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摘要： 目的探讨Quil A对口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)疫苗的免疫增强作用。方法将O型FMDV抗体阴性的仔猪随机分为4组:1组首次免疫O型口蹄疫核酸苗pVIRIL18P1,第2次免疫重组鸡痘苗vUTAL3CP1;2组首次免疫Quil A+O型口蹄疫核酸苗pVIRIL18P1,第2次免疫重组鸡痘苗vUTAL3CP1;3组两次均免疫猪O型口蹄疫合成肽疫苗;4组两次均免疫PBS。首次免疫后0、14、42 d,检测猪血清中FMDV VP1结构蛋白抗体及细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFNγ的水平;首次免疫后42 d,检测T淋巴细胞增殖水平。结果 2次免疫后,2组猪血清中FMDV VP1结构蛋白抗体水平、细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFNγ水平及T淋巴细胞增殖率均显著升高。首次免疫后42 d,2组上述指标中除IL-2水平外,与3组和4组比较差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01);除IL-2、IL-10和IFNγ水平外,与1组比较差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01)。结论 Quil A对O型口蹄疫疫苗具有较好的免疫增强作用。
关键词: QuilA ；佐剂,免疫 ；口蹄疫疫苗
被引量
6
摘要： 为了研究巴戟天多糖对口蹄疫疫苗的免疫增强作用,试验将50只(4~7周龄)昆明小白鼠(体重18~22 g)随机分为5组,分别为空白(Naive)组、多糖(MOPS)组、疫苗(FMDV)组、疫苗+多糖(FMDV+MOPS)组、疫苗+铝佐剂(FMDV+alum)组,每组10只,Naive组小鼠注射生理盐水200μL,MOPS组小鼠注射巴戟天多糖溶液(2.5μg/μL)200μL,FMDV组小鼠注射猪口蹄疫O型灭活疫苗200μL,(FMDV+MOPS)组小鼠注射猪口蹄疫O型灭活疫苗200μL与巴戟天多糖200μL,(FMDV+alum)组小鼠注射猪口蹄疫O型灭活疫苗200μL与铝佐剂(1μg/μL)200μL,14 d之后进行二免。二免后第14天对小鼠进行眼眶采血,分离血清;无菌取脾脏,进行脾单细胞体外培养,收集上清液;采用小鼠间接ELISA试剂盒检测血清中特异性抗体IgG和血清中细胞因子IFN-γ、IL-4的含量。结果表明:与Naive组比,(FMDV+MOPS)组的IgG、IFN-γ和IL-4含量极显著升高(P<0.01);(FMDV+alum)组的IgG、IFN-γ含量均极显著升高(P<0.01),IL-4含量显著升高(P<0.05);FMDV组的IgG、IFN-γ含量均显著升高(P<0.05),IL-4含量差异不显著(P>0.05);MOPS组的IgG、IFN-γ及IL-4含量差异不显著(P>0.05)。说明MOPS作为口蹄疫疫苗免疫增强剂,可明显提高小鼠特异性抗体IgG和细胞因子IFN-γ、IL-4的含量,增强对小鼠的免疫应答。
关键词: 小鼠 ；巴戟天多糖 ；口蹄疫疫苗 ；IgG ；IFN-γ ；IL-4
被引量
14
摘要： 【目的】探讨单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A,MPLA)对口蹄疫(food and mouth disease,FMD)O型灭活疫苗的免疫增强效应,提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果.【方法】通过检测MPLA刺激脾脏细胞的增殖情况和刺激DC后成熟及吞噬能力的大小,对MPLA的体外免疫刺激效应进行评价;将MPLA与ISA 206和灭活FMDVO型抗原配制疫苗后免疫小鼠,通过检测抗体水平、T细胞亚群、抗原特异性淋巴细胞增殖及浆细胞的比例,评价MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强作用.【结果】MPLA体外可刺激B淋巴细胞增殖,上调DC表面共刺激分子的表达,使其吞噬能力减弱;制备疫苗免疫小鼠,血清抗体水平检测发现,MPLA组在7、14 d时抗体水平显著高于ISA 206组,且其抗原特异性的B淋巴细胞增殖,外周血中CD19+CD27+CD38+浆细胞的比例也显著高于ISA 206组.【结论】MPLA通过促进B淋巴细胞的增殖与活化增加了抗体的产生,增强了小鼠对口蹄疫疫苗的免疫应答能力,证实MPLA是口蹄疫疫苗的良好候选免疫佐剂.
关键词: MPLA ；口蹄疫 ；免疫 ；疫苗佐剂
被引量
1
摘要： 为探究免疫增强剂CVC1302对O型口蹄疫(FMD)细菌样颗粒(BLP)疫苗的免疫增强作用,本研究将革兰氏阳性增强基质(GEM)处理的口蹄疫病毒(FMDV)VP1结构蛋白表位的重组蛋白B(T1BT2)4B与CVC1302混合,与白油佐剂乳化制成疫苗,免疫4周龄ICR小鼠及45日龄FMDV抗体阴性仔猪。免疫后利用FMDV VP1结构蛋白ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清中的特异性ELISA抗体水平;利用淋巴细胞增殖试验检测免疫小鼠淋巴细胞增殖情况;利用荧光定量PCR方法检测免疫小鼠相关细胞因子水平以及利用液相阻断抗体检测试剂盒检测免疫仔猪血清中的液相阻断抗体滴度。结果显示,免疫增强剂CVC1302可以显著提高GEM-B(T1BT2)4B免疫后小鼠血清中的抗体水平(p<0.05);小鼠T淋巴细胞增殖率及细胞因子IL-4、IFN-γ的转录水平均显著升高(p<0.05);仔猪血清中的液相阻断抗体水平也明显高于对照组。以上结果表明免疫增强剂CVC1302可以提高O型FMD BLP疫苗的细胞免疫和体液免疫水平,对FMD BLP疫苗具有较好的免疫增强作用。本研究为提高FMD亚单位疫苗的免疫效力提供了新的思路。
关键词: 免疫增强剂 ；口蹄疫病毒 ；细菌样颗粒疫苗 ；免疫效力
被引量
1
摘要： 主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒VP1蛋白的串联编码基因,表达产物命名为OA-VP1。将上述T细胞免疫原分别与OA-VP1和口蹄疫灭活疫苗按不同剂量组合免疫小鼠,于免疫后不同时间测定各组小鼠的体液与细胞免疫应答情况。采用微量中和试验检测小鼠O型和Asia1型中和抗体,采用流式细胞检测技术和测定γ-干扰素的水平来分析不同免疫组小鼠细胞免疫的水平。结果显示,与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比,添加TI抗原后灭活疫苗(P<0.01)和OA-VP1免疫组(P<0.05)小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体;且CD4+T细胞数量显著增多I,FN-γ产生水平显著升高(P<0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用,是一种很好的免疫增效剂,可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成分,以提高疫苗的免疫效果。
关键词: 口蹄疫病毒 ；T细胞表位 ；T细胞免疫原 ；灭活疫苗 ；亚单位疫苗
被引量
6
摘要： 为探究黄芪多糖（APS）、甘草多糖（GPS）、白术多糖（RAMPS）、党参多糖（CPS）、人参根皂甙（GS-R）和人参茎叶皂甙（GSLS）的免疫增强作用,本研究将114只ICR小鼠随机分组进行实验.持续给药2周后免疫注射O型口蹄疫疫苗2次.二免后1～5周每周检测血清抗体.结果表明6种提取物口服均可不同程度提高小鼠口蹄疫抗原特异性IgG及其亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）的水平.其中口服GSLS （0.5 mg）、APS （25 mg）和GPS（25 mg）小鼠的抗体效价为1∶640、1∶640、1∶320,分别是对照组小鼠抗体效价（1：80）的8倍和4倍,具有显著性（p＜0.05）.本研究为GSLS、APS和GPS的增强疫苗免疫效果提供了实验依据.
