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摘要： 目的对黏球菌(Myxococcus sp.)189B05大罐发酵吸附树脂提取物的化学成分进行研究。方法采用Sephadex LH-20和硅胶等色谱柱色谱进行分离纯化,用波谱技术鉴定化合物的结构。结果从70 L发酵提取物中分离得到5个化合物,分别为quinolin-4-ylmethanol(1),myxothiazol(2),4-quinolinecarboxaldehyde oxime(3),N-(2-phenylethyl)acetamide(4),N-acetyltyra-mine(5)。结论化合物1～5均为首次从该菌株中分离得到。
关键词: 黏球菌189B05 ；柱色谱 ；结构鉴定 ；myxothiazol
被引量
5
摘要： 黏细菌在系统进化上对应δ变形菌纲(Deltaproteobacteria)的黏细菌目,新的分类学标准已将黏细菌归为一个门(Myxococcota)。黏细菌能够生成大量的次级代谢产物,是一类极为重要的药源微生物。因为化学结构复杂多变、生物活性明显、以及功能机理奇特等优势,黏细菌的次级代谢产物日益引起国内外专家的重视。然而,由于绝大多数非模式黏细菌“生长慢、难培养、遗传操作困难”等固有特性,致使对黏细菌资源的开发利用十分匮乏!因此,开展对黏细菌的化学生物学研究,解析影响黏细菌生长发育的调控机制十分必要。
本论文通过代谢组学工具高通量筛选研究团队已存的大型黏细菌资源库,优选得到一株珊瑚球属菌株Corallococcus exiguus SDU70,从中定向发现了一类隶属于5-甲基-吡嗪酮(5-methylated pyrazinone)家族的新化合物,命名为coralinone。通过基因组生信分析、基因敲除及异源表达等手段,鉴定了coralinone生物合成的遗传物质基础:即由一个杂合体非核糖体肽合酶-聚酮合酶(Nonribosomal peptide synthetase/Polyketide synthase,NRPS/PKS)的基因 corA 独自编码;再通过体外生化实验,清楚地解析了 coralinone的生物合成途径,解开了吡嗪酮类天然产物结构中5-甲基的起源之谜。
在生源途径的启发下,对coralinone进行仿生有机全合成,不但为5-甲基吡嗪酮类有机化合物的高效制备提供新方法,也为进一步研究coralinone的构效关系提供了物质基础。经实验验证发现,coralinone虽然不具有抗菌、细胞毒、抗病毒等常规药理活性,但对黏细菌的生长发育具有调节功能,可以加剧本源菌SDU70及异源黄色黏球菌(Myxococcus xanthus DK1622)在液体培养基中的菌体聚集,并且5位甲基对吡嗪酮母核发挥该生理活性至关重要。此外,我们还发现coralinone是通过促进黏细菌胞外基质的分泌来加剧菌体聚集。
对国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中黏细菌基因组上编码5-甲基吡嗪酮的基因簇进行系统发育分析,一方面揭示该类天然产物的化学多样性及进化规律,另一方面也指导了我们发掘与corA基因邻近的自我抗性基因corB:其编码一个分泌型蛋白水解酶CorB,可有效降解胞外基质中的蛋白,从而拮抗由coralinone所引起的菌体凝集。CorB有望应用于改善黏细菌液体发酵状态,提升外源DNA的转化效率,克服非模式黏细菌遗传操作瓶颈。
