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    相关度 时效性 被引量
    1
    1. 认领
    【期刊论文】 •

    发文量: 被引量:0

    李天童

    发文量: 被引量:0

    刘鹏刚

    发文量: 被引量:0

    刘茜

    发文量: 被引量:0

    焦庆才
    • 《精细化工》 北大核心 • 2008年第11期 1066 - 1069, 共4页
    机构: [1] 南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室

    摘要: 报道了青霉素酰化酶法制备D-丙氨酸的研究结果,为D-丙氨酸的制备提供了一种方法。考察了pH、温度、DL-丙氨酸与苯乙酰氯的摩尔比、反应时间对制备结果的影响。确定了制备N-苯乙酰-DL-丙氨酸的最佳反应条件:pH=9.5,n(DL-丙氨酸)∶n(苯乙酰氯)=1.1∶1;酶促反应最佳条件为:pH=7.5,温度37℃条件下反应6h,其产物为N-苯乙酰-D-丙氨酸和苯乙酸的混合物。该混合物用c(HC l)=6 mol/L的盐酸高温回流6 h得D-丙氨酸盐酸盐,再经717阴离子树脂处理得D-丙氨酸。光学纯度为95.3%,总收率为72.5%。 摘要译文
    关键词: 固定化青霉素酰化酶 ;DL-丙氨酸 ;L-丙氨酸 ;D-丙氨酸 ;拆分 ;生物工程
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    引用
    被引量 11
    2
    2. 认领
    【期刊论文】 • 《水处理信息报导》 • 2010年第5期 63 - 64, 共2页

    摘要: 生物酶法制备L-丙氨酸项目,年产300吨阿奇霉素、300吨克拉霉素项目。 摘要译文
    关键词: 水解植物蛋白 ;酶法制备 ;L-丙氨酸 ;阿奇霉素 ;克拉霉素 ;综合利用 ;氨基酸液
    引用
    3
    3. 认领
    【期刊论文】 •

    发文量: 被引量:0

    叶俊杰

    发文量: 被引量:0

    冯昱

    发文量: 被引量:0

    李玉荃
    • 《天津药学》 • 2010年第5期 65 - 67, 共3页
    机构: [1] 天津市医药集团技术发展有限公司

    摘要: 目的:用7-苯乙酰胺基-3-乙烯基头孢烷酸在固定化青霉素酰化酶IPA-750催化下裂解制备7-氨基-3-乙烯基头孢烷酸(7-AVCA),并获取其最优反应条件。方法:利用正交实验法实验。结论:利用酶法制备7-AV-CA避免了有机溶媒的使用,割除了五氯化磷,同时青霉素酰化酶还能循环使用,具有相当好的社会和经济效益。 摘要译文
    关键词: 中间体 ;7-氨基-3-乙烯基头孢烷酸 ;青霉素酰化酶
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    引用
    被引量 3
    4
    4. 认领
    【期刊论文】 •

    发文量: 被引量:0

    崔福绵

    发文量: 被引量:0

    朱丽钊

    发文量: 被引量:0

    韩文珍

    发文量: 被引量:0

    吴敏
    +1位作者
    • 《微生物学报》 北大核心 • 1996年第2期 151 - 154, 共4页
    机构: [1] 中国科学院微生物研究所

    摘要: β—内酰胺系列抗菌素抗菌谱广、疗效高、毒副作用小,国际上研究与应用日渐广泛深入。头孢氨苄(Cephalexin)是重要的半合成抗菌素之一,由头孢霉素母核7—氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(简称7-ADCA)和侧链结构物苯甘氨酸或其甲酯(PGME)经酰化而生成。酰化有化学法和酶法两种。采用青霉素G酰化酶或a—氨基酸酯酶或,a—氨酰转移酶的酶法,具有工艺操作简单、无需基团保护、环境污染轻等优点。继日本人于70年代初试验成功酶法之后,80年代初我们开展了这方面研究。制备方面,胞外酶优于胞内酶;使用方面,固定化酶优于固定化细胞。在用具有青霉素G酰化酶活性的固定化大肠杆菌(Escherichia coli)细胞合成头孢氨苄的基础上,又研究了用固定化巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BP931胞外青霉素G酰化酶酰化合成头孢氨苄的条件。本文报道这一研究结果。 摘要译文
    关键词: 头孢氨苄 ;巨大芽孢杆菌 ;青霉素G酰化酶
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    引用
    被引量 11
    5
    5. 实质审查的生效
    【专利/发明】 • CN202310310702.9 •