关键词: 中药 ；皂甙 ；多糖 ；免疫 ；口蹄疫疫苗
被引量
10
摘要： 旨在研究猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,简称Mhp)纤毛黏附因子P97以及F7鞭毛蛋白(flagellin,简称F)-霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit,简称CTB)2种重组蛋白对口蹄疫(foot-and-mouth disease,简称FMD)灭活疫苗的免疫增强作用。通过体外表达获得pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R12种重组蛋白,用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,简称ELISA)方法检测pCold-F7-CTB蛋白的生物学活性,将重组蛋白分别与口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,简称FMDV)灭活抗原、口蹄疫灭活疫苗混合制备,皮下或腹腔接种Balb/c小鼠,共免疫2次,间隔3周。分别于免疫前、免疫后21、35、49d采血,49d后无菌摘取脾脏。采用阻断ELISA的方法检测小鼠血清口蹄疫O型病毒免疫球蛋白(IgG)抗体滴度,用流式细胞术检测脾淋巴细胞亚型比例,以评估免疫效力。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western Blot)分析结果表明,2种重组蛋白成功表达。用GMl(神经节苷脂)-ELISA方法验证pCold-F7-CTB的生物学活性,发现融合蛋白F7-CTB保留了与GMl的结合能力。小鼠免疫试验结果表明,经皮下注射接种后,单独口蹄疫病毒灭活抗原组没有产生明显的抗体水平,而F7-CTB免疫增强剂组比单独口蹄疫病毒灭活抗原组的IgG滴度更高。在试验中发现,当重组蛋白与口蹄疫灭活疫苗联合使用时,血清中的IgG滴度明显增高,CD3^+CD8^+T淋巴细胞比值上升;P97和F7-CTB混合使用对口蹄疫灭活疫苗的免疫增强效果最佳。可以初步得出,免疫增强剂P97和F7-CTB具有协同作用,皮下注射可显著提高FMD的特异性IgG水平,CD3^+CD8^+T淋巴细胞比值升高,显示其具有良好的应用前景。
关键词: 口蹄疫 ；P97 ；F7-CTB ；免疫增强剂
被引量
5
摘要： 用PCR扩增鼠伤寒沙门菌基因FliC,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建了克隆质粒pMD18-FliC。克隆质粒和pET-his载体用EcoR/Nhel双酶切,将得到的纯化基因FliC亚克隆至pET-his内,构建重组质粒pET-his-FliC。酶切、测序鉴定后,分别将重组质粒转染大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,菌体蛋白超声处理,上清液用AKTA Explorer蛋白纯化系统纯化。用SDS-PAGE分析所得蛋白,发现于约53 000处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带。293-mTLR5细胞活性检测表明该融合蛋白能刺激TLR-5通路,引起NF-κB的活化。用小鼠模型检验FliC对O型口蹄疫抗原的免疫增强作用,证明其对口蹄疫疫苗具有佐剂作用。
关键词: 鞭毛蛋白 ；口蹄疫疫苗 ；佐剂 ；TLR5
被引量
8
摘要： 为了探索壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的免疫增强作用,本研究利用O型口蹄疫病毒(FMDV)的病毒样颗粒作为抗原,通过Chitosan A或者加入白油后制成的混合乳Chitosan B两种壳聚糖凝胶微球与VLPs配伍免疫豚鼠,免疫后测定被免疫豚鼠的T淋巴细胞增殖情况,检测FMDV特异性抗体水平,观察计算攻毒后保护率。结果,壳聚糖季铵盐凝乳胶微球能够诱导豚鼠产生高水平的FMDV特异性抗体,T淋巴细胞增殖效果高于ISA201佐剂。此外,Chitosan B佐剂组优于Chitosan A佐剂组。上述结果说明,壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型FMD VLPs具有免疫增强作用,可以诱导VLPs的体液免疫和细胞免疫应答;壳聚糖季铵盐凝乳胶微球是一种具有潜力的疫苗佐剂,可以成为FMDV疫苗的候选佐剂。
关键词: 壳聚糖季铵盐凝乳胶微球 ；口蹄疫病毒 ；病毒样颗粒 ；佐剂
被引量
1
摘要： 为评价免疫增强剂对口蹄疫(FMD)灭活疫苗的免疫增强作用,本研究采用A1人参茎叶总皂苷、A2皂苷、A3左旋咪唑和A4牛巴氏杆菌4种免疫增强剂配制了11001、11002、11003、11004 4批次的FMD O型Asia-1型二价灭活疫苗(OS/99株+JSL/06株),以常规11005批商品苗为对照分别免疫动物,在攻毒的同时,采血进行淋巴细胞增殖检测、免疫血清检测、本动物保护试验评价疫苗效果。结果显示,11002和11004批疫苗安全合格,淋巴细胞增殖效果明显,免疫血清抗体水平比常规疫苗有显著提高(p<0.05),抗体阳转率、中和抗体高于常规灭活疫苗,本动物攻毒保护试验效果明显。结果表明,A2皂苷和A4牛巴氏杆菌两种免疫增强剂能够提高FMD灭活疫苗免疫效果。
关键词: 口蹄疫 ；灭活疫苗 ；免疫增强剂 ；淋巴细胞 ；抗体滴度 ；免疫效果
被引量
3
摘要： [目的]本文旨在研究Th表位肽和聚肌胞苷酸[Poly(I:C)]2种免疫增强剂对猪O型口蹄疫合成肽抗原细胞免疫和体液免疫的增强作用。[方法]将上述2种免疫增强剂分别与O型口蹄疫病毒(FMDV)合成肽抗原混合乳化,分组免疫Balb/c小鼠,分别在免疫后7、14、21和28 d检测小鼠血清中的VP1抗体、IL-4和IFN-γ水平,以及脾脏中T淋巴细胞转化率及脾脏组织形态变化。[结果]免疫后14 d Th表位肽疫苗组和Poly(I:C)疫苗组血清VP1抗体水平显著高于普通疫苗组(P<0.05),免疫后28 d Th表位肽疫苗组显著高于Poly(I:C)疫苗组和普通疫苗组(P<0.05)。细胞因子检测结果显示:免疫后14、21 d Th表位肽与Poly(I:C)疫苗组IL-4含量显著高于普通疫苗组(P<0.05),免疫后14 d Th表位肽疫苗组IFN-γ含量明显高于其他组(P<0.05),免疫后21 d Th表位肽与Poly(I:C)疫苗组IFN-γ含量显著高于普通疫苗组(P<0.05)。Th表位肽与Poly(I:C)均可使试验小鼠脾脏白髓区增大,着色加深,动脉周围淋巴鞘胀大,Poly(I:C)疫苗组淋巴细胞增殖系数显著高于其他各试验组(P<0.05)。[结论]Th表位肽和Poly(I:C)对猪O型口蹄疫合成肽抗原均有显著免疫增强作用,而Th表位肽可延长体液免疫持续时间。
关键词: 口蹄疫病毒 ；Th表位肽 ；聚肌胞苷酸 ；疫苗免疫增强剂 ；合成肽疫苗
被引量
5