总之,本论文首次发现黏细菌来源的5-甲基吡嗪酮类天然产物,并深入解析了其生物合成途径,扩展了人们对NRPS/PKS装配线化学多样性的认识;首次破译了 5-甲基吡嗪酮类信号分子对黏细菌的生理调节功能和作用机制,加深了对黏细菌的基础化学生态学的理解,为解决本领域里“未培养微生物”、“沉默基因簇激活”以及“遗传操作困难”等关键基础科学问题,贡献了一个新的突破口,最终为最大限度地开发利用黏细菌资源宝库奠定了理论基础。
关键词: 黏细菌 ；次级代谢产物 ；吡嗪酮类化合物 ；蛋白水解酶 ；胞外基质
摘要： 作为拮抗作用的典型代表，捕食行为是生态系统中广泛存在的细菌相互作用模式，在特定种群的选择和存活过程中发挥了关键作用，成为维持环境细菌多样性的一个重要因素，相关研究为揭示自然界中细菌种群构成以及生物进化过程中的一些关键科学问题提供了重要的线索和实验证据。目前，多数相关研究多关注于捕食细菌攻击策略和杀死及裂解猎物细胞机制上，对于猎物细胞应对捕食攻击的抵御机制的研究相对有限。作为捕食过程中参与种间相互作用的另一个关键参与者，被捕食细菌的防御特征能够在遭遇捕食压力后发生显著的演化过程。这些防御特征涵盖了广泛的机制，涉及到产生药物抗性或者发挥相关毒力因子功能，这些能够导致或者增强猎物细菌的致病性及抗生素耐药性。 黄色黏球菌是第一个被发现的“微捕食者”，具备对野生型大肠杆菌优异的捕食能力，二者共同构成了实验室水平上研究细菌捕食行为的模式系统之一。在前期工作中，在大肠杆菌大规模染色体缺失突变体文库中筛选获得了突变株ME5012,该菌株表现出稳定的抵御黄色黏球菌捕食的表型，然而所缺失基因均未有与捕食抗性的关联性相关的报道。我们因此开展了相关工作，力求鉴定导致该抗性表型的关键基因，并初步揭示其可能的分子机制。 首先，基于大肠杆菌ME5012所缺失大片段基因组的信息，我们构建了 7支单基因敲除株和3支以操纵子为单位的敲除株。通过邻近点接的菌落入侵实验，系统表征了黄色黏球菌捕食大肠杆菌不同敲除株在群体水平上的捕食差异。在分析过程中，除了定量统计了黏球菌在移动趋近阶段过程中的位移变化以反映其入侵大肠杆菌菌落的能力，还测定了裂解消耗阶段过程中猎物大肠杆菌菌落面积的变化和存活细胞的数量。结果表明，△fis和△dusB单基因敲除株均表现出一定程度的黄色黏球菌捕食抵御表型，并且△dusB-fis菌株与ME5012的抵御能力最为接近。因此，我们推测,由于大片段的缺失，大肠杆菌ME5012可能通过降低捕食者识别效率和减弱捕食者杀伤能力等方式获得捕食抵御表型，在这一过程中，dusB和fis基因的敲除发挥了关键作用。 DusB和Fis作为大肠杆菌中的全局性调控因子，我们无法通过其已知功能准确聚焦抵御捕食的关键表型，因此，通过使用iTRAQ高通量测序蛋白质组技术对大肠杆菌ME5012与野生型大肠杆菌MG1655在蛋白表达水平上的显著差异进行对比分析。显著差异蛋白GO聚类、KEGG途径、PPI网络互作等统计分析结果表明，相较于野生型MG1655,大肠杆菌ME5012鞭毛调控网络中的系列关键蛋白表达显著下调或缺失。此外，PPI网络互作中心性分析、细菌移动性检测和透射电镜观察确证了 fis基因对于大肠杆菌鞭毛产生的正调控作用。以大肠杆菌鞭毛调控因子flhDC敲除株作为阳性对照，我们进一步证明了鞭毛的缺失能够在一定程度上降低黄色黏球菌的捕食效率。此外，在基于YOLOv8+ByteTrack算法构建的多目标追踪目标检测体系中，我们对单细胞水平上多个捕食细胞的运动行为进行自动追踪与统计分析。