    发文量: 被引量:0

    张民

    发文量: 被引量:0

    刘荣亮

    发文量: 被引量:0

    王玉军

    发文量: 被引量:0

    王利杰
    +8位作者
    • 申请日:2023-03-28, 公开日:2023-06-02

    申请人: 华北制药河北华民药业有限责任公司
    公开(公告)号: CN116200448A
    摘要: 本发明提供了一种连续式酶法制备头孢克洛的方法,包括如下步骤:将D‑苯甘氨酸甲酯溶液与7‑ACCA溶液混合均匀,调节混合液pH值为7.0~7.3,维持20~25℃;将混合液连续通过青霉素酰化酶柱进行缩合反应,得缩合液;调节缩合液pH值为1.0~1.5,并将其连续经过活性炭及氧化铝柱,再经微滤,得头孢克洛溶液;将头孢克洛溶液进行纳滤浓缩,得到浓度为100~220mg/mL的浓缩液;浓缩液再经脱色、过滤、结晶、过滤、洗涤、干燥,即得头孢克洛产品。该方法解决了现有间歇式生产工艺中存在的反应液粘稠,流动性差,浓度不均,局部pH偏高,副反应多、分离困难等问题。本发明方法实现了连续反应,减少了物料在高pH值时的时间,避免了头孢克洛溶解的过程,减少了降解,提高了产品收率和稳定性。 摘要译文
    引用
    6
    6. 专利权的终止
    【专利/发明】 • CN201710451848.X •

    发文量: 被引量:0

    朱玉山

    发文量: 被引量:0

    黄小强

    发文量: 被引量:0

    何金文
    • 申请日:2017-06-15, 公开日:2019-09-27

    申请人: 清华大学
    公开(公告)号: CN107099523B
    摘要: 本发明公开了一种头孢拉定合成酶突变体及其编码基因。本发明提供了如下A)或B)或C)所示蛋白质:A)将大肠杆菌天然青霉素G酰化酶的β链的第24位苯丙氨酸替换为丙氨酸,β链的第67位丝氨酸替换为丙氨酸后得到的;B)将大肠杆菌天然青霉素G酰化酶的α链的第142位甲硫氨酸替换为亮氨酸,β链的第24位苯丙氨酸替换为丙氨酸,β链的第67位丝氨酸替换为丙氨酸后得到的;C)将A)或B)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有合成头孢拉定能力的由A)或B)衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白质均具较高的合成头孢拉定的活性和Vs/Vh以及较低的α,为酶法合成头孢拉定的工业化奠定了基础。 摘要译文
    引用
    被引量 1
    7
    7. 发明专利申请公布后的视为撤回
    【专利/发明】 • CN202011135602.X •

    发文量: 被引量:0

    陈建华
    • 申请日:2020-10-22, 公开日:2022-04-22

    申请人: 武汉茵茂特生物技术有限公司
    公开(公告)号: CN114381489A
    摘要: 本发明公开了一种L‑草铵膦的酶法制备方法,所述制备方法包括:以外消旋的草铵膦为底物,以含青霉素G酰化酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或者外分泌酶液为催化剂,以缓冲液为反应介质进行反应,反应完全后,获得含L‑苯乙酰草铵膦和D‑草铵膦的反应液,将反应液分离纯化,收集D‑草铵膦消旋化后用于循环拆分,同时获得的L‑苯乙酰草铵膦化学水解后即为L‑草铵膦。本发明方法工艺流程简单,无需辅酶,对设备无特殊要求,适用于工业化生产。 摘要译文
    引用
    8
    8. 专利权的终止
    【专利/发明】 • CN201810875843.4 •