摘要： 研究木鳖子提取物(ECMS)在Zmu-1:DHP和DHP2个豚鼠品系中,对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。将0.1mg ECMS和0.5mL O-AsiaⅠ型双价口蹄疫疫苗混合,免疫2个品系豚鼠,以疫苗组和空白组作对照。用间接血凝法测定O型疫苗持续期的血凝抗体效价;ELISA法测定抗O型疫苗VP1结构蛋白的IgG、IgG1及IgG2;ELISA法测定抗AsiaⅠ型疫苗的IgG、IgG1及IgG2;用流式细胞法和ELIS法,分别测定T淋巴细胞增殖率及淋巴因子。实验结果表明,(1)药物处理组豚鼠B、T淋巴细胞,比疫苗组产生明显的特异性免疫反应(P<0.01或P<0.05)。(2)ECMS能诱导FMD O型疫苗产生较高滴度的IgG及IgG2抗体,但维持时间较短,而诱导AsiaⅠ型疫苗产生的抗体滴度较低,但持续时间较长。(3)药物组能诱导T细胞产生较高滴度的IFN-γ。(4)DHP豚鼠中,ECMS对两个疫苗均有较显著的免疫增强作用,而Zmu-1:DHP豚鼠只对AsiaⅠ免疫增强作用较明显。(5)DHP豚鼠的多数免疫功能大于Zmu-1:DHP豚鼠。实验结果证明:豚鼠是研究ECMS免疫功能较适宜的动物模型;豚鼠品系间的免疫反应存在明显地遗传差异;ECMS对O型苗的免疫增强作用较显著,并主要由IgG2和IFN-γ参与免疫反应。
关键词: 木鳖子提取物 ；豚鼠品系 ；口蹄疫双价疫苗 ；遗传作用 ；T、B淋巴细胞 ；免疫增强作用
被引量
2
摘要： 口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是一种烈性传染病,由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起,发病急,传播方式多样。注射疫苗仍是现阶段防控口蹄疫的有效措施。因单独的灭活口蹄疫病毒大多免疫原性低,急需合适的佐剂提升其免疫效力。P97作为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）纤毛粘附因子,诱导以黏膜免疫和细胞免疫为主的免疫应答。鞭毛蛋白（Flagellin,F）是天然免疫应答的诱导剂,以偶联或融合形式作为佐剂已被频繁报道。霍乱毒素B亚基（Cholera toxin B subunit,CTB）具有良好免疫佐剂活性,黏膜途径免疫其效果更佳。本研究以P97、F7-CTB为佐剂,与口蹄疫灭活病毒或口蹄疫灭活疫苗混合的形式免疫接种小鼠及猪,通过检测特异性Ig G抗体、Ig A抗体滴度、脾脏淋巴细胞亚型比例和细胞因子的表达,评估对疫苗的免疫增强效力,以期筛选针对FMD疫苗的良好佐剂。主要研究内容分为以下4部分:1、猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强的研究将pET32a-P97-R1重组质粒转化至Trans5α感受态细胞,提取的质粒经限制性内切酶消化,测序正确后将目的质粒再转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,体外诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE分析,重组蛋白分子量为26.5k D,证明重组P97获得成功表达。将25只6周龄的Balb/c小鼠随机分为5组,分别接种PBS、口蹄疫灭活疫苗、P97+口蹄疫灭活疫苗、灭活FMDV、和P97+灭活FMDV以评价它们诱导免疫应答的能力。结果显示:经过2次免疫后,相比PBS阴性对照组,所有免疫组Ig G均有不同程度的升高。其中,P97试验组与相应对照组略有差异;Ig A抗体:除PBS组外,其余组别都有上升。首免21d,P97+灭活FMDV是灭活FMDV的4倍。随后持续升高;脾脏淋巴细胞CD3+CD4+和CD3+CD8+比例:P97试验组及相应对照组的CD3+CD4+淋巴细胞比值略高于PBS阴性对照,而在CD3+CD8+变化上,试验组均略低于对照组0.03%-1%不等;细胞因子的表达水平:含P97的试验组在干扰素（Interferon,IFN）-γ表达水平上与相应对照组处于持平或略低的状态。检测白介素（Interleukin,IL）-4含量,P97+灭活FMDV为53.75pg/ml,其略高于灭活FMDV（50.93pg/ml）。测定的肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α浓度,除PBS组外,4个免疫组差异最大仅有9.36ng/L。本次试验表明,Mhp纤毛黏附因子P97在诱导Ig G、Ig A、CD3+CD4+/CD3+CD8+亚型比例和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达水平上,免疫增强效力较弱。2、F7-CTB对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强作用的研究酶切消化前期构建的pCold-I-F7和pUC57-CTB重组质粒,后将T4 DNA ligase连接的产物转化Trans5α感受态细胞,通过酶切及测序双重鉴定正确后,得到重组质粒p Cold I-F7-CTB。转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,进行诱导表达,SDS-PAGE显示,分子量为74.65 k D,证明重组F7-CTB获得成功表达。将25只6周龄的Balb/c小鼠随机分为5组,皮下注射。即PBS、灭活FMDV、F7-CTB+灭活FMDV、口蹄疫灭活疫苗和F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗免疫组,评价F7-CTB诱导免疫应答的能力。结果为:从Ig G滴度看,除PBS对照组外,剩余试验组抗体都有产生。首免35d,P97+灭活FMDV是灭活FMDV的10.42倍（P<0.01）,首免49d,为5倍（P<0.05）,仍保持优势。间接ELISA测得粪便中Ig A,相比PBS对照组,4个免疫组存在不同程度的升高,且在首免35d达到最高值。首免35d,F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗滴度是口蹄疫灭活疫苗的3.17倍。流式细胞仪检测后,发现比PBS组,其余各组CD3+CD4+淋巴细胞比例上升0.07%-0.57%不等。脾脏淋巴细胞CD3+CD8+比例,4个免疫组相对PBS阴性对照组小幅降低0.03%-1.23%。测定细胞因子水平,IFN-γ和TNF-α的浓度在免疫组别间最大差异仅是136.23ng/L和1.58ng/L。而P97+灭活FMDV的IL-4含量为55.54pg/ml,略高于灭活FMDV。本次试验表明,F7-CTB能更好地促进Ig G应答,且具有较弱的诱导Ig A、CD3+CD4+/CD3+CD8+亚型比例和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达水平的作用。3、猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97和F7-CTB对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强效果的研究将30只6周龄的Balb/c小鼠随机分为6组,即皮下途径免疫:P97+口蹄疫灭活疫苗、F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗和P97+F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗免疫组;腹腔途径免疫:P97+口蹄疫灭活疫苗PBS、F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗和P97+F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗免疫组。经2次免疫,评估不同免疫途径对体液免疫应答的影响,及皮下免疫途径组别两种重组蛋白免疫应答的联合作用。结果:首免35d和49d,P97+口蹄疫灭活疫苗的皮下注射途径显著高于对应腹腔免疫途径组（P<0.05）。