autoincer, AIs)[1]。
在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)中,至少存在两套基于AHLs(Acyl-homoserine lactone,或HSL,即高丝氨酸内酯)调节的QS系统：一种是控制细胞外毒力因子表达的1as系统,另一种是控制几种二级代谢所需产物的rhl系统。las系统由LasR和Lasl组成,rhl系统则由RhlR和RhlI组成。LasR和RhlR为信号分子受体,而LasI和RhlI则分别是HSL信号分子N-3-oxododecanoyl-L-homoserinelactone(3-oxo-C12-HSL或OdDHL)和N-butanoyl-L-homoserinelaetone(C4-HSL,或BHL)的合成酶,分别由lasI和rhlI基因编码合成。QS系统中,存在着一定的级联关系,有研究表明las系统在这种级联关系中处于最高层,可以激活另外一些调节器的转录表达,如RhlR/RhlI;在QS这个调控的关系网中,Las系统的作用是最主要的,它能调控Rhl,使3-oxo-C12-HSL的分泌不受C4-HSL的影响。
PA是一种临床常见的革兰阴性条件致病菌,随着抗生素的广泛应用和不合理使用,使得PA对抗生素的耐药程度日趋严重,泛耐、全耐的PA层出不穷,给临床PA感染的治疗带来了极大的困难,PA的耐药主要由两种机制引起：一是染色体上结构基因发生点突变、插入或缺失,引起编码的蛋白质氨基酸序列发生改变,导致对抗菌药物的敏感性降低或丧失,如外膜孔蛋白OprD2缺失、青霉素结合蛋白靶位改变等；二是通过细菌间耐药基因水平转移(horizontal gene transfer, HGT)获得耐药基因。耐药基因水平转移方式有转导、转化和接合,而接合(conjugation)是耐药基因水平转移的一个主要方式,调节接合转移的机制很多,但目前尚不十分清楚。有研究表明,酰基高丝氨酸内酯(acylated homoserine lactones, HSL)在根癌土壤杆菌Ti质粒的接合转移中起重要作用,但在PA耐药基因水平转移中是否发挥作用尚未见报道。
为给研究HSL在铜绿假单胞菌中接合反应中的作用奠定更好的基础,本实验分别对PA01菌株lasI、rhlI基因进行单、双突变,构建突变菌株,并在此基础上研究HSL对接合反应频率的影响。
方法：
1.构建PA01lasI、rhlI基因分别单、双缺失突变的菌株采用同源重组的方式,首先通过PCR扩增lasI、rhlI的上下游片段,分别插入pMDl8、pUCl9,然后在此基础上插入正向筛选标记庆大霉素耐药基因(GM)、反向筛选标记蔗糖敏感基因(sacB)以及接合转移基因(mob),构建带有同源片段的自杀性质粒pGSM-△lasI和pGSM-△rhlI。通过接合转移的方式将质粒pGSM-△lasI转入PA01可获得lasI单突变菌株,将质粒pGSM-△rhlI转入PA01可获得rhlI单突变菌株,再将pGSM-△lasI转入rhlI单突变菌株中则可获得双突变菌株。
2.突变菌株的鉴定首先,设计lasI、rhlI基因的外引物,通过PCR对同源重组的菌株初筛并测序确定；其次,合成生物素标记的探针,采用southern blot对lasI基因单突变的菌株实行进一步确证；再次,建立高效液相色谱串联质谱(HPLC/MS)检测HSL的方法,从基因表达方面来验证lasI、rhlI基因缺失后HSL信号分子分泌情况。
3.建立E.coli-PA接合反应模型,研究HSL对接合反应频率的影响采用滤膜杂交法,E.coliSM10λ pir(pUCP24T)分别与PA01,PA-△lasI、 PA-△rhlI、PA-△lasIrhlI进行接合反应,通过平板菌落计数法计算接合反应频率。
结果：
1.构建自杀性质粒pGSM-△lasI,pGSM-△rhlI,lasI基因缺失菌株PA-△lasI,rhlI基因缺失菌株PA-△rhlI,以及lasI、rhlI双缺失菌株PA-△lasIrhlI。并通过PCR及基因测序、Southern blot证实突变菌株构建成功。
2.通过HPLC/MS检测HSL,PA-△lasI菌株中未检测到3-oxo-C12-HSL且C4-HSL也低于检测限；PA-△rhlI菌株中检测到3-oxo-C12-HSL正常产生且与PA01比较无差异(P>0.05),但C4-HSL检测不到；PA-△lasIrhlI菌株中3-oxo-C12-HSL与C4-HSL均检测不到。3-oxo-C12-HSL在与C4-HSL在6h时开始检测到,且随着时间增加,C4-HSL的量逐渐增加,而3-oxo-C12-HSL则基本保持稳定。加入2u g/mL阿奇霉素(AZM)后,3-oxo-C12-HSL与PA01组相较明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),C4-HSL量有减少趋势但与PA01比较差异无统计学意义(P>0.05)。