结果表明，大肠杆菌细胞表面鞭毛组分的存在可以促进黄色黏球菌的识别过程，导致趋近猎物细胞的平均速率增加;黄色黏球菌在大肠杆菌ME5012猎物环境下的运动状态与△fis或△flhDC存在时的单细胞运动行为存在明显差异，这意味着除了鞭毛调控外，大片段的缺失还可能通过其它关键组分的变化导致ME5012的抵御表型。 黏球菌素（又称抗生素TA）是黄色黏球菌捕食大肠杆菌时分泌的杀伤性次级代谢产物。除了降低捕食者识别效率，大肠杆菌ME5012还可能通过影响TA工作效率来达到降低黏球菌杀伤能力的效果。对捕食共培养过程中黄色黏球菌的TA产生进行高效液相定量分析，结果显示，相较于黄色黏球菌的单独培养物，野生型MG1655的存在能够诱导TA的过量产生0.21μg，这一过程对应着TA关键合成基因的表达上调，而ME5012丧失了这一诱导能力，只能诱导黄色黏球菌产生0.02 μg的TA分泌。与此同时，在最小抑菌浓度测定结果中，与MG1655相比，ME5012和△dusB菌株获得了微弱的TA抗性，而该微弱抗性与TA作用靶点LspA蛋白的过量表达无关。有趣的是，我们发现ME5012的外排泵活性和膜流动性与MG1655存在一定差别，这可能是其具备微弱TA抗性的原因。 综上所述，我们认为大肠杆菌ME5012在大片段敲除后，尤其缺失dusB和fis基因后，引起了细胞状态多维度的变化，通过降低捕食者识别效率和杀伤能力等方式获得了抵御黄色黏球菌捕食的表型。基因fis的缺失引起ME5012细胞表面鞭毛组装发生明显缺陷，显著降低了黄色黏球菌捕食过程中的识别效率;基因dusB的缺失可能导致ME5012丧失了诱导黄色黏球菌过量产生TA的能力;外排泵活性和膜流动性的增强使得ME5012对TA产生了微抗性。该研究为猎物细菌抵御捕食提出了一个新的综合性策略和机制，也为深入理解自然界中捕食压力下病原微生物致病能力和耐药性的快速进化提供了线索和例证。
关键词: 大肠杆菌 ；黄色黏球菌 ；捕食行为 ；抵御机制
摘要： 黏细菌(myxobacteria)被认为是最有前途的天然产物生产者之一,具有在农业、生物医学和环境保护中广泛应用的潜力。在系统进化上,黏细菌对应Delta变形菌纲(Deltaproteobacteria)的黏细菌目(Myxococcales),是一类能够滑行运动的革兰氏阴性杆菌,新的分类标准已将其归为黏细菌门(Myxococcota)。黏细菌具有复杂的多细胞群体行为和生活史,如细胞生长的密度依赖、营养匮乏时多细胞子实体形态的发育、细胞的群体运动以及细胞的“狼群式”捕食等。此外,黏细菌能够产生丰富的次级代谢产物,是继放线菌之后又一个重要的药源微生物。黏细菌广泛分布于世界各地的各种生境中,包括陆地,海洋和淡水相关生境,相对而言,针对淡水生境的黏细菌研究最为薄弱。前期我们证实了淡水生境也是黏细菌的重要生境,并通过分析海洋、陆地和淡水环境来源黏细菌的系统发育关系,推测盐度对黏细菌系统发育具有重要影响。然而,目前对黏细菌的多样性分析多关注某一个生境,例如土壤、沼泽、堆肥等,对黏细菌资源的挖掘也多关注陆地和海洋环境,对淡水生境的研究较少。此外,对黏细菌的多样性和分布仍缺乏全球范围的认识和不同生境的比较。黏细菌虽然分布广泛,但黏细菌资源获取困难,是制约其开发和应用的重要瓶颈之一。目前黏细菌的富集主要依据其食性,采用大肠杆菌和滤纸进行诱导,分别富集嗜细菌类群和嗜纤维类群。分离和纯化主要依赖于其形态特征以区别于其他微生物。迄今为止,已描述的黏球菌目包含孢囊杆菌亚目(Cystobacterineae)、堆囊菌亚目(Sorangiineae)和小囊菌亚目(Nannocystineae)3个亚目。