亦有F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗及P97+F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗皮下免疫途径比腹腔途径Ig G抗体滴度分别高216和1318.5（P<0.05）,因此后续试验研究皮下接种组别。首免35d,P97+F7-CTB试验组Ig G抗体是P97试验组的3.26倍（P<0.05）;首免49d,P97+F7-CTB试验组是F7-CTB试验组的2.86倍（P<0.05）。Ig A水平在首免49d,P97免疫组、F7-CTB免疫组和联合应用组别存在一定的协同作用。脾脏淋巴细胞亚型比例显示,3个免疫组的CD3+CD4+差别在1.47%-5.33%,CD3+CD8+差别最大在2%。细胞因子表达的浓度:免疫组IFN-γ、IL-4和TNF-α的表达浓度差别最大分别为49.99ng/L、3.54pg/ml和2.7ng/L。本次试验表明,P97及F7-CTB联合应用皮下途径能更好地促进Ig G应答,在诱导Ig A、CD3+CD4+/CD3+CD8+亚型比例和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达水平的作用较弱。4、猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97和F7-CTB联合应用增强FMDV疫苗猪体免疫效果的研究将10头FMDV抗体检测呈阴性的60日龄猪,随机分为2组,即P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗和商品化灭活疫苗。肌肉注射,免疫1次,首免后第30d采血,检测血清中Ig G和Ig A。结果:在首免30d,P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗产生较高的Ig G水平,4/5头猪达到99%保护状态;商品化灭活疫苗组平均Ig G抗体滴度略低于P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗,1/5处于99%保护,但两组差异不显著（P>0.05）。Ig A抗体:商品化灭活疫苗只能产生少量的Ig A抗体,而P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗产生高水平的Ig A（P<0.05）。综上所述,F7-CTB在小鼠FMD特异性IgG水平上可显著增强。而佐剂P97和F7-CTB具有协同作用,通过皮下途径免疫,大幅提高FMD特异性Ig G水平,Ig A存在小幅升高,CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达增强幅度较弱,显示其具有良好的应用前景。由此推测,佐剂P97和F7-CTB的联合应用可能在小鼠和猪体内能有效地促进FMDV诱导的体液免疫应答,某种程度上加强对猪的免疫保护,其中还能增强猪体的黏膜免疫应答。本研究P97和F7-CTB的协同作用,为FMDV疫苗新型疫苗猪的研制提供新的思路。
关键词: FMDV ；P97 ；F7-CTB ；佐剂 ；免疫应答
摘要： 口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性传染病,主要感染牛,猪,羊等偶蹄动物,造成了巨大的经济损失。目前我国口蹄疫的防控主要以灭活疫苗免疫为主,但灭活疫苗在生产和应用中可能会引起散毒的安全隐患,因此出现了多种更安全的疫苗形式,如合成肽疫苗及病毒样颗粒疫苗等亚单位疫苗。随着蛋白工程的逐渐发展,又出现了以自组装蛋白为骨架制备的纳米颗粒(Nanoparticles,NPs)亚单位疫苗,相对于合成肽疫苗,纳米颗粒疫苗既保证了安全性,又能够展现抗原的构象表位,使其具有更优越的免疫原性,且制备工艺简单,稳定性强,具有广阔的发展前景。此外,为进一步提高疫苗的免疫效果,当前研究人员尝试利用不同的佐剂及免疫增强剂,其中细菌的鞭毛蛋白作为一种生物源性的免疫增强剂,可显著提升抗原免疫效果,而且鞭毛蛋白可和抗原蛋白融合表达,对目标抗原发挥时效性免疫具有促进作用。 本研究基于纳米颗粒的自组装特性和鞭毛蛋白的免疫增强作用,以天然自组装蛋白I301作为骨架,与O型FMDV主要抗原蛋白VP1及N端截短的鞭毛蛋白(N-terminus of flagellin,nFLiC)共价连接,利用含有小泛素样蛋白表达系统(small ubiquitin modifier,SUMO)的质粒pSMA构建了两个重组表达质粒,即含有鞭毛蛋白的pSMA-VP1-I301-nFLiC(PVIF)和不含鞭毛蛋白的pSMA-VP1-I301(PVI),以期获得重组融合蛋白。之后进行表达纯化并组装为纳米颗粒,并对其稳定性及免疫原性等进行评价。 研究结果表明: 1.两个重组融合蛋白在大肠杆菌中均获得有效表达,但可溶性表达量较少,大多以包涵体表达的形式存在,通过包涵体复性纯化方法可获得高纯度目的蛋白。 2.将重组融合蛋白PVIF和PVI置于不同pH条件下进行酶切组装,通过透射电镜、纳米粒度仪等方法进行表征,发现在pH为7.0-8.0时组装最佳,获得所需纳米颗粒。 3.将纳米颗粒置于不同温度条件下处理,随着温度的增高,纳米颗粒溶解性逐渐降低,纳米粒径逐渐增大。之后将纳米颗粒和VP1蛋白单体样品置于37℃进行长时间放置并利用dot blotting定量分析剩余有效抗原,结果表明,PVIF和PVI纳米颗粒相对于VP1蛋白单体具有良好的稳定性和抗逆性。 4.将纳米颗粒及VP1蛋白分别与细胞进行不同时间孵育,通过western blotting鉴定,发现纳米颗粒可被细胞成功摄取,且相同时间下的摄入量显著高于VP1蛋白单体。 5.利用纳米颗粒进行豚鼠免疫及攻毒实验,并进行特异抗体、中和抗体、细胞增殖实验及细胞因子检测,结果表明两种纳米颗粒均能产生特异抗体、中和抗体和较高水平淋巴细胞增殖反应,且上调相关细胞因子(IL-4,IL-12,TNF-α和IFN-γ)转录水平。攻毒后,纳米颗粒组最高获得了83%的理想保护效果。 综上所述,基于自组装蛋白设计获得的纳米颗粒,作为候选疫苗可产生特异免疫保护效果,为纳米颗粒在动物疫病防控领域的应用提供数据支撑。
关键词: 口蹄疫 ；鞭毛蛋白 ；纳米颗粒 ；稳定性 ；疫苗
摘要： 口蹄疫(Food-and-mouth disease,FMD)是一种由口蹄疫病毒(Food-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄动物烈性传染病,严重威胁全球畜牧业的发展。目前,接种FMDV灭活疫苗是有效预防和净化FMD的重要措施,但灭活疫苗存在热稳定性差、免疫持续期短等问题。因此,研制安全有效的FMDV新型疫苗是当前的趋势。基因工程技术及合成肽免疫原性的研究为FMDV新型疫苗的研发提供了新的方向。本研究拟应用昆虫细胞/杆状病毒真核表达系统研究针对我国目前流行的猪O型FMDV的多抗原表位疫苗。FMDV VP1蛋白具有良好的免疫原性,含有多个优势抗原表位。本研究将当前国内流行的猪O型FMDV中VP1优势T、B细胞表位序列进行重复串联获得重组基因RBT,将重组基因RBT与猪免疫球蛋白Ig G Fc进行串联获得重组基因RBTFc。本研究将目的基因RBT和RBTFc分别克隆至转移载体p Fast Bac Dual中,经PCR鉴定、双酶切鉴定及基因测序验证后,获得重组转移质粒p Fast Bac Dual-2RBT和p Fast Bac Dual-2RBTFc。将重组转移质粒p Fast Bac Dual-2RBT和p Fast Bac Dual-2RBTFc分别转化至携带杆状病毒质粒Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经蓝白斑筛选后,运用PCR技术检测目的基因与Bacmid的重组情况。