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1. 认领

【会议论文】 • 王娟 ¹梁碧怡 ²黄宇虹 ¹陈伊 ¹ +5位作者

作者单位： [1] 中山大学中山医学院微生物学教研室热带病防治研究教育部重点实验室海洋微生物功能分子广东省高校重点实验室广东省重大传染病预防和控制技术中心[2] 中山大学药学院海洋微生物功能分子广东省高校重点实验室[3] 中山大学化学与化学工程学院有机化学研究所海洋微生物功能分子广东省高校重点实验室

会议名称：

会议时间： 2011-07-27

摘要：目的研究Enniatin B与Enniatin B4体外抗结核活性以及对结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB) H37Rv基因表达的影响。方法 Kind-Bauer纸片扩散法初步鉴定海洋微生物代谢产物的抗结核活性;运用绝对浓度间接法测定具有一定抗结核活性的化合物的最低抑菌浓度;应用结核cDNA芯片检测化合物处理MTB组与未处理MTB对照组表达差异的基因。结果初步鉴定发现Enniatin B与Enniatin B4在卡介苗(BCG)平板上有明显的抑菌圈。绝对浓度间接法发现Enniatin B与Enniatin B4对MTB H37Rv、临床分离的耐药MTB株均有抑菌效果,尤其对部分耐药菌株的抑制作用甚至优于抗结核一线用药。结核cDNA芯片检测发现,Enniatin B处理组与对照组比较,有差异表达的基因总数为117条,上调50条,下调67条;Enniatin B4化合物处理组与对照组比较,有差异表达的基因总数为97条,上调44条,下调53条;这些存在差异的基因功能涉及核苷酸、脂质、能量、辅酶、氨基酸代谢,DNA的复制、转录、翻译、翻译后修饰以及细胞膜的生物合成等。结论本实验为抗结核新药的开发以及新的抗结核作用靶点的探索提供有价值的实验基础。

