摘要: β-内酰胺类抗生素是目前世界市场上最重要的抗细菌感染药物,年生产量约为3×10~7kg,年销售额为150亿美元,市场份额为65%。半合成β-内酰胺类抗生素是其中最重要的一类。半合成抗生素一般由两步来合成:通过天然发酵产物的水解,得到了各种β-内酰胺母核;然后,母核与不同的侧链缩合合成了品种繁多的半合成抗生素。从20世纪60年代开始,科研人员开始研究化学法制备半合成抗生素。化学法的代表是丹磺酰氯法。该工艺使用活性很高的特戊酰氯试剂,需要各种甲硅烷基化试剂保护和去保护的步骤,使得合成路线长;许多步骤需要在零下几十度的低温条件下进行,能耗高;在反应过程和产物纯化时,使用包括二氯甲烷、三乙胺和乙腈在内的大量有机试剂,造成严重的环境污染,通过物料衡算,每生产一公斤半合成抗生素,会产生30-40公斤的废物排放。相对于化学法,目前正在大力发展的酶法合成半合成抗生素被认为是一种环境友好的生产工艺。工业上酶法合成半合成抗生素的关键酶是青霉素酰化酶,它属于N末端水解酶超家族,可以水解青霉素或者头孢菌素G生成重要的半合成抗生素母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)。同时,在特定条件下,青霉素酰化酶可以催化酰基供体与母核6-APA、7-ADCA、7-ACA及其衍生物的缩合反应,合成各种半合成抗生素。我国是世界上最大的抗生素原料药生产国之一。由于日益增加的环境保护的要求,目前我国的抗生素生产工艺正处于传统的化学法全面向绿色酶法改变的过程。我国自主开发的青霉素酰化酶水解活性高,己成功应用于6-APA、7-ADCA母核的工业生产,取代了国外的青霉素酰化酶。但是,国产的青霉素酰化酶催化合成反应的能力弱,远不能满足工业上对半合成抗生素合成用酶的需求。目前绿色酶法半合成头孢氨苄、阿莫西林、头孢克洛等抗生素的关键专利,大部分由国外公司如荷兰的帝斯曼所掌握。本研究以粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(PGA)为对象,通过分子改造,对保守位点构建随机突变文库,筛选获得具有高合成活力的PGA突变子,将其应用于氨苄西林半合成,并对半合成抗生素的合成工艺和途径进行探索,促进酶法合成半合成抗生素的进一步应用。主要工作:粪产碱杆菌的青霉素G酰化酶(Af PGA)是目前半合成抗生素合成最常用的三种青霉素G酰化酶之一。要将Af PGA用于半合成抗生素合成,首先要增加其合成水解比和对酰基供体的催化效率。以野生型AfPGA为模板,选取其中的3个保守位点(βF24,αR146,αF147),构建了饱和突变文库,通过两轮筛选,得到了来自βF24文库的四个突变子。将突变酶加上组氨酸标签纯化后,对他们的稳态动力学参数和氨苄西林合成的过程参数进行了测定。发现24位突变后,酶对C-α取代的底物的选择性增加,同时酶对不同形式酰基供体的偏爱性发生改变。揭示在对PGA改造时,应综合考虑用作筛选的反应类型(特别是酰基供体种类)。最为优秀的是βF24G突变的AfPGA。其对酰基供体D-苯甘氨酸甲酯(D-PGME)的催化效率增加了800倍,同时对苯乙酸耐受性增加,在抗生素合成过程中的三个参数都优于野生型。将βF24G游离酶用于氨苄西林的合成,相对于野生型,初始合成水解比提高了8.6倍,6-APA转化率提高到95%,同时投酶量和反应时间大幅度降低。表明酶法合成半合成抗生素,取决于酶与特定反应类型的结合。将βF24G突变的Af PGA部分纯化后,固定化到环氧基载体上,在高底物浓度和低酰基供体对母核比例(1.05:1)下,合成氨苄西林。优化后的反应条件是:15%(v/v)的甘油,0.04 g/ml固定化突变AfPGA,pH5.8,20℃。在此条件下反应,6-APA的转化率由优化前的不到70%增加到93.5%,反应时间为600分钟。证明作为绿色溶剂的甘油可以促进氨苄西林的酶法合成。综合利用野生型酶和突变子的各自催化优势,构建了野生酶和突变酶催化的双酶两步直接合成氨苄西林的工艺,以减少母核6-APA的分离纯化步骤。第一步野生酶催化的水解反应的时间是45分钟,产率是97%。突变酶催化的第二步合成反应,优化后的反应条件是:0.19g/ml固定化突变AfPGA,pH 6.3,28℃,D-PGME/6-APA浓度比例是1.50:1。反应时间是235分钟,转化率为90%。总的反应时间是280分钟,转化率是87%。同时,每摩尔的氨苄西林的产生只需要不到1.7摩尔D-PGME,更加符合绿色化学对原子经济性的要求。说明改进后的青霉素酰化酶,不仅可以用于对现有工艺途径的优化,也可以用于新的抗生素合成工艺的开发。 摘要译文