3.在E.coli-PA接合反应中,PA-△lasI、PA-△rhlI、PA-△lasIrhlI的接合反应频率较PA01组降低(P<0.05)。
结论：
1.成功构建lasI、rhlI基因单、双突变菌株PA-△lasI、PA-△rhlI及PA-△lasIrhlI。
2.lasI基因位于rhlI基因的上游并对其有调控作用,当lasI基因缺失突变后,菌株不仅不再合成3-oxo-C12-HSL,而且C4-HSL的量也明显减少。rhl7基因缺失后,C4-HSL合成被阻断,但3-oxo-C12-HSL的合成并未受影响。lasI、rhlI双缺失后HSL信号分子在相应基因缺失后分泌明显减少。2u g/mL AZM能抑制HSL的分泌。
3.在PA-E.coli接合反应中,本实验构建的突变菌株PA-△lasI.PA-△rhlI及PA-△lasIrhlI与PA01组比较,HSL信号分子量明显减少,其接合反应频率也均降低,这可能是因为HSL在PA的接合转移中起了重要作用,但具体的机制还有待进一步研究。
关键词: 铜绿假单胞菌 ；群体感应系统 ；同源重组 ；高丝氨酸内酯 ；自杀性质粒 ；接合反应
被引量
2
摘要： 目的:铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是常见医院获得性感染条件致病菌,常在机体免疫力低下,囊性纤维化,大量使用抗生素等人群中引起各种急慢性感染,且病情迁延难治[1]。PA与宿主免疫细胞相互作用介导免疫逃逸是PA致病的重要方式。树突细胞（dendritic cells,DCs）是人体专职的抗原递呈细胞（Antigen presenting cells,APC）[2],能摄取、加工及提呈抗原,刺激辅助性T细胞（T Helper cells,Th）的增殖与极化,是启动、调控、维持Th细胞免疫应答的中心环节[3]。DCs与外来抗原相互作用后,将外来抗原加工处理形成MHCII-抗原肽复合物提呈给Th细胞,提供Th细胞活化的第一信号。同时,DCs表达的协同刺激分子CD40和B7（CD80、CD86）,与Th细胞表面的CD40L和CD28结合,提供Th细胞活化第二信号。另外,DCs分泌的细胞因子提供Th细胞活化第三信号,多种信号共同调节Th细胞极化。在各种病理条件下,如慢性感染,病原菌通过抑制DCs表面信号分子和细胞因子的表达而阻碍DCs成熟,使DCs逐渐被"驯化"成具有免疫抑制功能的DCs,导致Th细胞极化为抑制性T细胞（如Th2细胞和调节性T细胞）,导致病情进展和反复发作[3]。因此,深入了解PA对DCs成熟的影响有助于理解Th细胞极化机制,从而揭示PA免疫逃逸的机理。N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(N-3-Oxododecanoyl-L-homoserine lactone,3-O-C12-HSL)是PA群体密度感应（Quorum Sensing,QS）系统分泌的一种重要的病原体相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns,PAMPs）[4],可调节细菌耐药、毒力基因的表达和宿主免疫功能。3-O-C12-HSL是一种脂溶性小分子物质,具有膜通透性,在PA致病过程中,可自由扩散直接通过细胞膜进入宿主细胞内,调节宿主功能[5]。陆续有研究表明信号分子3-O-C12-HSL可调节中性粒细胞[6]、淋巴细胞[7]和巨噬细胞[8]等多种免疫细胞的功能,影响机体的免疫防御能力。我们前期证实3-O-C12-HSL调节人单核细胞衍生树突细胞（Monocytes derived dendritic cells,Mo-DCs）的成熟与功能。我们发现:第一,3-O-C12-HSL下调LPS诱导的人Mo-DCs表面分子CD40、CD80和HLA-DR表达水平,促进Mo-DCs分泌IL-10,抑制Mo-DCs分泌IL-12[9,10]。第二,3-O-C12-HSL处理的Mo-DCs抑制CD4+Th细胞增殖,促进CD4+Th细胞分泌IL-4,抑制IL-12和IFN-γ的分泌,表明3-O-C12-HSL通过Mo-DCs促进CD4+T细胞向Th2方向极性分化[9]。第三,3-O-C12-HSL通过Mo-DCs促进CD4+Th细胞分泌IL-10和TGF-β,3-O-C12-HSL通过Mo-DCs促进CD4+T细胞向CD4+CD25+Foxp3+ Tregs方向极性分化[10]。前期研究结果表明3-O-C12-HSL通过阻碍Mo-DCs成熟影响CD4+1细胞极性分化,参与免疫逃逸,但3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟的相关分子机制尚不完全清楚。