摘要译文

关键词: 抗结核 ；Enniatin B ；Enniatin B4 ；基因芯片；差异表达

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2. 认领

【学位/硕士】 • 戚楚楚 • 中南林业科技大学 • 导师：任佳丽 • 2024年

摘要：乳菇紫素(Lactaroviolin,LAC)广泛存在于乳菇属真菌中,是一种愈创木烷型倍半萜。本课题组前期研究表明,从红汁乳菇中提取的LAC对结核分枝杆菌具有特异的抑菌活性,尤其是对临床分离的耐药结核菌也具有显著的抑制作用。然而,LAC作为一种次生代谢产物,在红汁乳菇中的含量极低,提取困难。因此,研究不同因素对采后红汁乳菇中LAC含量的影响,以提高LAC含量,对后续LAC抗结核活性的开发与应用具有重要意义。本研究首次建立并优化了 LAC的液相色谱检测法,探究了采后不同因素对红汁乳菇中LAC含量的影响。结合蛋白质组学技术,筛选出红汁乳菇响应热胁迫和机械损伤胁迫的差异表达蛋白,初步阐明了其防御系统的应答调控机制,为进一步了解红汁乳菇中LAC转化机制奠定理论基础。具体结果如下: (1)建立了 LAC的液相色谱检测法。检测条件为:流动相为正己烷-乙酸乙酯(98:2),等度洗脱,流速2 mL/min,检测波长312 nm;LAC浓度在1～32.5μg/mL范围内呈良好的线性关系,R2=0.99995;检出限为7.5 ng/mL(S/N>3),定量限为30 ng/mL(S/N>10);该方法的加标回收率均在100.10%～110.46%之间,RSD均小于5%。该方法步骤简单,结果稳定可靠,适用于乳菇属真菌中LAC的定量分析。 (2)探究了采后不同处理因素对红汁乳菇中LAC含量的影响。结论如下:红汁乳菇子实体的不同部位和不同生长期的子实体中,LAC含量没有显著差异;热风干燥显著提高了 LAC含量;热胁迫实验中,处理时间相同时,LAC含量随着温度的升高呈现先升高后降低的趋势,在温度为40℃,处理时间为9 h时,LAC含量最高;在同一温度下,随着热胁迫时间的延长,LAC含量逐渐增加;机械损伤能显著提高LAC的含量。 (3)探究了热胁迫前后红汁乳菇中微生物群落组成差异。推测40℃处理时LAC含量最高,可能是此温度下某些微生物大量生长繁殖促进LAC的生成。扩增子测序结果表明,热胁迫前后红汁乳菇样品中微生物群落结构发生了改变,细菌优势菌群主要为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)和类伯克霍尔德菌属(Paraburkholderia)等,大部分在促进植物生长方面具有重要作用,可能对红汁乳菇的生长发育有促进作用。真菌优势菌群主要为青霉属(Penicillium)、交链孢霉属(Alternaria)和木霉属(Trichoderma)等,大部分属于腐生菌、寄生菌或者病原菌。但也存在一些外生菌根真菌如小垫革菌属(Tomentella),可能有助于红汁乳菇与马尾松形成共生结构。 (4)采用Label-free蛋白质组学技术,分析了红汁乳菇子实体响应热胁迫和机械损伤胁迫的差异表达蛋白质。GO分析结果表明,红汁乳菇在热胁迫和机械损伤胁迫处理后主要是细胞过程、代谢过程、生物调控的蛋白行使参与催化活性、结合、分子结构活性和转运体活性等主要功能方面发生了变化。KEGG富集分析结果表明,热胁迫下红汁乳菇能够通过激活MAPK等信号通路,调节相关抗氧化酶基因表达,调节能量代谢途径,提高热激蛋白表达,促使红汁乳菇激活自身防御机制,产生包括LAC在内的一系列次级代谢产物来应对胁迫损伤。而机械损伤胁迫下,红汁乳菇细胞遭受严重损伤,生物膜系统被破坏,激活自身防御机制,防御酶活性升高,促进LAC等次生代谢产物的积累。 (5)分离出LAC的直接前体并使用质谱进行初步验证。通过蛋白质组学技术,筛选红汁乳菇响应胁迫的差异表达蛋白,为揭示其防御系统的应答调控机制提供蛋白质表达水平的证据。而LAC生成过程中涉及的中间产物尚未完全阐明,本研究在纯化LAC的过程中,分离出一种蓝色化合物,其在空气中会逐渐转变为紫色。采用质谱技术,监测这一变化过程,证明蓝色化合物是乳菇紫素的直接前体,为完善LAC生物合成途径提供参考。