结果表明,目的基因RBT、RBTFc分别与Bacmid发生特异性重组,获得重组杆状病毒质粒r Bac-RBT和r Bac-RBTFc。本研究将重组杆状病毒质粒r Bac-RBT、r Bac-RBTFc分别转染至Sf9细胞中,获得重组杆状病毒Ac-RBT和Ac-RBTFc。将重组杆状病毒Ac-RBT和Ac-RBTFc分别感染Sf9细胞,通过Western blot和间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence,IFA)检测细胞中重组蛋白RBT和RBTFc的表达情况。Western blot结果显示,在45 k Da和65 k Da左右存在特异性条带,与重组蛋白RBT和RBTFc大小相符;IFA结果显示,感染重组杆状病毒Ac-RBT和Ac-RBTFc的Sf9细胞在荧光显微镜下可观察到绿色荧光。结果表明,重组蛋白RBT和RBTFc在Sf9细胞中成功表达,且具有良好的反应原性。本研究采用绝对荧光定量法测定第3代重组杆状病毒Ac-RBT和Ac-RBTFc的病毒滴度。结果显示,第3代重组杆状病毒Ac-RBT和Ac-RBTFc的病毒滴度分别为4.9×10～9 pfu/m L和3.07×10～9 pfu/m L。本研究分别对重组蛋白RBT和RBTFc的表达条件进行优化,采取最优表达条件对RBT和RBTFc重组蛋白进行大量表达,超声破碎裂解细胞后,通过Western blot检测RBT和RBTFc蛋白的可溶性。结果显示,超声上清样品RBT和RBTFc分别在45 k Da和65 k Da左右存在特异性条带,与RBT和RBTFc蛋白大小相符,表明RBT和RBTFc蛋白具有可溶性。我们分别将RBT和RBTFc蛋白配合ISA 201VG佐剂制备疫苗。将疫苗免疫SPF级BALB/c小鼠以初步评估疫苗的免疫原性。实验分组分别为RBT组、RBT+核酸佐剂(Nucleic acid adjuvant,NAA)组、RBTFc组、RBTFc+NAA组、FMDV灭活疫苗组和PBS对照组。首次免疫后14 d以相同剂量进行二免,于首免后7 d、14 d、21 d、28 d对各组动物进行采血,检测BALB/c小鼠血清中特异性抗体水平。结果显示,除PBS对照组外,各实验组均产生FMDV特异性抗体,且各组间抗体水平无显著性差异。结果表明,本研究制备的多抗原表位疫苗均能有效诱导BALB/c小鼠产生FMDV特异性抗体。为了进一步评估疫苗对猪的免疫原性,将疫苗免疫2月龄的猪,实验分组分别为RBT组、RBT+NAA组、RBTFc+NAA组、FMDV灭活疫苗组和PBS对照组。首次免疫后28 d以相同剂量进行二免。于首免后14 d、21 d、28 d、35 d、42 d进行采血,检测猪血清中特异性抗体水平。结果显示,除PBS对照组外,各实验组均产生较高水平的FMDV特异性抗体;首免后,RBT+NAA组特异性抗体水平显著高于RBT组(p<0.05);二免后,RBTFc+NAA组的猪血清特异性抗体水平显著高于RBT+NAA组(p<0.05)。结果表明,本研究制备的多抗原表位疫苗均能有效诱导猪产生FMDV特异性抗体,且NAA和Ig G Fc结构域对多抗原表位疫苗有明显的免疫增强作用。综上,本研究表达的猪O型口蹄疫病毒多抗原表位重组蛋白具有良好的免疫原性,为FMDV多表位疫苗的研发提供了理论基础和技术支撑。
关键词: FMDV ；抗原表位 ；免疫球蛋白 ；杆状病毒表达载体 ；多表位疫苗
摘要： 佐剂(Adjuvant)是一类可提高疫苗免疫效力的非特异性免疫增强剂。其中新型核酸佐剂是以具有免疫刺激活性的核酸片段为主要成分的新型佐剂,因其安全、免疫增强作用高效的特点而广受关注。然而,目前新型核酸佐剂的研究主要聚焦于单一种属动物特异的免疫刺激序列,对于多种属动物具有广谱免疫增强优势的新型核酸佐剂的研究尚少。为筛选出对猪PBMC具有增殖优势的免疫刺激序列,本研究通过猪淋巴细胞转化实验,采用CCK-8法检测了本实验室前期构建的7种携带不同免疫刺激序列的重组质粒(分别为pc DNA3.1-1～7)对猪外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的刺激增殖作用。结果显示,重组质粒pc DNA3.1-6对猪PBMC的刺激增殖效果高于其他质粒,刺激细胞增殖的效果与质粒的量呈正相关。为进一步分析重组质粒pc DNA3.1-6刺激对猪PBMC免疫分子的影响,本研究采用q RT-PCR的方法分析了重组质粒pc DNA3.1-6对猪PBMC TLR9信号途径的关键分子髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,My D88)及其下游细胞因子转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)和白细胞介素-12(Interleukin-12,IL-12)m RNA水平的影响。结果显示,重组质粒pc DNA3.1-6可显著上调猪PBMC My D88和IL-12 m RNA水平,下调TGF-β和IL-10m RNA水平,表明重组质粒pc DNA3.1-6可能通过TLR9信号途径促进猪PBMC Th1型细胞因子表达,抑制Th2型细胞因子表达。上述实验表明,本研究筛选出的重组质粒pc DNA3.1-6是对猪PBMC具有免疫增强优势的核酸序列。结合本实验室前期研究发现:7种重组质粒中重组质粒pc DNA3.1-6同样对鸡PBMC具有增殖增强优势,提示对鸡和猪均具有较强免疫刺激作用的重组质粒pc DNA3.1-6可作为重点研究对象。为筛选可高效稳定制备重组质粒pc DNA3.1-6的优势菌株,本研究将该质粒分别转化至大肠杆菌DH5α和大肠杆菌JM110中进行同条件培养,通过商品化试剂盒提取质粒,计算分析质粒获得量。结果显示,大肠杆菌DH5α宿主菌所得质粒约是大肠杆菌JM110宿主菌的2.5倍。本研究将重组质粒pc DNA3.1-6转化至大肠杆菌DH5α中,连续划线传代培养50代,每5代测序鉴定其遗传稳定性。结果显示,重组质粒pc DNA3.1-6在DH5α宿主菌中50代内无突变缺失现象。表明重组质粒pc DNA3.1-6可在大肠杆菌DH5α中稳定遗传。上述实验表明,大肠杆菌DH5α可作为重组质粒pc DNA3.1-6高效稳定制备的工程菌株。本研究在碱裂解的原理基础上,优化质粒提取步骤得简化法,简化法提取重组质粒pc DNA3.1-6的产物称为新型核酸佐剂pc DNA3.1-6。为评价新型核酸佐剂pc DNA3.1-6对禽用疫苗的免疫增强作用,本研究将新型核酸佐剂pc DNA3.1-6和商品化试剂盒法提取的重组质粒pc DNA3.1-6分别与H9亚型禽流感灭活疫苗联合免疫40日龄清远麻鸡,同时设立H9亚型禽流感灭活疫苗组和空白对照组。免疫后第7、14、21、28和35天采集各组鸡的翅下静脉血液分离血清,采用HA-HI方法检测H9亚型禽流感病毒抗体效价。结果显示,新型核酸佐剂pc DNA3.1-6和商品化试剂盒法所得的重组质粒pc DNA3.1-6分别与H9亚型禽流感灭活疫苗联用组的抗体效价均显著高于H9亚型禽流感灭活疫苗组,不同时间点新型核酸佐剂pc DNA3.1-6与H9亚型禽流感灭活疫苗联用组的抗体效价均高于商品化试剂盒法所得的重组质粒pc DNA3.1-6与H9亚型禽流感灭活疫苗联用组。结果表明,重组质粒pc DNA3.1-6可显著增强H9亚型禽流感灭活疫苗的抗体效价;新型核酸佐剂pc DNA3.1-6免疫增强作用优于商品化试剂盒所得的重组质粒pc DNA3.1-6。为评价新型核酸佐剂pc DNA3.1-6对猪用疫苗的免疫增强作用。本研究选取猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗与新型核酸佐剂pc DNA3.1-6联用免疫2月龄猪,同时设立猪O型口蹄疫病毒多表位病毒疫苗组和空白对照组,在首次免疫后第28天加强免疫。