近期,Cooley[11]等以人支气管上皮细胞为细胞模型,发现3-O-C12-HSL干扰过氧化物酶增殖物激活受体 γ（peroxisomeproliferater-activated receptorγ,PPAR γ）与其配体罗格列酮（Rosiglitazone,ROS）的结合,提示3-O-C12-HSL可能与PPAR γ相结合。另外,在Mo-DCs中,PPAR丫与配体结合引起的生物学效应与3-O-C12-HSL对Mo-DCs的调节作用相一致[12]。为此,我们认为在Mo-DCs中,3-O-C12-HSL通过与PPARγ相结合而激活PPAR γ,进而通过PPAR γ下游信号通路调节信号分子表达水平,阻碍Mo-DCs成熟并调节Th细胞极化。DCs的成熟状态和功能与众多基因的表达水平和细胞增殖分化密切相关[13],而长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）可在转录及转录后水平调控基因表达,调节细胞的增殖与分化[14]。因此,不难推测lncRNA能调控DCs的成熟与功能。为此,我们研究了 3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化情况,以lncRNA lnc-DC为候选lnc-RNA,探讨了 3-O-C12-HSL对lncRNA lnc-DC表达水平的调节作用是否由PPAR γ介导。总之,本研究探讨了PPAR γ与lncRNA在3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟中的作用。本课题的研究意义在于从PA与宿主免疫细胞相互作用的角度阐明PA免疫逃逸的相关机制,进一步丰富PA的致病机理,为PA感染的预防和治疗提供新思路。方法:1.配体筛选实验检测3-O-C12-HSL与PPAR γ直接结合。将荧光标记的PPAR γ天然配体和PPAR γ混合后加入不同浓度的3-O-C12-HSL样品,检测各组的偏振光值。2.检测 3-O-C12-HSL 对 Mo-DCs 中 PPAR γ mRNA 的影响。3-O-C12-HSL 处理 Mo-DCs,荧光定量PCR技术检测PPAR γ mRNA的表达水平。3.检测3-O-C12-HSL通过PPAR γ对Mo-DCs成熟的影响。用PPAR γ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs,再用3-O-C12-HSL处理Mo-DCs。流式细胞术检测Mo-DCs的吞噬能力和表面分子CDla,CD40,CD83,HLA-DR和CD80表达水平。酶联免疫吸附实验和电化学发光法检测Mo-DCs培养上清的细胞因子IL-10、IL-12和IL-6浓度。4.检测3-O-C12-HSL通过PPAR 丫对Mo-DCs功能的影响。用PPAR γ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后加入3-O-C12-HSL,处理的Mo-DCs与CSFE标记的CD4+Th细胞共培养,流式细胞术检测CD4+Th细胞的增殖,酶联免疫吸附实验检测混合培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-4表达水平。5.检测3-O-C12-HSL通过PPAR γ对Mo-DCs中JNK MAPK信号通路的影响。用PPARγ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs,再加入3-O-C12-HSL。免疫迹印实验检测JNK1/2和p-JNK1/2表达水平。6.检测3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化。用lncRNA基因芯片检测了 3-O-C12-HSL处理后Mo-DCs中lncRNA,通过生物信息学技术对差异lncRNA进行聚类分析。荧光定量PCR技术鉴定候选lncRNA lnc-DC的表达水平。7.检测候选lncRNA lnc-DC表达水平是否由PPAR γ介导。用PPAR γ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后加入3-O-C12-HSL,定量PCR技术检测lnc-DC表达水平。8.预测lncRNA lnc-DC启动子区域结合的转录因子,荧光定量PCR技术检测C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平是否由PPAR γ介导。