摘要译文

关键词: 红汁乳菇；乳菇紫素；高效液相色谱法；蛋白质组学

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3. 认领

【学位/硕士】 • 张喜霞 • 天津医科大学 • 导师：吴琦 • 2012年

摘要：目的结核病是一古老的疾病,从古至今,人类一直未曾停止与其不懈的斗争。自上世纪40年代链霉素应用于结核病治疗,以及随后一线抗结核药利福平、异烟肼及乙胺丁醇的应用,人类对结核病的控制才有了突破性进展。抗结核药的广泛应用以及不正规治疗必然伴随细菌耐药性的产生,从最初单耐药发展到多耐药,甚至耐多药及泛耐药。近年来HIV与结核的双重感染急剧上升,面临HIV疫情及耐药结核的威胁,抗结核新药的研发迫在眉睫。中药黄芩苷是药用植物黄芩的黄酮类化合物,目前已研究其有多种疗效。基于目前结核耐药形势及抗结核药物毒副作用,本课题借助体外抑菌试验及形态学观察,以期明确黄芩苷的抗结核作用及机制,为中西医结合治疗结核病开拓思路,提供基础实验数据,并为进一步的临床推广打下基础。方法利用绝对浓度法进行体外黄芩苷单药抑菌试验,求得黄芩苷MIC,评估黄芩苷的抗结核作用；利用棋盘法,将不同浓度梯度黄芩苷分别与不同浓度梯度的利福平、异烟肼及乙胺丁醇交叉进行联合抑菌试验,通过绝对浓度法求得FIC,评估黄芩苷与抗结核药物的联合效应。以荧光试剂5(6)-羧基-四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯标记黄芩苷,荧光标记黄芩苷进行体外抑菌试验,评价标记前后黄芩苷的抑菌作用有无变化,制备药理活性的荧光探针；激光扫描共聚焦显微镜对标记黄芩苷作用后的结核菌进行扫描及三维重建,观察荧光标记黄芩苷抗结核菌作用的部位。结果108例黄芩苷体外抑菌试验结果表明,黄芩苷对结核分枝杆菌有明确抑制作用,MIC值在0.75～12mg/ml之间,MIC为12mg/ml的菌株占8.33%,6mg/ml的菌株占45.87%,3mg/ml的菌株占37.62%,1.5mg/ml的菌株占6.48%,0.75mg/ml的菌株占0.93%,MIC50和MIC90均为6mg/ml。黄芩苷与INH、RFP、EMB的联合药敏试验结果表明,黄芩苷与INH、RFP的联合效应主要表现为协同或相加,与EMB的联合效应主要表现为拮抗。荧光标记黄芩苷抑菌试验结果表明,其MIC降低1个浓度梯度。LSCM观察结果提示标记黄芩苷进入结核菌内部发挥作用,而非仅粘附于结核菌表面。结“CT式”断层扫描及三维重建结果,荧光标记黄芩苷作用部位为结核菌细胞质,抗结核作用可能与影响核酸代谢,干扰基因表达及蛋白质合成有关。结论黄芩苷体外抑菌试验确定黄芩苷的抗结核作用,MIC值在0.75～12mg/ml之间,MIC为12mg/ml的菌株占8.33%,6mg/ml的菌株占45.87%,3mg/ml的菌株占37.62%,1.5mg/ml的菌株占6.48%,0.75mg/ml的菌株占0.93%,MIC50和MIC90均为6mg/ml。黄芩苷对结核分枝杆菌的直接抑制作用可能与其黄酮环的烯烃结构有关,糖苷成分的改变也可能影响其抑菌活性。黄芩苷与INH、RFP及EMB的联合药敏试验结果表明,黄芩苷与INH、RFP的联合效应主要表现为协同或相加,与EMB的联合效应主要表现为拮抗。说明黄芩苷能够部分降低INH、RFP的耐药性,降低药物所需剂量,降低毒副作用,避免及延缓耐药的发生；机制可能与影响已知耐药靶基因,外排泵基因等有关。黄芩苷不能降低EMB的耐药程度,反而进一步增加其耐药性,增加其使用剂量,更易诱发毒副作用；机制可能与竞争抑制作用或影响己知耐药靶基因,外排泵基因及新的药物靶基因有关。荧光标记黄芩苷抑菌试验结果表明,其MIC降低1个浓度梯度,提示抗结核活性增强,推测有以下可能：1.氨基的加入增加了黄芩苷的抑菌活性2.黄酮类化合物结构中糖苷成分的存在易削弱其活性,氨基和5-(6)TAMRA SE的加入,可能削弱了葡萄糖苷键的稳定性,从而增加标记黄芩苷的抑菌活性3.黄芩苷的抑菌活性基团可能不止黄酮环的烯烃结构,或许也与黄芩苷的6位羰基有关。LSCM观察结果提示,标记黄芩苷进入结核菌内部发挥作用,而非仅粘附于结核菌表面。结合“CT式”断层扫描及三维重建结果,荧光标记黄芩苷作用部位为结核菌细胞质,抗结核作用可能与影响核酸代谢,干扰基因表达及蛋白质合成有关。

摘要译文

关键词: 黄芩苷；结核分枝杆菌；MIC ；FIC ；5-(6)TAMRA SE ；荧光标记；LSCM

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