多项研究均表明存在着大量新的黏细菌分类单元,但对黏细菌的已培养情况和基因组测序情况尚不清楚。首先,为了全面系统地认识黏细菌的多样性和全球地理分布,以及已培养和基因组测序程度,通过对地球微生物组计划数据和公共数据库中黏细菌信息的比对分析,确定了黏细菌目是地球上已知的多样性最高的原核生物目之一。我们发现黏细菌存在于全球各主要生境,更偏好非盐土壤环境,例如植物根际、非盐沉积物等。注释结果显示,存在大量的黏细菌OTUs在科(至少20%)或属水平(至少50%)尚未被分类。黏细菌属于培养率和基因组测序率均较低的类群,且其已培养率和基因组测序率在不同环境间和不同科属间差异巨大。此外,细胞丰度高或样品分布广的黏细菌更有可能已被培养或已被基因组测序。然而即便是最具环境优势的黏细菌OTU,其中仍有超过60%尚未被分离培养,超过70%尚未进行基因组测序,这表明仍有大量的黏细菌资源尚未被发掘。总之,我们展示了黏细菌全球分布特征,并评估了黏细菌已培养和基因组测序的程度。针对黏细菌在淡水生境中研究相对薄弱的现状,我们采用高通量测序技术分析我国云贵地区湖泊表层沉积物中的微生物多样性,比较不同湖泊的微生物群落组成差异,探究湖泊沉积环境中细菌的地理分布特征及其装配机制。我们发现10个湖泊沉积物中,程海湖的细菌群落结构与其他湖泊具有明显差异。通过分析OTU在样本中的出现频率和相对丰度之间的相关性,发现出现频率较高的OTU往往具有较高的相对丰度,即高丰度类群具有更高的分散或适应能力。地理距离与Bray-Curtis距离之间的相关性分析显示,湖泊沉积物中的细菌群落结构不符合距离衰减模式,暗示了即便两个湖相距较远,但是由于相似的生存环境,使得组间的细菌群落结构差异不大。通过中性模型和零模型分析,我们发现随机过程不是主导云贵湖泊沉积物中细菌群落装配主要生态过程,而确定性过程中的同质选择是湖泊沉积物细菌群落装配中的主导过程。同时我们挑选其中的黏细菌序列进行分析,发现黏细菌目广泛存在于所有的湖泊沉积物中,涵盖了黏细菌的3大亚目,且还存在大量的未分类序列。其中黏细菌目中的嗜盐囊菌属(Haliangium)和厌氧黏细菌属(Anaeromyxobacter)是湖泊沉积物中的优势类群。在目前的组学时代,微生物纯培养尤为重要,微生物资源能够为组学研究提供可靠的基因资源,验证组学研究预测的各种生态功能、生理代谢等。黏细菌作为一类重要的药源微生物,由于其生长较为缓慢难以分离纯化等原因,导致黏细菌资源获取困难。对于黏细菌资源的挖掘,首先,通过汇总目前所有的已培养黏细菌的模式菌及其生境来源,我们发现目前绝大多数黏细菌的模式菌来源于土壤相关环境,仅6种来源于海洋相关生境,没有来自淡水环境的模式菌。黏细菌的系统发育显示,目前已培养的黏细菌分为3个亚目、10个科、30个属和75个种。这些模式菌大多数是通过经典的黏细菌富集分离方法获得的。该富集分离方法既具有有效性又具有局限性,往往仅能获得常见的几个类群,新类群的发现具有偶然性。为了探究经典富集方法的真实富集效果,我们对1个土壤样品分别采用滤纸和大肠杆菌进行富集,在不同的时间点取样和测序,进行菌群多样性分析。结果显示,大量已知黏细菌类群被富集,尤其是一些分离纯化时能够被观察到的类群,如黏球菌属(Myxococcus)和原囊菌属(Archangium)等。同时,多种未被培养的类群也能够被大量富集,尽管暂时未能得到纯培养菌株。