用PPAR γ特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后加入3-O-C12-HSL,定量PCR技术检测C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平。结果:1.配体筛选实验显示3-O-C12-HSL大于4.60 μ mol/L时竞争性结合PPAR γ配体结合区。2.荧光定量PCR实验发现3-O-C12-HSL下调LPS处理的Mo-DCs中PPAR γ mRNA的表达。3.3-O-C12-HSL 下调 LPS 诱导的 Mo-DCs 表面 CD40,CD83,HLA-DR 和 CD80 表达水平。与3-O-C12-HSL实验组相比,GW9662能部分逆转CD40和CD83表达水平,CD1a、CD80 和 HLA-DR 无统计学差异。3-O-C12-HSL 抑制 Mo-DCs 表达 IL-6 和 IL-12,促进Mo-DCs表达IL-10。GW9662能部分逆转3-O-C12-HSL抑制Mo-DCs表达IL-6,未能逆转3-O-C12-HSL 对 Mo-DCs 表达 IL-12 和 IL-10。4.3-O-C12-HSL下调LPS诱导的Mo-DCs抗原吞噬能力,GW9662能部分逆转3-O-C12-HSL介导的抗原吞噬能力下调。3-O-C12-HSL处理的Mo-DCs下调CD4+Th细胞的增殖。GW9662未能恢复3-O-C12-HSL通过Mo-DCs对CD4+Th细胞的增殖的下调作用。3-O-C12-HSL处理的Mo-DCs抑制CD4+Th细胞表达IFN-γ,促进CD4+Th细胞表达IL-4。GW9662能部分逆转3-O-C12-HSL通过Mo-DCs抑制CD4+Th细胞表达IL-4。GW9662能部分恢复3-O-C12-HSL通过Mo-DCs促进CD4+Th细胞表达IFN-γ。5.3-O-C12-HSL下调LPS诱导的Mo-DCs中p-JNK1/2表达水平,GW9662部分逆转3-O-C12-HSL 抑制 Mo-DCs 中 p-JNK1/2 的表达水平。6.与LPS模型组相比较,3-O-C12-HSL实验组筛选出2倍以上表达差异的lncRNA有1386条,其中548条表达上调,838条表达下调。表达差异5倍以上lncRNA共153条,其中22条表达上调,131条表达下调。散点图发现2倍表达差异的lncRNA总体分布呈集中趋势。聚类分析发现5倍表达差异的lncRNA能根据处理因素进行有效的分层聚类。7.lncRNA基因芯片筛选实验中,3-O-C12-HSL下调LPS诱导的Mo-DCs中lnc-DC的表达水平。荧光定量PCR实验发现,LPS诱导后,lnc-DC表达水平显著上调（19.6倍）。在此基础上,添加5 u mol/L、10 μ mol/L和25 μ mol/L的3-O-C12-HSL处理后,lnc-DC的表达水平受到抑制（分别下调0.64倍、0.61倍和0.50倍）。进一步添加GW9662又能部分逆转3-O-C12-HSL对lnc-DC表达的抑制作用。8.3-O-C12-HSL下调Mo-DCs中C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平,其作用方式依赖于PPAR γ,提示3-O-C12-HSL可能通过C-Fos和C-Jun调节lnc-DC表达水平。结论:1.3-O-C12-HSL直接与PPAR γ相结合,下调PPARγmRNA表达水平。2.3-O-C12-HSL通过PPAR γ部分调节Mo-DCs的成熟与功能。3.3-O-C12-HSL作用于Mo-DCs后,lncRNA表达谱发生特征性变化。4.3-O-C12-HSL下调lncRNA lnc-DC表达,其作用方式依赖于PPARγ。5.3-O-C12-HSL下调C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平,其作用方式依赖于PPAR-γ。
关键词: N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯 ；过氧化物酶增殖物激活受体Y ；长链非编码RNA ；树突状细胞 ；铜绿假单胞菌
被引量
1