    发文量: 被引量:0

    朱玉山

    发文量: 被引量:0

    何金文
    • 申请日:2018-08-03, 公开日:2022-02-08

    申请人: 清华大学
    公开(公告)号: CN108949736B
    摘要: 本发明公开了一种高选择性头孢拉定合成酶突变体及其编码基因。本发明提供了如下蛋白质:将大肠杆菌天然青霉素G酰化酶的α链的第142位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸,β链的第24位苯丙氨酸替换为丙氨酸,β链的第67位丝氨酸替换为丙氨酸后得到的蛋白质。本发明所提供的蛋白质具更高的合成头孢拉定的活性和Vs/Vh以及更低的α,为酶法合成头孢拉定的工业化奠定了基础。 摘要译文
    引用
    9
    9. 授权
    【专利/发明】 • CN201410594657.5 •

    发文量: 被引量:0

    白延峰

    发文量: 被引量:0

    刘君臣

    发文量: 被引量:0

    侯瑞峰

    发文量: 被引量:0

    刁夏
    +3位作者
    • 申请日:2014-10-29, 公开日:2018-04-27

    申请人: 国药集团威奇达药业有限公司
    公开(公告)号: CN104357528B
    摘要: 本发明涉及综合回收酶法阿莫西林母液中有效成分的方法。所述方法包括步骤:(1)阿莫西林母液浓缩:将酶法合成阿莫西林母液pH调节至8.0~9.5,纳滤浓缩,得到母液浓缩液;(2)酶催化合成阿莫西林:母液浓缩液在pH5.8~7.0,在合成用固定化青霉素酰化酶存在下,6‑APA和D‑对羟基苯甘氨酸甲酯转化为阿莫西林;(3)采用超滤和纳滤制备D‑对羟基苯甘氨酸浓缩液:在酶催化反应结束后,分离得到阿莫西林晶体和阿莫西林二次母液,该二次母液经超滤、纳滤,得到D‑对羟基苯甘氨酸浓缩液;以及(4)D‑对羟基苯甘氨酸结晶。本发明通过酶催化合成阿莫西林的间接方法消耗了母液中残留的6‑APA和D‑对羟基苯甘氨酸甲酯,并提高了D‑对羟基苯甘氨酸的产品质量和产率。 摘要译文
    引用
    10
    10. 授权
    【专利/发明】 • CN201910587282.2 •

    发文量: 被引量:0

    周自金

    发文量: 被引量:0

    王磊

    发文量: 被引量:0

    黄军豪

    发文量: 被引量:0

    罗新祖
    +1位作者
    • 申请日:2019-07-02, 公开日:2019-09-17

    申请人: 苏州盛达药业有限公司;苏州第三制药厂有限责任公司
    公开(公告)号: CN110241167A
    摘要: 本发明涉及一种酶法制备头孢孟多酯钠衍生物的方法,采用青霉素酰化酶对化合物1进行水解反应,控制水解反应pH为5~8.5,温度为5~25℃,反应结束后,经酸化得到所述的头孢孟多酯钠衍生物1,其中,所述的化合物1的结构式为:所述的头孢孟多酯钠衍生物1的结构式为R1为碳原子数为1~3的烷基或R2、R3独立地为碳原子数为1~3的烷基。本发明的制备方法能够高收率获得头孢孟多酯钠衍生物,为头孢孟多酯钠相关药学研究提供帮助,同时为合成新的头孢类结构化合物提供一种思路。 摘要译文
    引用
    11
    11. 授权
    【专利/发明】 • CN202210943801.6 •