首免后第14、21、28、35和42天,采集猪前腔静脉血分离血清,用ELISA方法检测抗体水平。结果显示,在不同时间点,新型核酸佐剂pc DNA3.1-6和猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗联用组的抗体水平均高于猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗组;首免后第35天,实验组抗体水平均达最高,新型核酸佐剂pc DNA3.1-6和猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗联用组的抗体水平比猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗组高25%。结果表明,新型核酸佐剂pc DNA3.1-6可显著提高猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗的抗体效价。综上所述,本研究成功筛选出对猪PBMC具有增殖优势的重组质粒pc DNA3.1-6,确定了大肠杆菌DH5α为重组质粒pc DNA3.1-6的优势工程菌株,证明了简化法所得新型核酸佐剂pc DNA3.1-6可显著增强H9亚型禽流感灭活疫苗和猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗的抗体效价,为后续该新型核酸佐剂的应用提供了理论基础和技术支撑。
关键词: 免疫刺激序列 ；免疫分子 ；禽流感 ；口蹄疫
被引量
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摘要： 口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的急性烈性传染病,在我国列为一类传染病之首。目前疫苗强制免疫是我国防控口蹄疫的主要手段。现有商品化口蹄疫疫苗存在抗体产生慢,抗体水平不足,抗体持续期短等问题,而《国家中长期动物疫病防治规划》中要求,在2020年,口蹄疫基本达到免疫无疫,这就迫切要求改进现有疫苗的免疫效力。免疫增强剂是当前免疫学领域研究的热点,是快速提高疫苗免疫效力的手段,从化学本质上看,免疫增强剂包括多肽、脂质、核酸、多糖、糖脂、脂多肽和糖多肽等。与先天免疫相关的关键分子,能够有效的激活天然免疫反应和获得性免疫,是免疫增强剂研究的候选。在人用疫苗中已有商品化产品问世,目前在兽用疫苗上也是研究热点,但无商品化产品问世,因此本研究以先天免疫相关分子为研究对象,研制针对猪用口蹄疫灭活疫苗的高效免疫增强剂。本研究将先天免疫相关分子单独或组合后与灭活口蹄疫抗原混合制成疫苗,免疫仔猪,通过免疫后血清中的液相阻断ELISA(liquid phase block ELISA,LPB-ELISA)滴度来评价免疫效力,确定组方、免疫剂量和使用方式,研制出针对口蹄疫灭活疫苗的最优组方,命名为CVC1302。以猪体免疫试验(监测抗体持续期、细胞免疫和体液免疫)和攻毒保护效果为指标,全面评价了 CVC1302对FMD灭活疫苗的免疫增强效力;同时,测定了 CVC1302对仔猪的一般安全性、急性毒性和蓄积毒性;规模化的应用试验验证了 CVC1302的安全性和对大群免疫后的免疫增强效力;建立了小鼠PCV2感染模型,观察了在免疫应激条件下CVC1302对FMD灭活疫苗的免疫效力和对机体免疫应激的影响,最后,以注射部位和引流淋巴结抗原递呈细胞的活化、B细胞及Tfh细胞的活化及相关转录因子水平、骨髓中长寿浆细胞的比例等为指标,探讨了 CVC1302提高抗体效价和延长抗体水平的机制,为CVC1302的应用提供理论依据。试验分为以下四个部分:试验I.猪用FMD灭活疫苗免疫增强剂CVC1302的制备和效力评价为了提高现有灭活疫苗的免疫效果,将几种先天免疫相关分子单独或组合后配合FMD灭活疫苗免疫仔猪,进行最佳使用组方的研制,免疫后28天采血分离血清,评价血清中LPB-ELISA抗体水平,进一步通过猪体实验确定最佳免疫剂量和最佳使用方式;对最佳使用剂量下免疫增强剂对FMD灭活疫苗的免疫增强效力的系统评价:分别将添加免疫增强剂的FMD疫苗(FMD-CVC1302)和单独的FMD灭活疫苗(FMD-vaccine)免疫仔猪,进行效力试验(检测细胞免疫、体液免疫及抗体持续期)和攻毒保护试验。结果表明,通过猪体实验获得一种可以显著提高FMD灭活疫苗LPB-ELISA抗体的免疫增强剂即含有单磷酰脂质A、胞壁酰二肽和β-葡聚糖,进一步的剂量优化试验确定了最佳的使用剂量,命名为CVC1302。同时免疫增强剂即可以与抗原做为水相添加也可以制备为伴侣疫苗与商品化疫苗联合使用,配合FMD灭活疫苗免疫后LPB-ELISA水平可提高2～4倍,抗体合格率提高20～60%。与对照疫苗相比,添加CVC1302的FMD灭活疫苗组,LPB-ELISA抗体滴度显著提高(p<0.001),抗体持续期可达6个月以上,显著提高免疫后血清中IgG1和IgG2水平和相应细胞因子水平均显著提高(p<0.01),攻毒保护试验结果显示,显著提高攻毒前猪体LPB-ELISA抗体滴度和中和抗体滴度,并显著提高攻毒保护率至100%,使PD50从10.96提高到15.85,同时显著降低攻毒后猪体的排毒量和排毒时间。综上所属,本研究获得一种可以显著提高现有口蹄疫疫苗免疫效力的免疫增强剂。试验Ⅱ.猪用FMD灭活疫苗免疫增强剂CVC1302的安全性试验和临床应用为了进一步评价CVC1302作为疫苗添加物的安全性,通过CVC1302与疫苗联合使用后不同剂量免疫实验猪,确定其单剂量接种,单剂量重复接种,和超剂量接种后实验猪注射部位肌肉组织学观察、平均日增重、注射部位大体病变与组织切片观察。同时为了进一步明确CVC1302的安全性,将其水溶液进行了急性毒性(1倍、10倍、100倍剂量注射)和蓄积毒性试验(1倍、10倍、50倍剂量每次间隔3天,连续免疫7次),通过评价相对日增重、剖检观察全身变化及免疫系统相关器官外观及组织学观察,并计算心肝脾肺肾的脏器系数,来进一步确定其使用的安全性。为了评价CVC1302在临床应用中对口蹄疫疫苗的免疫增强效果,选择6个大规模的猪场进行大群的免疫试验,评价在不同养殖条件,不同疫苗免疫使用前提下,CVC1302的免疫增强作用;选择2个集团化猪场进行了免疫方式的改进试验,随后在县域内进行普免,评价针对更大群体的整体免疫增强效果。结果显示,CVC1302做为口蹄疫疫苗的添加物免疫无论是单剂量,单剂量重复还是超剂量免疫,对仔猪均安全,不影响疫苗的吸收,且对仔猪的生产性能和组织脏器等均无影响。急性毒性试验结果表明,在免疫后初期,中高剂量对相对日增重有影响。组织学观察结果表明,低剂量完全安全,中剂量(10倍剂量)对仔猪有轻微毒性;高剂量(100倍)主要影响肠道和肾脏,并由急性死亡可能。蓄积毒性试验结果表明,使用剂量7次注射对仔猪生长性能、相对日增重、脏器外观和组织病理学观察均无影响。10倍剂量无明显的蓄积毒性,50倍剂量存在弱蓄积毒性反应。表明CVC1302对猪的安全范围很广。临床应用结果表明,CVC1302对不同类型的口蹄疫疫苗均有明显的免疫增强作用(显著提高各亚型抗体合格率和LPB-ELISA抗体滴度),且无明显副反应;规模化猪场可以根据自身情况优化免疫程序,CVC1302与1/3头份的口蹄疫疫苗联合使用效果不低于1头份口蹄疫疫苗,添加CVC1302的口蹄疫灭活疫苗免疫3针,效力不低于单独的口蹄疫疫苗免疫3针,有利于猪场减低成本,减少猪群应激;进一步的临床推广试验证明CVC1302对于各种免疫条件的的猪场均可使用,且安全有效,可以用于广泛推广。试验Ⅲ.PCV2感染条件下猪用FMD灭活疫苗免疫增强剂CVC1302的免疫增强作用为了研究氧化应激状态下CVC1302对FMD灭活苗的免疫增强作用,首先采用小鼠构建PCV2小鼠感染模型,筛选最佳攻毒剂量。