摘要： 草绿色链球菌(Viridans Streptococci, VS)作为口腔、上呼吸道、胃肠道的常驻菌群,早期被认为是人体正常菌群的组成部分。但近年来VS引起的口腔颌面软组织、生殖道感染、心内膜炎等的病例不断增多。最常见VS全身性感染——感染性心内膜炎,可以由牙科治疗,甚至刷牙导致的VS一过性菌血症产生,并引发体内免疫反应；VS也是癌症、骨髓移植、免疫缺陷肺炎等患者重要的感染源,当感染造成败血症时常常引发感染性休克导致死亡；牙源性间隙感染为常见颌面部严重感染之一,可继发海绵窦血栓性静脉炎、脑脓肿、败血症、纵膈炎等严重并发症,危及患者生命,而VS现在被视为牙源性间隙感染常见病原菌之一,参与了深部脓肿的形成。近年来牙周炎与冠心病的相关性研究显示：VS可促进血小板聚集,加快血凝,形成血栓,从而可能引发低血性心血管疾病的发生。其机制可能是VS分泌血小板聚集相关抗原(platelet aggregation-asso-ciated protein, PAAP),与血小板聚集有关；PAAP是一种毒力因子,还可充当热休克蛋白促发自身免疫反应而引发早期动脉粥样硬化损伤。VS及其代谢产物还可诱导脉管细胞异常增殖,影响和改变脉管细胞生理功能,直至细胞死亡进而促发局部急性缺血。而且VS通常处于斑块不稳定部位,可能影响粥样斑块的进展,预示斑块的破裂,触发急性冠脉综合征或缺血性中风。近年来监测报告显示：VS对常用抗生素药物敏感性均有明显降低,其中青霉素耐药率达到22.4%,头孢唑啉耐药率为17.9%,呋喃妥因、利福平耐药率近50%,环丙沙星、四环素、克林霉素、复方磺胺甲噁唑、红霉素耐药率60%-80%以上。2009-2012年国内权威监测报告显示：VS对β-内酰胺类抗生素的耐药率超过了高致病性β-溶血性链球菌。耐药VS的快速出现,导致临床筛选敏感抗生素压力增大,感染治疗困难,病程迁延。自然界中90%以上的细菌以生物膜(bacterial biofilm, BF)的形式生活,超过65%的人类细菌感染与生物膜有关。生物膜能通过多种机制对膜内细菌起屏障保护作用,避免或减少药物和机体免疫系统对细菌进行处理,显著增加生物膜细菌的致病力与耐药性。研究亚急性心内膜炎发现：VS能够在受损心内膜表面形成类似生物膜的细菌赘生物；邹彬彬等在尿路感染患者导尿管内获得了VS生物膜,该生物膜的耐药性超过浮游菌。上述研究提示VS具有形成生物膜的能力,生物膜是VS耐药的重要影响因素。目前认为生物膜细菌耐药机制包括：(1)生物膜屏障机制,即胞外多糖基质阻止抗生素药物接触生物膜细菌;(2)营养限制,即生物膜细菌生长速度减慢,膜内营养物质、氧气的消耗以及代谢废物的聚集促使细菌进入一种非生长状态,该状态下细菌对抑制其生长的抗生素药物几乎完全不敏感；(3)β-内酰胺酶,细菌产生的β-内酰胺酶在生物膜表面基质内高浓度聚集,迅速水解渗透进入的β-内酰胺类抗生素,有效保护深部细菌不被β-内酰胺类抗生素药物灭活；(4)密度感应,细菌通过监测群体细胞密度来调节特定的基因表达,以保证生物膜中营养物质的运输和废物的排出,避免细菌过度生长而造成空间和营养物质缺乏。密度感应(Quorum Sensing, QS)是一种根据密度对细菌基因表达进行调控的机制。自体诱导物(Autoinducer, AI)信号分子由细菌在胞内合成,分泌至胞外环境：自体诱导物的浓度随着生物膜中细菌数量的增加而不断升高。细菌通过对外环境中自体诱导物浓度的感应而进行周围细菌“计数”；当自体诱导物浓度达到阈值,AI与细菌表面信号受体蛋白结合,直接或间接调控细菌目的基因表达。细菌密度感应调控普遍存在于G+、G-细菌中,生物膜结构的稳定、细菌毒力因子表达、耐酸性和耐药性都受AI信号分子的调控。在感染建立过程中发挥重要作用,因此干扰密度感应调控降低生物膜细菌致病力与耐药性,从而用较低的抗生素浓度治疗或通过宿主防御系统自然消除感染已经成为目前研究的一个主要热点。常见QS调控机制可分为三种类型：①G+细菌QS调控以寡肽类物质作为信号分子,寡肽信号分子是前导肽在细菌细胞内经过修饰处理而成,细菌种属不同形成的寡肽类物质不同,ATP结合区(ATP-binding cassette, ABC)转运系统负责细菌体内寡肽信号分子的输出,双组份识别系统负责感应寡肽信号分子；②G-细菌中存在Luxl/LuxR QS调控机制,酰基高丝氨酸环内酯类物质(acyl-homoserine lactone, AHL)作为信号分子,即AI-1; LuxⅠ类蛋白酶是AI-1合成所必需的,LuxR类结合蛋白则进行AI-1的识别和基因调控；③G+、G-细菌中共同存在的信号分子,呋喃酰硼酸二酯(furanosyl borate diester),即AI-2信号分子,其合成主要依赖LuxS基因编码的LuxS蛋白酶。寡肽信号分子和AHL信号分子主要介导细菌种内信号识别,AI-2则是细菌种间交流的通用信号分子。AI-2信号所控制的细胞间信息交流已被证实在细菌生长过程中发挥重要作用,影响生物膜的形成、发展及其功能发挥。对牙周病致病菌培养液的检测显示AI-2信号分子的存在,任一细菌AI-2信号分子的产生都有助于种间交流和混合种生物膜的形成。LuxS基因广泛存在于不同细菌,高度保守。LuxS基因编码的蛋白酶是AI-2合成的必需催化物,LuxS基因被认为是合成AI-2信号分子的标志性基因。