在富集黏细菌的同时,其他类群的细菌也能被富集,例如具有捕食性的蛭弧菌目(Bdellovibrionales)菌株,具有高运动性的伯克氏菌目(Burkholderiales)菌株等。采用上述经典的黏细菌富集分离方法,我们从3大生境,即陆地相关生境(校园土,塔克拉玛干沙漠土,树木腐皮等),淡水环境(湖泊沉积物),海洋相关生境(黄河三角洲盐碱湿地及河海过渡区沉积物)中分离到450余株黏细菌,分布于黏细菌的3个亚目中,包括黏球菌属(Myxococcus)、珊瑚球菌属(Corallococcus)、原囊菌属(Archangium)、孢囊杆菌属(Cystobacter)、标桩菌属(Stigmatella)、聚集菌属(Aggregicoccus)、匣状菌属(Pyxidicoccus)、无囊菌属(Vitiosangium)、堆囊菌属(Sorangium)、多囊菌属(Polyangium)、小囊菌属(Nannocystis)和软骨霉状菌属(Chondromyces)共计12个属,其中黏球菌属菌株分离到的最多,包括目前已知的5个种M xanthus,M.virescens,M.fulvus,M.stipitatus和M.macrosporus,其次为珊瑚球菌属包括C.coralloides和C.exiguous。获得了 6株潜在的黏细菌新物种。此外,在分离黏细菌的同时,获得9株其他非黏细菌的新菌。综合3大生境的黏细菌分离培养效果,与上述黏细菌富集的多样性分析结果相符,黏球菌属是最易被富集和分离的属,部分被大量富集的类群但难以被分离培养的原因有待深入探讨。在利用经典的黏细菌富集分离方法对黏细菌资源进行挖掘的过程中,分离到了多株潜在新菌,包括黏细菌的新物种和其他非黏细菌的新物种。我们选择了其中1株分离自山东大学校园土的潜在黏细菌新物种SDU3-1T,该细菌隶属于多囊菌科(Polyangiaceae)的多囊菌属(Polyangium)。另外选取3株分离自山东大学校园土壤样品的特征比较明显的潜在新菌,包括形态上与黏细菌相似,能够滑行运动的菌株SDU1-6T,隶属于金色线状菌属(Chryseolinea)。具有极端耐辐照能力的菌株SDU3-2T,隶属于异常球菌属(Deinococcus)。与模式菌株16S rRNA基因最高相似性仅为84.2%的SDU3-3T,是绿弯菌门(Chloroflexi),绿弯菌纲(Chloroflexia)的一个新成员。对这4株潜在新菌从形态特征、系统发育关系、生理生化特征以及基因组信息等方面,并根据各菌株特点,通过多相分类方法,确立多囊菌属的一个新种(Polyangium aurulentus),代表菌株为SDU3-1T;确立金色线状菌属的一个新种(Chryseolinea flava),代表菌株为SDU1-6T;确立异常球菌属的一个新种(Deinococcus terrestris),代表菌株为SDU3-2T;暂定绿弯菌纲的一个新科(Allapsifilumlubricum),代表菌株为SDU3-3T。综上所述,本课题从免培养和纯培养的角度,系统解析了黏细菌的地理分布和多样性,从多种生境中广泛挖掘黏细菌新类群,丰富了黏细菌的资源库。首先我们展现了黏细菌的全球地理分布、多样性,评估了目前黏细菌的已培养和基因组测序情况。其次,针对黏细菌在淡水环境研究薄弱的现状,我们分析了湖泊沉积物环境中细菌和黏细菌的分布和多样性,并解析了湖泊沉积环境中细菌的群落装配机制。在此基础上,对3大生境的黏细菌进行资源挖掘,我们首先阐明了目前所有已培养黏细菌的系统发育关系及其环境来源,深入认识了黏细菌经典富集方法的真实富集效果,并对陆地相关生境、湖泊沉积物以及黄河三角洲湿地相关生境的黏细菌进行富集分离。最后,我们对获得的其中1株新的黏细菌及其他3株特性明显的细菌进行多相分类,确立了其科学分类地位。本研究结果对于黏细菌资源的进一步开发和应用具有一定的参考价值。