再将80只小鼠随机均分为4组,除空白对照(PBS)组外,其余3组分别腹腔PCV2病毒液攻毒,诱发PCV2感染模型即氧化应激模型,攻毒后第7d,试验(PCV2-FMD-CVC1302)组和疫苗对照(PCV2-FMD)组分别免疫含CVC1302的FMD疫苗和FMD疫苗,攻毒对照组和空白对照组不免疫。分别于攻毒后和免疫后不同时间点采集脾脏检测PCV2病毒载量、脾脏淋巴细胞ROS水平、观察组织病理学变化,采血测定血清FMD抗体、血清细胞因子IFN-γ、IL-4的含量;于免疫后第3d采血,测定血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量,计算GSH/GSSG比值。结果显示,氧化应激模型诱发成功,PCV2感染明显引起小鼠的氧化应激反应,CVC1302能够降低PCV2感染小鼠脾脏中的病毒含量,减轻脾脏病理损伤;PCV2-FMD-CVC1302组的抗体水平和细胞因子水平显著高于 PCV2-FMD 组(p<0.01);PCV2-FMD-CVC1302 组 MDA 含量(p<0.05)和 GSSG显著低于PCV2和PCV2-FMD组(p<0.001);SOD活性、CAT浓度和GSH含量显著高于PCV2和PCV2-FMD组(p<0.001),与PBS对照组无显著性差异GSS/GSSG的比值也显著提高(p<0.01)。结果表明,在PCV2病毒感染状态下,CVC1302能显著提高FMD疫苗的免疫效果,其特异性抗体产生不受影响,且对机体的氧化应激有一定的抵抗作用。试验Ⅳ.CVC1302诱导猪用FMD灭活疫苗产生长效抗体的机理研究为了明确CVC1302提高口蹄疫灭活疫苗免疫效力的作用机制,将CVC1302分别以水溶液与抗原混合和伴侣疫苗与灭活疫苗共同免疫两种方式进行注射部位和效应部位的机制研究。首先取6～8周龄小鼠54只,随机均分为3组。分别后退肌肉注射PBS、FMD 灭活抗原(FMDV)、CVC1302 水溶液+FMD 灭活抗原(FMDV-CVC1302),分别于注射后第6h、1 d,每组抽取3只小鼠,取注射点肌肉检测趋化因子的转录、表达水平;于注射后第1、3、5、7、14d,每组抽取3只小鼠,取注射点肌肉及附近腹股沟淋巴结,进行抗原递呈细胞募集检测。结果显示,与FMDV组相比,FMDV-CVC1302组在注射部位抗原递呈细胞的活化和募集快速提高,在注射1天内,注射部位DC、单核细胞和单核巨噬细胞的趋化因子的mRNA和表达水平也显著提升,在注射后3天达到高峰,特别是DC细胞活化最为明显;在注射后第3天,各类抗原递呈细胞比例显著提高;腹股沟淋巴结的抗原递呈细胞活化情况与注射部位类似,但活化的最高点推迟到注射后5天,之后开始下降。其次取6-8周龄小鼠45只,随机分均为3组。分别后腿肌肉注射206佐剂(control)、FMD灭活疫苗(FMD-vaccine)和含CVC1302的FMD灭活疫苗(FMD-CVC1302)。于免疫后监测血清FMD LPB-ELISA抗体持续期,免疫后28天,检测FMDV特异性IgGl和IgG2a抗体、IFN-γ分泌型CD3+CD4+T细胞、腹股沟淋巴结淋巴细胞IFN-γ转录与表达、CD3+CD4+T细胞、GCB细胞和滤泡辅助性滤泡T细胞(Tfh)比例,生发中心数目、B细胞和辅助性滤泡T细胞趋化因子Bcl-6、IL-21mRNA水平、骨髓淋巴细胞中长寿浆细胞比例。结果显示,与FMD-vaccine组相比,FMD-CVC1302组的血清的LPB-ELISA抗体水平显著提高,抗体持续期显著延长,不短于5个月;血清中IgG1和IgG2a水平也显著提高,腹股沟淋巴结的IFN-γ的mRNA和表达水平,腹股沟淋巴结中的B细胞和Tfh细胞数目和相应趋化因子水平显著提升,生发中心数目、B细胞转化为浆细胞的各转录因子水平也变化显著(p<0.001);骨髓中长寿浆细胞的比例在免疫后1、3、5个月中都显著高于FMD-vaccine组(p<0.01)。以上结果表明,CVC1302可以显著提高注射部位和引流淋巴结的APC的活化进而启动高效的免疫反应,同时,在腹股沟淋巴结产生高亲和力的B细胞,提高抗体水平,提高生发中心数量,在各类转录因子的作用下,使B细胞高效的转化为浆母细胞,进而提高骨髓中长寿浆细胞的数目,维持长效的抗体持续期。
关键词: 口蹄疫灭活疫苗 ；免疫增强剂 ；免疫效力 ；氧化应激 ；长寿浆细胞
摘要： 免疫功能低下使动物对病原微生物的抵抗力降低，生产性能下降，是畜牧生产中的常见问题。白术、黄芪、甘草和党参是临床常用的补气中药，具有增强机体免疫功能的作用。多糖是该类中药的重要活性成分。本文分别从这四种中药提取多糖成分，将多糖和植物油混合制成油乳剂，研究注射多糖油乳剂对小鼠血清IFN-γ水平的影响，在此基础上进一步研究对IFN-γ具有显著促进作用的多糖油乳剂对口蹄疫疫苗免疫的增强作用，为中药多糖的进一步研究与开发提供参考。 1.多糖的提取分离 通过煎煮，分别从生药白术（Rhizoma Atractylodis Macrocephalae）、黄芪（RadixAstragali）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）及党参(Codonopsispilosula(Franch.)Nannf）中获得提取液。用过滤、过大孔树脂柱、sevage法及透析等方法除去粗提取液中的不溶性成分、色素、蛋白质及小分子物质等杂质，最后冻干，四种多糖。用苯酚-硫酸法测定多糖含量，白术多糖(RAMPS)的纯度为89.6％;黄芪多糖(APS)的纯度为84.3％;甘草多糖(GPS)的纯度为82.7％;党参多糖(CPS)的纯度90.0％。 2.多糖及相应油乳剂对机体腹腔巨噬细胞的影响 通过碳粒廓清实验检测不同剂量RAMPS对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响，综合考虑，我们选择了1.38 mg/只作为RAMPS的使用剂量。用含3％吐温80水相与含8％司盘80油相以1∶1体积比制备浓度为1.38mg/mL的RAMPS油乳剂，在注射后第二周和第三周，注射RAMPS油乳剂小鼠的廓清指数与吞噬指数开始显著高于RAMPS水溶液组小鼠（P＜0.05），并在实验周期内都保持了较高的水平，说明RAMPS油乳剂有较强的缓释作用。 3.多糖及相应油乳剂对机体IFN-γ水平的影响 以不同剂量RAMPS水溶液腹部皮下注射小鼠，检测小鼠血清1FN-γ水平的变化。结果发现以1.38mg/只剂量组的IFN-γ水平最高(P＜0.05)，因此将1.38mg/只作为后续实验中的多糖使用剂量。以相同方法制备浓度为1.38 mg/只的RAMPS油乳剂，皮下注射该油乳剂后第二天小鼠血清IFN-γ水平即达到最高水平(479.67 pg/mL);注射后四周内，RAMPS油乳剂组的血清IFN-γ水平均显著高于RAMPS水溶液组（P＜0.05）。以相同方法制各黄芪、甘草和党参多糖油乳剂，注射小鼠并检测注射后第二天时小鼠血清IFN-γ水平的变化，结果显示三种多糖油乳剂对小鼠血清IFN-γ水平的提升效果显著高于相应的多糖水溶液(P＜0，05)。四种多糖的油乳剂比较，以RAMPS油乳剂对小鼠血清IFN-γ水平的提高作用最强。 4.RAMPS与植物油复合佐剂对O型口蹄疫抗原免疫作用影响 将灭活口蹄疫(FMD)病毒抗原分别与生理盐水、RAMPS水溶液、含或不含RAMPS的植物油制备疫苗，腹部皮下注射免疫小鼠两次，间隔三周，检测血清FMD特异性抗体及其亚类。结果表明，与生理盐水组相比，三种物质均可使小鼠血清抗体水平升高，以含RAMPS的植物油乳化剂促进抗体升高作用最为显著(P＜0.05)。RAMPS偏向于促进IgG2a水平的升高，植物油偏向于促进IgG1水平的升高。两者结合后大幅度促进了IgG1和IgG2a水平的升高。血清IFN-γ检测结果表明，只有RAMPS和含RAMPS的植物油乳化剂可促进IFN-γ显著升高(P＜0.05)，而植物油则不能。考虑到含白术多糖植物油乳剂对FMD疫苗显著免疫增强作用，它作为一种兽用疫苗佐剂值得深入研究。 综上所述，从中药白术、黄芪、甘草和党参提取出四中多糖RAMPS，APS、GPS和CPS;四种多糖制成的油乳剂注射小鼠后对血液IFN-γ的提升作用显著强于它们相应的水剂，以RAMPS油乳剂对IFN-γ的提升作用最强;含RAMPS的油乳剂对FMD疫苗具有佐剂作用，可显著增强FMD疫苗诱导的特异性免疫应答水平。