AI-2信号分子,呋喃酮酰硼酸二酯(furanosyl borate diester),其双五圆环结构具有对称性,腺苷甲硫氨酸(SAM)是其合成的起始底物,中间产物为S-核糖基同型半胱氨酸(SRH),AI-2信号分子前体物,4,5-二羟基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2, 3-pentanedione, DPD)则由LuxS蛋白酶催化SRH形成,最后在硼离子作用下发生重排,形成AI-2。A1-2信号分子与细菌胞膜上的跨膜蛋白受体胞外区结合,自激酶活性磷酸化跨膜蛋白受体胞浆区,激活胞内同源调控因子,调控特定基因的表达。研究变异链球菌生物膜证实：可以通过LuxS基因突变干扰AI-2密度感应信号,影响生物膜的形成和耐酸性。另有研究指出AI-2密度感应信号对革兰阴性沙雷氏菌、铜绿假单胞菌成熟生物膜的抗生素敏感性具有重要影响。本研究通过敲除VS多药耐药野生株LuxS基因,阻断LuxS/AⅠ-2密度感应信号分子合成,干扰VS生物膜细菌密度感应调控,影响VS生物膜形成和耐药性：探讨LuxS/AⅠ-2密度感应信号在VS多药耐药野生株生物膜形成,p-内酰胺类、喹诺酮类及四环素类抗生素药物耐药中的作用与机制；从分子水平理解VS生物膜形成和耐药的产生,为降低细菌致病力,治疗生物膜感染,提供新思路、新途径和新靶标。第1章VS多药耐药野生株的分离与鉴定目的 获得研究所需目标菌株——草绿色链球菌多药耐药临床分离野生株。方法临床标本通过血平板培养、革兰染色、药敏试验筛选出疑似目标菌株；纯培养后行生理、生化试验,提取细菌基因DNA,多聚酶链式反应(PCR)扩增16SrDNA,测序后上传至NCBI数据库与已知序列比较,行16S rDNA序列同源性分析。结果临床分离多药耐药野生株(327045号),革兰染色阳性链球菌：a溶血；生化实验提示D群链球菌,缓症链球菌可能性大；16S rDNA序列同源性分析显示与缓症链球菌(S.mitis)同源性最高,99.58%。结论临床分离野生株(327045号)属于草绿色链球菌多药耐药野生株。成功获得本研究所需目标菌株。第2章 VS多药耐药野生株的致病力检测目的 了解目标菌株——草绿色链球菌多药耐药临床分离野生株的致病力,为下一步比较实验获取基线数据。方法 通过野生株上清液诱导V. harveyibb170报告菌株生物发光实验检测VS多药耐药野生株AI-2信号分子的存在与活性：酶标仪测量VS多药耐药野生株形成生物膜的吸光光度值,了解其生物膜形成能力；定量分析不同时间、不同类型、不同浓度抗生素对VS野生株生物膜形成量的影响,了解其耐药性,数据输入SPSS 17.0统计学软件,进行析因资料方差分析和单因素方差分析；Fluorecein Stain、18909 Calcofluor White Stain、 DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain荧光染色后,激光共聚焦显微镜扫描观测VS多药耐药野生株生物膜结构、胞外多糖分布、死活菌分布,全面了解VS多药耐药野生株的致病力表型。结果析因资料方差分析显示抗生素种类与浓度(P=0.034)、抗生素种类与干预时间(P<0.001)、抗生素浓度与干预时间(P=0.010)皆存在交互作用；主效应分析显示抗生素类型(P<0.001)、抗生素浓度(P=<0.001)、干预时间(P<<0.001)均可影响VS多药耐药野生株的BF形成。经单因素方差分析Dunnett t-tests多重比较显示初始期,环丙沙星耐药浓度(P=0.001)、中敏浓度(P<0.001)、敏感浓度(P<<0.001),四环素耐药浓度(P=0.012)、中敏浓度(P=0.009)、敏感浓度(P--0.001)实验组中抗生素均有效减少了VS多药耐药野生株BF的形成;中间指数期,实验组BF形成量与菌液对照组均不存在显著性差异(P>0.05)。生物膜结构复杂,且不均一；胞外多糖、死活菌分布特点多样,可受抗生素干预因素影响。结论 VS多药耐药野生株具有极强的生物膜形成能力和多重耐药性,致病力高,值得临床关注；抗生素治疗应遵循实验室检查结果。第3章VS LuxS基因突变株的构建目的通过同源重组法敲除VS多药耐药野生株的LuxS基因,构建VS LuxS基因突变株,为进一步研究LuxS基因在VS生物膜形成与耐药性变化中的作用做准备。方法运用同源重组法设计合成引物,分别以质粒PMG36E、VS多药耐药野生株(327045)DNA为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增得到红霉素抗性(Erm.)基因DNA片断和LuxS基因上下游序列,经双酶切反应插入pUC19质粒的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌感受态细胞,氨苄青霉和红霉素培养基筛选,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的VS多药耐药野生株(327045)中,利用红霉素抗性培养基筛选出LuxS基因缺陷突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)检测。