    发文量: 被引量:0

    左雪丽

    发文量: 被引量:0

    苏伟怡

    发文量: 被引量:0

    杨春
    • 申请日:2022-08-08, 公开日:2024-06-28

    申请人: 河北工业大学
    公开(公告)号: CN115058479B
    摘要: 本发明为一种酶促反应结晶制备高纯度头孢克洛的方法。该方法包括如下步骤:将7‑氨基‑3‑氯‑头孢烯酸和D‑苯甘氨酸甲酯盐酸盐加入到磷酸盐缓冲液中,再加入青霉素G酰化酶(PGA),进行酶催化合成反应;当酶催化合成反应液中的头孢克洛的过饱和度为2.0~2.4时,再加入头孢克洛晶种进行反应结晶,搅拌下反应140~200min,得到头孢克洛产品。本发明在解决酶法生产过程产物分解问题的同时,实现了酶促反应结晶一步制备出高纯度头孢克洛(纯度99%以上)。 摘要译文
    引用
    12
    12. 授权
    【专利/发明】 • CN202080011415.2 •

    发文量: 被引量:0

    许岗

    发文量: 被引量:0

    张娇

    发文量: 被引量:0

    曾红宇

    发文量: 被引量:0

    黄斌
    +1位作者
    • 申请日:2020-01-15, 公开日:2024-04-19

    申请人: 湖南福来格生物技术有限公司
    公开(公告)号: CN113365973B
    摘要: 本申请属于抗生素药物技术领域,涉及苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素V盐的方法。所述的衍生物为苯氧乙酸甘油酯。所述的方法包括如下步骤:(1)在水溶液中,在青霉素酰化酶的催化下,使6‑APA和所述的衍生物反应;(2)反应完成后,酸化反应得到的青霉素V,并经盐化后分离得到青霉素V盐。利用本申请的苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素V盐的方法,能够更好的酶法制备青霉素V盐。 摘要译文
    引用
    13
    13. 授权
    【专利/发明】 • CN202210943801.6 •

    发文量: 被引量:0

    左雪丽

    发文量: 被引量:0

    苏伟怡

    发文量: 被引量:0

    杨春
    • 申请日:2022-08-08, 公开日:2022-09-16

    申请人: 河北工业大学
    公开(公告)号: CN115058479A
    摘要: 本发明为一种酶促反应结晶制备高纯度头孢克洛的方法。该方法包括如下步骤:将7‑氨基‑3‑氯‑头孢烯酸和D‑苯甘氨酸甲酯盐酸盐加入到磷酸盐缓冲液中,再加入青霉素G酰化酶(PGA),进行酶催化合成反应;当酶催化合成反应液中的头孢克洛的过饱和度为2.0~2.4时,再加入头孢克洛晶种进行反应结晶,搅拌下反应140~200min,得到头孢克洛产品。本发明在解决酶法生产过程产物分解问题的同时,实现了酶促反应结晶一步制备出高纯度头孢克洛(纯度99%以上)。 摘要译文
    引用
    14
    14. 专利权的终止
    【专利/发明】 • CN201810875843.4 •

    发文量: 被引量:0

    朱玉山

    发文量: 被引量:0

    何金文
    • 申请日:2018-08-03, 公开日:2018-12-07

    申请人: 清华大学
    公开(公告)号: CN108949736A
    摘要: 本发明公开了一种高选择性头孢拉定合成酶突变体及其编码基因。本发明提供了如下蛋白质:将大肠杆菌天然青霉素G酰化酶的α链的第142位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸,β链的第24位苯丙氨酸替换为丙氨酸,β链的第67位丝氨酸替换为丙氨酸后得到的蛋白质。本发明所提供的蛋白质具更高的合成头孢拉定的活性和Vs/Vh以及更低的α,为酶法合成头孢拉定的工业化奠定了基础。 摘要译文
    引用
    15
    15. 实质审查的生效
    【专利/发明】 • CN202510494995.X •