关键词: 黏细菌 ；全球地理分布 ；多样性 ；系统发育 ；富集分离 ；多相分类
被引量
1
摘要： 黏细菌是一类能滑行运动的捕食性细菌,现被划分为黏细菌门。黏细菌不仅能够产生丰富多样的次级代谢产物,是重要的药源微生物,还具有污水治理和生物防治等应用潜力。但由于黏细菌不能通过常规分离手段获得,且经典富集分离方法效率低,资源挖掘工作难度较大,改良和创新分离方法具有重要意义。因此,本研究对黏细菌富集分离方法进行了系统研究。黏细菌经典富集分离方法是利用诱导物富集黏细菌,使其细胞聚集形成子实体或扩展菌落,再进一步获取分离株。本研究使用活大肠杆菌、滤纸片和兔粪三类经典诱导物富集黏细菌。富集过程中的种群多样性分析显示:使用大肠杆菌富集的优势黏细菌类群是黏球菌属（Myxococcus）和小囊菌属（Nannocystis）;当滤纸片作为诱导物富集时,黏细菌物种组成变化较大,富集超过一个月后海生囊菌（Haliangium）成为优势类群;兔粪诱导富集的优势类群是黏球菌属和潜在新属（unclassified_fMyxococcaceae）。对照组无诱导物长期恒温孵育也会造成物种组成的波动;不同诱导物富集出的物种组成差异较大,这启示我们菌群互作以及诱导环境都可能影响富集效果。差异传代富集法（Differential subcultringenrichmentmethod,DSEM）是基于经典富集分离方法的改良。DSEM引入猎物混匀法、经典加湿法和除杂混匀法三种新处理方法,以经典富集分离方法作为对照,并进行传代富集。不同处理组传代过程中的种群多样性分析显示:黏球菌属（Myxococcus）在初次富集是总是占据优势,但随着传代富集,海生囊菌属（Haliangium）、类普通杆菌属（Vulgatibacter）和潜在新属（unclassified f Myxococcaceae）等黏细菌类群逐渐成为优势类群;多次传代处理还可能有助于兼性厌氧黏细菌类群的富集分离。从富集样品中分离获得了 289株纯培养菌株,其中潜在新菌111株,从经典加湿法传代样品中还涂布获得了难培养黏细菌类群——类普通杆菌属（Vulgatibacter）潜在新菌SDU102。此外,本文对获得的五株聚集球菌属（Aggregicoccus）黏细菌新菌进行多相分类研究,建立了三株新模式种:湖泊聚集球菌（A.lacus）DLP4T、土壤聚集球菌（A.agri）SDU12T和广西聚集球菌（A.guangxiensis）GL405T。该属菌株不形成典型的子实体结构、振荡培养时会聚集形成大细胞团,培养特征不同于黏球菌科其他类群;还具有合成萜烯类、聚酮化合物和非核糖体肽等结构的新颖次级代谢产物的潜力。本研究系统评估了经典富集方法,进一步建立了差异传代富集法,并分离获得多株黏细菌纯培养菌株,对其中五株黏细菌新菌进行多相分类研究,确立了聚集球菌属的三个新物种。研究结果拓宽了黏细菌的富集思路,丰富了黏细菌资源,为改良黏细菌经典富集分离方法、提高黏细菌富集分离效率提供依据和理论指导。
关键词: 黏细菌 ；分离培养 ；聚集球菌属 ；多相分类