关键词: 植物补气中药 ；多糖成分 ；干扰素-γ ；口蹄疫疫苗 ；免疫活性
被引量
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摘要： 疫苗免疫是养殖业控制动物疫病的主要措施之一。但现代畜牧业由于集约化饲养以及应激等因素可导致动物免疫功能下降,从而使动物对疫苗免疫的应答能力降低,引起免疫失败。补气类中药具有提高动物免疫机能的作用。人参和黄芪是重要的补气中药,多糖和皂苷是补气类中药的重要化学部位,本文以小鼠为实验动物,研究口服黄芪多糖、人参茎叶皂苷对口蹄疫(foot-and-mouth diseases,FMD)疫苗免疫的影响。由于大多数中药的给药途径是口服,给药后药物直接作用于消化道,近年来研究发现,肠道黏膜免疫系统对于维持机体消化器官完整性和发挥局部免疫调节作用都至关重要,因此,口服黄芪多糖、人参茎叶皂苷对肠道黏膜免疫的影响也是本研究的重点。研究结果可为采用中药多糖和皂苷提高动物免疫机能提供依据,并为探讨它们的免疫增强作用机理提供参考。1 口服黄芪多糖对口蹄疫疫苗免疫的影响为了探究口服黄芪多糖对口蹄疫疫苗免疫效果的影响,将24只小鼠按体重随机分为4组,每组6只。第1组为生理盐水对照,第2～4组每只小鼠每天口服含25 mg、50mg、100mg黄芪多糖的水溶液,连续4天。最后一次给药后24 h,每只小鼠在腹股沟部皮下注射FMD疫苗(OS/99+OZK/93株)0.2mL,2周后加强免疫一次。二免后1-5周采集血液分离血清,用间接ELISA法检测FMD特异性IgG及其亚类。结果表明:二免后3周,与对照组相比口服25 mg黄芪多糖可显著提高小鼠血清FMD特异性IgG、IgG亚类水平(P＜0.05),说明口服黄芪多糖对FMD疫苗免疫具有增强作用。2 口服黄芪多糖对脾淋巴细胞增殖及肠道黏膜免疫的影响为了探究口服黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对脾脏淋巴细胞增殖及肠道黏膜免疫的影响,将40只小鼠随机分为2组,每组20只。实验组每只小鼠口服含25 mg黄芪多糖水溶液,连续4天,对照组口服生理盐水为对照。用药后第0、1、2、3周,每组处死5只小鼠,收集脾脏制备脾淋巴细胞悬液进行脾淋巴细胞增殖实验(MTT法);采集十二指肠组织,采用免疫组化方法检测肠黏膜上皮内淋巴细胞和固有层IgA+细胞。结果显示:口服黄芪多糖后1、2周,小鼠脾淋巴细胞对刀豆蛋白A(conconavalin A,ConA)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激引起的增殖反应显著高于对照组(P<0.05);口服黄芪多糖后0、1、2周,小鼠十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞及固有层IgA+细胞数显著高于对照组(P＜0.05),说明口服黄芪多糖能够促进机体的细胞免疫反应和肠道黏膜免疫反应。3 口服人参茎叶皂苷对口蹄疫疫苗免疫的影响为了探究人参茎叶皂苷对口蹄疫疫苗免疫的影响,将24只小鼠根据体重随机分为4组,每组6只。第1组口服生理盐水为对照,第2～4组每只小鼠每天口服含0.05 mg、0.5 mg、5 mg人参茎叶皂苷的水溶液,连续4天。最后一次给药后24h,每只小鼠在腹股沟部皮下注射FMD疫苗(OS/99+OZK/93株)0.2 mL,2周后加强免疫一次。二免后5周内每周采血,分离血清,间接ELISA法检测FMD特异性IgG及其亚类。结果表明:二免后3周,与对照组相比口服0.5 mg人参茎叶皂苷可显著提高小鼠血清口蹄疫特异性IgG、IgG亚类水平(P＜0.05),说明口服人参茎叶皂苷能够显著提高小鼠对口蹄疫疫苗的免疫反应。4 口服人参茎叶皂苷对脾淋巴细胞增殖及肠道黏膜免疫的影响为了探究口服人参茎叶皂苷对脾脏淋巴细胞增殖及肠道黏膜免疫的影响,将40只小鼠随机分为2组,每组20只。实验组小鼠口服含0.5 mg人参茎叶皂苷的水溶液,连续4天,对照组口服生理盐水。用药后第0、1、2、3周,每组处死5只小鼠,收集脾脏,制备脾淋巴细胞悬浮液,用于脾淋巴细胞增殖实验(MTT法);同时采集十二指肠肠段,采用免疫组化方法检测肠粘膜上皮内淋巴细胞和固有层IgA+细胞。实验结果表明口服0.5 mg人参茎叶皂苷后1、2周,小鼠脾脏淋巴细胞对Con A和LPS刺激引起的增殖反应显著高于对照组(P<0.05);给药后0、1、2周,小鼠十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞及固有层IgA+细胞数显著高于对照组(P＜0.05),说明口服人参茎叶皂苷能够促进机体脾脏细胞的增殖功能,增强机体的细胞免疫和体液免疫应答,同时也能增强肠道黏膜免疫。5黄芪多糖和人参茎叶皂苷免疫增强作用的比较研究为了比较口服黄芪多糖和人参茎叶皂苷对口蹄疫疫苗免疫的增强作用,将24只小鼠根据体重随机分为4组,每组6只。第1-3组每只小鼠分别口服生理盐水、含25mg黄芪多糖的水溶液、含0.5mg人参茎叶皂苷的水溶液,连用4天。给药后24小时,第1～3组小鼠每只腹股沟皮下注射O型FMD灭活疫苗(O/My98/XJ/2010株+O/GX/09-7株)200μL,间隔2周后加强免疫一次。第4组不免疫作阴性对照。各组小鼠于二免后1、2、3周采集血液,检测血清特异性IgG、IgG滴度及IFN-y水平。此外,二免后3周处死小鼠,采集十二指肠黏膜组织,采用RT-PCR方法检测肠道黏膜相关免疫基因mRNA表达。结果表明,口服黄芪多糖和人参茎叶皂苷能显著提升血清特异性IgG及IgG滴度水平,上调肠道黏膜组织趋化因子(CCL25、CCL28)、趋化因子受体(CCR9、CCR10)、CD80、CD86、MHC-Ⅱ、TLR4 及 NF-κB p65mRNA 表达水平,提示口服黄芪多糖和人参茎叶皂苷通过上调肠黏膜相关免疫基因mRNA表达,促进肠道上皮内淋巴细胞(IELs)和固有层IgA分泌型浆细胞归巢至肠黏膜上皮及固有层,同时能够促进肠黏膜树突状细胞的成熟,增强机体对抗原的递呈能力和刺激肠黏膜免疫细胞(主要是T、B细胞)活化,从而增强肠道黏膜免疫及获得性免疫应答水平。本研究结果表明口服黄芪多糖和人参茎叶皂苷,能够显著提升口蹄疫疫苗免疫血清特异性IgG、IgG亚类、IgG滴度水平,促进脾脏淋巴细胞经刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)诱导的增殖反应。免疫组化结果表明,口服黄芪多糖和人参茎叶皂苷显著增加肠道黏膜上皮内淋巴细胞(IELs)和固有层IgA分泌型浆细胞数目,从而提高肠道黏膜免疫。RT-PCR结果提示口服黄芪多糖和人参茎叶皂苷增强肠道黏膜免疫与肠黏膜组织相关免疫基因mRNA表达上调有关。综上所述,黄芪多糖和人参茎叶皂苷具有口服佐剂(oral adjuvant)作用,作为新型中药免疫增强剂改善和提高疫苗免疫效果和预防肠道病原感染都值得进一步深入研究。
关键词: 黄芪多糖 ；人参茎叶皂苷 ；口蹄疫疫苗 ；肠上皮内淋巴细胞 ；黏膜免疫
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