    发文量: 被引量:0

    吴小梅

    发文量: 被引量:0

    刘晓天

    发文量: 被引量:0

    徐毅

    发文量: 被引量:0

    马宝娣
    • 申请日:2025-04-21, 公开日:2025-07-29

    申请人: 上海应用技术大学
    公开(公告)号: CN120384068A
    摘要: 本发明公开了一种高合成活性低水解活性的青霉素G酰化酶突变体及其应用,属于生物工程领域。将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的青霉素G酰化酶基因进行定点突变,使其编码的氨基酸序列在α链第24位由苯丙氨酸F突变为丙氨酸A,α链第146位由苯丙氨酸F突变为缬氨酸V,β链第386位由丝氨酸S突变为丙氨酸A,以得到突变体。本发明的青霉素G酰化酶突变体αF24A/βS386A对催化扁桃酸甲酯和3‑(1‑甲基‑1H‑四氮唑‑5‑基)硫甲基‑7‑氨基头孢霉烷酸(7‑TMCA)反应合成头孢孟多相对于未突变前的4小时转化率提升了13.70%,副反应产物扁桃酸产量减少了82%。本发明的青霉素G酰化酶突变体可以催化扁桃酸甲酯和7‑TMCA合成头孢孟多的同时大幅减少副反应的发生,可以应用于制备头孢类抗生素。 摘要译文
    引用
    16
    16. 授权
    【专利/发明】 • CN202080011415.2 •

    发文量: 被引量:0

    许岗

    发文量: 被引量:0

    张娇

    发文量: 被引量:0

    曾红宇

    发文量: 被引量:0

    黄斌
    +1位作者
    • 申请日:2020-01-15, 公开日:2021-09-07

    申请人: 湖南福来格生物技术有限公司
    公开(公告)号: CN113365973A
    摘要: 本申请属于抗生素药物技术领域,涉及苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素V盐的方法。所述的衍生物为苯氧乙酸甘油酯。所述的方法包括如下步骤:(1)在水溶液中,在青霉素酰化酶的催化下,使6‑APA和所述的衍生物反应;(2)反应完成后,酸化反应得到的青霉素V,并经盐化后分离得到青霉素V盐。利用本申请的苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素V盐的方法,能够更好的酶法制备青霉素V盐。 摘要译文
    引用
    17
    17. 授权
    【专利/发明】 • CN201910587282.2 •

    发文量: 被引量:0

    周自金

    发文量: 被引量:0

    王磊

    发文量: 被引量:0

    黄军豪

    发文量: 被引量:0

    罗新祖
    +1位作者
    • 申请日:2019-07-02, 公开日:2023-12-26

    申请人: 苏州盛达药业有限公司;苏州第三制药厂有限责任公司
    公开(公告)号: CN110241167B
    摘要: 本发明涉及一种酶法制备头孢孟多酯钠衍生物的方法,采用青霉素酰化酶对化合物1进行水解反应,控制水解反应pH为5~8.5,温度为5~25℃,反应结束后,经酸化得到所述的头孢孟多酯钠衍生物1,其中,所述的化合物1的结构式为:所述的头孢孟多酯钠衍生物1的结构式为R1为碳原子数为1~3的烷基或R2、R3独立地为碳原子数为1~3的烷基。本发明的制备方法能够高收率获得头孢孟多酯钠衍生物,为头孢孟多酯钠相关药学研究提供帮助,同时为合成新的头孢类结构化合物提供一种思路。 摘要译文
    引用
    18
    18. 专利权人的姓名或者名称、地址的变更
    【专利/发明】 • CN201510946542.2 •

    发文量: 被引量:0

    周自金

    发文量: 被引量:0

    罗新祖

    发文量: 被引量:0

    钱志勇

    发文量: 被引量:0

    汪飞强
    +4位作者
    • 申请日:2015-12-17, 公开日:2019-01-11

    申请人: 苏州中联化学制药有限公司
    公开(公告)号: CN105368910B
    摘要: 本发明涉及一种酶法合成头孢丙烯的方法,头孢丙烯母核、D‑对羟基苯甘氨酸甲酯和/或D‑对羟基苯甘氨酸乙酯、水、青霉素酰化酶在10~25℃反应得头孢丙烯粗品和酶反应母液,控制温度为0~15℃,pH值为0.2~0.8,加入N,N‑二甲基甲酰胺,搅拌均匀,加入晶种进行养晶,调节pH值至5.5~6.5,控制温度为10~30℃,得到头孢丙烯N,N‑二甲基甲酰胺复合物;控制温度为0~25℃,向反应器中加入水和头孢丙烯N,N‑二甲基甲酰胺复合物,搅拌转晶1~4.5小时,然后经过滤、洗涤、抽干、干燥得到头孢丙烯成品。本发明产品收率高、纯度高、外观呈白色,制备方法简单易行,条件温和,更适宜产业化生产。 摘要译文
    引用
    19
    19. 认领
    【会议论文】 •