摘要： 埃博霉素(Epothilone)是由纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)生产的一类大环内酯类抗肿瘤活性药物。埃博霉素基因簇作为一个大型次级代谢产物操纵子,包含7个基因,全长56 kb,只有末端一个终止子,理论上会转录生成一个巨大的mRNA,这也暗示了基因簇转录过程的脆弱性和调控多个基因转录平衡的艰巨性。因此,内部启动子可能存在其中以协调不同基因的转录。多个内部启动子之间也可能存在相互调控作用。为回答这一科学问题,本文探讨了内部启动子对埃博霉素基因簇的转录调控作用,并揭示了内部启动子之间相互调控的规律和部分机制,为大型次级代谢产物基因簇的转录调控研究和以启动子为核心元件的基因回路设计提供了科学合理的参考。本篇论文中,我们通过软件预测到埃博霉素基因簇内部至少存在6个额外的启动子,随后我们在大肠杆菌中构建了启动子活性检测载体,通过CATELISA实验检测了这些内部启动子的转录活性,进一步通过实验验证了这些内部启动子的存在与活性。并且,我们在大肠杆菌中通过CRISPRa技术分别激活了这些内部启动子,成功提高了下游报告基因的表达水平。紧接着,我们将这套CRISPRa系统应用于黄色黏球菌中,我们分别单独激活了6个内部启动子,随后选择激活效果较好的位点,进行组合激活实验,同时,我们在不同的黄色黏球菌菌株中进行实验。结果显示,菌株ZE5-DEF展示出最好的调控效果:埃博霉素基因簇的转录水平提高了 3～50倍,埃博霉素的产量提高了 15倍,从原来的0.31 mg/L提高到4.42 mg/L。同时,我们分析了所有突变菌株中整个埃博霉素基因簇的转录图谱,发现激活特定的内部启动子不仅促进了靶基因的转录,而且改变了附近基因的转录水平。上述实验结果都表明:内部启动子对基因簇的转录调控意义重大,甚至单个内部启动子的转录活性就会明显地改变整个基因簇的转录图谱,这对大型次级代谢产物基因簇的转录调控研究和产物产量的优化研究具有重要的指导意义。在上述实验中,我们还发现,同一内部启动子在操纵子形式中和独立工作形式中存在活性差异,且被CRISPR激活后也呈现出不同的变化趋势。结合我们之前的文献调研结果,我们推测这些内部启动子在埃博霉素操纵子中受到未知的调控作用,即内部启动子之间可能存在相互影响。于是,我们模拟埃博霉素基因簇的结构,建立了一个串联启动基因开关模型。我们选择了两个诱导型启动子和两个荧光蛋白报告基因,构成了一个双启动子双基因的简单操纵子。通过诱导剂的加入量控制启动子的开关和强度,随后分析基因的表达量。最终,我们解析出了两个启动子串联的操纵子中的调控规律:上游启动子在低活性时会对下游基因的表达存在封闭作用,而上游启动子处于高启动活性时,则可以解除这种抑制作用,甚至起到对下游基因的表达增强作用;同时,在上游启动子工作的前提下,高活性的下游启动子会增强上游基因的表达。随后,我们也进一步探索了产生这种调控规律的机制,我们筛选了多个可能的影响因素,实验结果显示,DNA双螺旋的拓扑结构是造成串联启动子相互影响的关键因素之一。合成生物学的从头设计研究中,启动子作为操纵子基因回路构建所必不可少的元件之一,其转录调控作用具有关键意义,我们的实验结果对合成生物学中科学合理的设计具有重要的参考价值。
关键词: 内部启动子 ；埃博霉素操纵子 ；转录调控 ；CRISPRa-dCas9 ；黄色黏球菌
被引量
1
【会议论文】 •
+5位作者
会议名称： 第八届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会
会议时间： 2016-08-16