结果PCR凝胶电泳结果显示：红霉素抗性基因和LuxS基因两侧同源序列成功连入到Puc19质粒相应酶切位点,VS LuxS基因突变株LuxS基因完全被红霉素抗性(Erm.)基因所取代。结论成功构建VS LuxS突变株。第4章LuxS基因缺失对VS野生株致病力的影响目的 了解LuxS/AⅠ-2密度感应信号缺失对VS多药耐药野生株生物膜致病力的影响,尝试探讨可能存在的机制。方法；V.harveyi BB170报告菌株生物发光实验检测AI-2信号分子的存在与活性；吸光光度值定量分析VS多药耐药野生株与LuxS基因突变株生物膜形成量与耐药性差异；Fluorecein Stain、18909 Calcofluor White Stain、DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain荧光染色后,激光共聚焦显微镜扫描VS多药耐药野生株与LuxS基因突变株BF,比较二者在生物膜结构、胞外多糖分布、死活菌分布方面的差异；通过野生株上清液、DPD补偿生长实验确认VS突变株表型发生的原因。数据输入SPSS 17.0统计学软件,进行Kolmogorov-Smirno test非参数检验。结果Kolmogorov-Smirno test显示：VS LuxS基因突变株与野生株菌液BF形成量存在显著性差异(P<0.001)；同样条件下,氨苄西林(P<0.001)、环丙沙星(P<0.05)、四环素(P<0.001)干预VS LuxS基因突变株与野生株BF形成量均存在显著性差异。突变株菌液BF形成量与VS野生株上清液、DPD补偿实验组BF形成量,均存在显著性差异(P<0.
关键词: 草绿色链球菌 ；16S rDNA ；同源性分析 ；药敏试验 ；细菌生物膜 ；致病力 ；草绿色链球菌 ；草绿色链球菌 ；LuxS基因 ；红霉素抗性基因 ；同源重组 ；基因突变 ；细菌生物膜 ；致病力 ；密度感应 ；自体诱导物AI-2 ；LuxS基因
被引量
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摘要： 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种重要的条件致病菌,常常引起呼吸道感染、肺炎、泌尿道感染等医院内感染,也是导致囊性纤维化(Cystic fibrosis, CF)、烧伤感染甚至AIDS患者发生死亡的主要原因,严重危害着人类的健康与生命。随着抗生素的大量广泛使用,将会给高耐药菌P. aeruginosa继续提供选择压力,促进其复制、组构及共同享用耐药基因,加快了多重耐药性(Multidrug resistance, MDR)的产生。近年来,细菌群体感应(Quorum sensing, QS)系统已成为设计新型、抗耐药抗菌药物的重要靶标。QS是细菌细胞内或细胞间信号传递的一种方式,通过监控某些信号分子(又称自体诱导分子)如高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactone, AHL)的浓度,来控制并协调整个细菌群体行为,共同对周围环境刺激做出反应。QS系统的猝灭能抑制生物膜(Biofilm,BF)的形成和毒性因子的表达,因不直接抑制细菌生长、不会对细菌产生选择性压力,故不会导致耐药性的产生。因此,针对性地设计高效、低毒、不会使P. aeruginosa产生耐药性的群体感应抑制剂(QS inhibitors, QSIs),具有重要的科学意义和应用前景。
P. aeruginosa至少存在两种基于信号分子的QS系统,核心是LasR受体。双组分系统参与P. aeruginosa的各项生命活动,尤其是介导了细菌生长、毒力因子表达和趋化性等重要行为。因此,LasR受体成为当前新的潜在抗生素靶标,用于发现新一代不会使P. aeruginosa产生耐药性的抗菌药物。然而,LasR-QS抑制剂复合物的晶体结构一直未见报道,延缓了其成为药物靶标、进行合理药物设计的可能。尽管LasR受体与白体诱导剂复合物的晶体结构已有报道,但发现LasR-配体结合区域与AHL复合物晶体结构中的空腔结合点并不适合用来研究QS抑制剂。为了进一步合理筛选、设计具有更强QS抑制活性的新型抗菌药物或先导化合物,我们综合应用3D-QSAR, Surflex-Sim等基于配体分子的药物设计方法(Ligand Based Drug Design, LBDD),分别对AHL衍生物、合成呋喃酮类以及卤代呋喃酮类群体感应抑制剂进行了进一步的研究、设计、合成和生物膜抑制活性评价。本课题的开展和研究成果,将为创制具有自主知识产权的新型抗菌药物奠定基础。