    发文量: 被引量:0

    王立新
    作者单位: [1] 中国科学院成都有机化学研究所

    会议名称:
    会议时间: 2014-11-06
    摘要: 氨基酸是组成蛋白质的基本结构单元,也是十分重要的营养物质,它在人体及动物生命活动中起着无可替代的作用。手性氨基酸是合成多肽和内酰胺类抗生素等药物的重要中间体,在药物合成、新材料合成、食品添加剂和精细化学品的开发等方面都具有巨大的应用价值,以手性氨基酸为基础的医药、农药、材料总体市场数万亿元,已经越来越受到人们的关注。大部分手性药物都具有手性(胺)氨基酸骨架,目前手性药物占医药市场的60%以上,占据了医药市场的"半壁江山",预计2015年将超过4000亿美元。手性氨基酸的合成涉及到消旋体的合成、手性合成/拆分、分离纯化、消旋与转化等核心技术,不同的阶段及品种具有不同的成本权重,需根据资源、品种、规模等综合考虑,选择适合的技术路线与工艺方案。应加大传统大宗生物基氨基酸产品的新用途扩展与石化基础原料的应用替代,结合资源、市场、技术,找到合适的新品种及新的应用领域。本研究团队在手性氨基酸及手性氨基酸药物中间体合成方面开展了一系列工作,如固定化青霉素酶(PGA)法制各系列非天然手性α-氨基酸;高质量医药级L-缬氨酸的固定化酶法制备技术;抗丙肝药物特拉匹韦及伯克匹韦、抗艾药物阿扎那韦共性中间体的合成;新型抗血小板药物替卡格雷-氯吡格雷的合成;奎诺酮抗菌药超级沙星-西他沙星的合成;"重磅炸弹"级抗糖新药-西他列汀系列药物的合成技术开发;GABA类药物的合成;高效、低毒农药L-草铵膦及DL-草铵膦的生物催化及有机合成共性关键技术开发等等。 摘要译文
    关键词: 手性氨基酸 ;手性氨基酸药物中间体 ;手性药物
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    【会议论文】 •

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    梅娜娜 1

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    邓森文 2

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    马晓强 3

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    苏二正 1
    作者单位: [1] 南京林业大学轻工与食品学院酶与发酵工程实验室[2] 湖南科技大学生命科学学院[3] 新加坡国立大学化学与生物分子工程系