摘要： 分布于热带和亚热带海陆交界潮间带的红树林,作为一类独特而高生产力的湿地生态系统,生物多样性极其丰富,其中的红树植物内生放线菌是亟待开发的新抗生素资源宝库.本研究基于16S rRNA基因序列分析和形态特征比对,从广西北仑河口红树植物来源的210株内生放线菌中选取63株,开展发酵和抗菌活性筛选.经液体发酵培养,菌株培养液离心,上清液经乙酸乙酷萃取,菌丝体经丙酮浸提,获得189份提取浓缩物样品.以金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、罗伦隐球菌和白色念珠菌及其相应的耐药菌,共16株为检定菌株,采用琼脂纸片扩散法对该库进行抗菌活性筛选.结果 表明,63株内生放线菌中有52株在至少一个抗菌活性筛选中显示阳性结果,总阳性率为82.5％,尤其值得关注的是其中对于临床上棘手的革兰氏阴性菌一铜绿假单胞菌耐药株,鲍曼不动杆菌耐药株,阳性率分别为36.5％和23.8％.以上结果表明,广西北仑河口红树植物内生放线菌是潜在的抗生素发现资源宝库,从其次级代谢产物中有可能发现对重要临床耐药菌具有较强抑制活性的(新)抗生素.
关键词: 广西北仑河口 ；红树植物 ；内生放线菌 ；耐药菌
摘要： 黏细菌可产生丰富的次级代谢产物，主要表现为较强的抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗细菌等活性，而且活性物质的结构新颖、作用机制独特，在医药、农业和环境等方面具有广泛的潜在应用价值，是具有极大研究开发价值的微生物类群。本论文的主要目的在于研究丰富的黏细菌资源，从中获得具有较高生物活性的菌株。
本文采用菌体诱导法和纤维素诱导法来富集分离郑州郊区的土壤和腐木等样品中的黏细菌，通过抑菌测定实验筛选到一株较高活性的菌株hg59，该菌对革兰氏阳性和阴性菌均有抑制作用，但对阳性菌的效果更显著。该菌革兰氏染色为阴性，菌落生长初期为淡黄色，逐渐变成橙黄色，薄而向边缘扩展，有滑动痕迹，营养细胞呈杆状，两头稍尖，柳叶状，大小为5-8μm×0.3-0.6μm，黏孢子为卵圆形或椭圆形；刚果红试验、过氧化氢酶试验为阳性，其余试验指标均为阴性；16S rDNA同源性分析表明，该菌与橙色黏球菌亲缘关系最近，相似性达99%以上。综合形态学、生理生化特性和菌株的16S rDNA序列分析，可以初步确定该菌为橙色黏球菌，最终命名为Myxococcus fulvus hg59。
应用Plackett-Burman设计对影响菌株抑菌活性的酵母粉、CaCl2、VB12、初始pH、接种量、温度、转速和培养时间8个因素进行了评估，并从中筛选出酵母粉、接种量和培养时间为主要影响因素；通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域并确定响应面优化的中心点；运用Box-Behnken设计及响应面分析法确定重要因素的最佳水平。最佳工艺条件为：酵母量为6.20g/L，接种量为12.20%，培养时间为175.00h，抑菌活性的值为18.79mm，经模型验证后，与理论预测值基本吻合。
采用活性跟踪的方法，对菌株的活性代谢产物进行了初步研究。经不同极性的有机溶剂萃取后，发现活性物质主要集中在乙酸乙酯相；取其粗提物进行薄层层析，反复摸索条件后得出三氯甲烷与甲醇体积比为5：3时，展开效果较好；经硅胶柱层析洗脱后，取活性最高的部分，进行特殊化合物的颜色反应试验，结果显示，该部分主要含有内酯环和生物碱类物质，红外光谱的分析结果与此相一致。
关键词: 黏球菌 ；分离鉴定 ；响应面优化 ；抑菌活性
被引量
6