(1)由于信号分子衍生物结构与配体结构相似,故与配体竞争拮抗LasR受体而产生群体感应抑制活性,因此本文进行了基于酰基高丝氨酸内酯(AHL)类群体感应抑制剂的CoMFA研究。利用CoMFA建立了群体感应系统中最典型的一类信号分子—酰基高丝氨酸内酯(AHL)类化合物的衍生物的3D-QSAR模型。其交叉验证系数q2=0.528,非交叉验证回归系数r2=0.992,说明模型具有良好的可靠性和预测能力。结果显示：在C1位上适宜引入一些小体积的、吸电子基团；在C5位适合引入体积较小基团；而酰胺基部位对静电场没有要求,只要满足小体积；苯环对位上的取代则对立体场没有要求,在先导化合物的设计时只要求电负性基团。以上结论为AHL类群体感应抑制剂的进一步结构改造和修饰提供了有效的理论指导,并且为合成呋喃酮类(AHL类似物)群体感应抑制剂的3D-QSAR研究奠定了基础。
(2)自从发现某些合成呋喃酮可以阻断AHL分子与受体蛋白结合以来,人工合成呋喃酮类化合物成为群体感应抑制剂研究的热点,在此基础上,我们进行了基于合成呋喃酮类群体感应抑制剂的3D-QSAR研究。根据文献报道的26个合成呋喃酮类化合物的结构及活性数据,通过比较分子立场分析方法(CoMFA)和比较分子相似性分析法(CoMSIA)研究了这类化合物的结构-活性关系,得到了统计意义显著的QSAR模型(q2-0.639,r2=0.992,F=272.206,SEE=0.052)。结果显示：以立体作用、静电作用为描述符建立的QSAR模型可以圆满解释呋喃酮类化合物C5-位、C3-位的构效关系,阐明其活性高低的原因。在C5位上适宜引入一些小体积的、给电子基团,在C3位侧链的近端适合引入体积较大的给电子基团,而在C3侧链Cl′具有旋光性时,其R构型的活性总是要大于S构型。并较全面的讨论了配体分子结构中各部分的场效应对配体活性的影响,着重深入研究和探讨了配体分子结构中内酯环或呋喃酮环的3,5-位取代基和活性之间的关系。最后,基于该模型设计了6个新的目标化合物和6个对照化合物,并进行了活性预测,其结果与设计预期一致。本研究表明上述定量构效关系模型的预测能力强,为合理设计、合成新型抗耐药的抗菌药打下了基础。
(3) 3D-QSAR研究方法一般只限于母体结构相似的同系列化合物,且受分子多样性的影响比较大,而LBDD研究中另一常用的药效团模型方法也不适于研究柔性键数太多,分子之间差异性不够的AHL结构类似物,故采用Surflex-sim研究方法对经典的卤代呋喃酮类群感抑制剂进行数据库搜寻。经与模板分子(5个QS抑制活性较强的卤代呋喃酮和一个公认的QS抑制剂棒曲霉素)在形状和体积上的相似性比较,找到了26个相似性打分函数在0.80以上的化合物。搜索结果显示,候选化合物的母核不再局限于内酯环,出现了如内酰胺、吡咯烷-3-酮、咪唑并吡啶以及嘧啶乙酮等作为母核的系列衍生物；侧链的取代也有了新的突破,尤其是杂环N-上的取代基变化。本工作为寻找结构多样性或结构全新的具有群体感应抑制作用的先导化合物奠定了坚实基础。
(4)对基于3D-QSAR和Surflex-sim模型设计的35个目标化合物进行了化学合成和分子表征,并通过铜绿假单胞菌检测了它们的生物膜抑制活性。活性结果显示：基于3D-QSAR模型设计的所有目标化合物的平均抑制率大于80%,而参照化合物的平均抑制率不到60%,最小的甚至不到20%,且化合物的模型预测值与实验测得的绿脓杆菌生物膜的抑制率呈现出了很好的相关性,再次证明了CoMFA模型的可靠性和较好的预测性；大部分基于Surflex-sim研究方法设计的化合物都呈现出较强的生物膜抑制活性,其中90%以上的化合物的抑制率大于50%,尤其是1-(2-羟基乙基)-5-羰基-3-脯氨酸甲酯(QS 0709)和1-(3-羟基丙基)吡咯烷-2-酮(QS 0712)两个化合物的抑制率比阳性对照化合物强、均达到了90%以上,有可能发展成为新的先导化合物。本研究成果说明了该虚拟筛选模型的可信度高,为群体感应抑制剂的结构改造和全新药物设计提供了依据,从而为设计新型抗菌药物提供了线索。
本研究表明基于配体的3D-QSAR和Surflex-sim模型的预测能力强且可信度高,为群体感应抑制剂的结构改造以及寻找结构多样性或结构全新的具有群体感应抑制作用的先导化合物提供了依据。本研究的成果为进一步理性筛选、合理设计和开发具有更强QS抑制活性的先导化合物奠定了基础、并提供指导,具有重要的理论和应用价值。
关键词: 群体感应 ；生物膜 ；铜绿假单胞菌 ；3D-QSAR ；Surflex-Sim ；虚拟筛选
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