    会议名称:
    会议时间: 2017-10-18
    摘要: β-内酰胺类抗生素是目前世界市场上最重要的抗细菌感染药物,年生产量约为3×10~7kg,年销售额为150亿美元,市场份额为65%。半合成β-内酰胺类抗生素是其中最重要的一类。半合成抗生素一般由两步来合成:通过天然发酵产物的水解,得到了各种β-内酰胺母核;然后,母核与不同的侧链缩合合成了品种繁多的半合成抗生素。从20世纪60年代开始,科研人员开始研究化学法制备半合成抗生素。化学法的代表是丹磺酰氯法。该工艺使用活性很高的特戊酰氯试剂,需要各种甲硅烷基化试剂保护和去保护的步骤,使得合成路线长;许多步骤需要在零下几十度的低温条件下进行,能耗高;在反应过程和产物纯化时,使用包括二氯甲烷、三乙胺和乙腈在内的大量有机试剂,造成严重的环境污染,通过物料衡算,每生产一公斤半合成抗生素,会产生30-40公斤的废物排放。相对于化学法,目前正在大力发展的酶法合成半合成抗生素被认为是一种环境友好的生产工艺。工业上酶法合成半合成抗生素的关键酶是青霉素酰化酶,它属于N末端水解酶超家族,可以水解青霉素或者头孢菌素G生成重要的半合成抗生素母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)。同时,在特定条件下,青霉素酰化酶可以催化酰基供体与母核6-APA、7-ADCA、7-ACA及其衍生物的缩合反应,合成各种半合成抗生素。我国是世界上最大的抗生素原料药生产国之一。由于日益增加的环境保护的要求,目前我国的抗生素生产工艺正处于传统的化学法全面向绿色酶法改变的过程。我国自主开发的青霉素酰化酶水解活性高,己成功应用于6-APA、7-ADCA母核的工业生产,取代了国外的青霉素酰化酶。但是,国产的青霉素酰化酶催化合成反应的能力弱,远不能满足工业上对半合成抗生素合成用酶的需求。目前绿色酶法半合成头孢氨苄、阿莫西林、头孢克洛等抗生素的关键专利,大部分由国外公司如荷兰的帝斯曼所掌握。本研究以粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(PGA)为对象,通过分子改造,对保守位点构建随机突变文库,筛选获得具有高合成活力的PGA突变子,将其应用于氨苄西林半合成,并对半合成抗生素的合成工艺和途径进行探索,促进酶法合成半合成抗生素的进一步应用。主要工作:粪产碱杆菌的青霉素G酰化酶(Af PGA)是目前半合成抗生素合成最常用的三种青霉素G酰化酶之一。要将Af PGA用于半合成抗生素合成,首先要增加其合成水解比和对酰基供体的催化效率。以野生型AfPGA为模板,选取其中的3个保守位点(βF24,αR146,αF147),构建了饱和突变文库,通过两轮筛选,得到了来自βF24文库的四个突变子。将突变酶加上组氨酸标签纯化后,对他们的稳态动力学参数和氨苄西林合成的过程参数进行了测定。发现24位突变后,酶对C-α取代的底物的选择性增加,同时酶对不同形式酰基供体的偏爱性发生改变。揭示在对PGA改造时,应综合考虑用作筛选的反应类型(特别是酰基供体种类)。最为优秀的是βF24G突变的AfPGA。其对酰基供体D-苯甘氨酸甲酯(D-PGME)的催化效率增加了800倍,同时对苯乙酸耐受性增加,在抗生素合成过程中的三个参数都优于野生型。将βF24G游离酶用于氨苄西林的合成,相对于野生型,初始合成水解比提高了8.6倍,6-APA转化率提高到95%,同时投酶量和反应时间大幅度降低。表明酶法合成半合成抗生素,取决于酶与特定反应类型的结合。将βF24G突变的Af PGA部分纯化后,固定化到环氧基载体上,在高底物浓度和低酰基供体对母核比例(1.05:1)下,合成氨苄西林。优化后的反应条件是:15%(v/v)的甘油,0.04 g/ml固定化突变AfPGA,pH5.8,20℃。在此条件下反应,6-APA的转化率由优化前的不到70%增加到93.5%,反应时间为600分钟。证明作为绿色溶剂的甘油可以促进氨苄西林的酶法合成。综合利用野生型酶和突变子的各自催化优势,构建了野生酶和突变酶催化的双酶两步直接合成氨苄西林的工艺,以减少母核6-APA的分离纯化步骤。第一步野生酶催化的水解反应的时间是45分钟,产率是97%。突变酶催化的第二步合成反应,优化后的反应条件是:0.19g/ml固定化突变AfPGA,pH 6.3,28℃,D-PGME/6-APA浓度比例是1.50:1。反应时间是235分钟,转化率为90%。总的反应时间是280分钟,转化率是87%。同时,每摩尔的氨苄西林的产生只需要不到1.7摩尔D-PGME,更加符合绿色化学对原子经济性的要求。说明改进后的青霉素酰化酶,不仅可以用于对现有工艺途径的优化,也可以用于新的抗生素合成工艺的开发。 摘要译文
    关键词: 青霉素酰化酶 ;PGA ;半合成 ;氨苄西林 ;粪产碱杆菌 ;酶法合成 ;APA ;分子改造
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