摘要: 苍术始载于《神农本草经》,为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎,现收录于2020年版《中国药典》(一部),具有燥湿健脾、祛风散寒等功效。苍术复杂的化学成分赋予了其抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种药理活性,临床上主要用于治疗湿阻中焦、风湿痹痛及风寒感冒等病症。目前,苍术化学成分和抗炎作用机制研究尚不够深入,其质量研究主要集中于指纹图谱及多组分含量测定,与药效活性关联不紧密,难以全面反映苍术的内在质量。 植物代谢组学作为代谢组学的一个重要分支,常采用超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用(UPLC-QTOF-MS/MS)等先进技术,全面表征植物整体化学成分的动态变化,结合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)等,对不同基源、不同产地和不同炮制方法的中药进行差异研究,并将化学成分与药理药效联系起来,挖掘潜在的活性成分,从而实现较全面的中药质量分析和控制。 本研究采用UPLC-QTOF-MS/MS技术快速鉴定北苍术和茅苍术化学成分,利用PCA和OPLS-DA等多元统计分析对二者化学成分进行差异分析。测定二者清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基的IC50值;建立脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)炎症模型,通过测定NO、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平评价苍术抗炎活性。利用灰色关联度分析(GRA)将化学成分峰面积与DPPH、ABTS、NO、IL-6和TNF-α相关联,筛选抗炎活性成分。进一步借助网络药理学对筛选出的抗炎活性成分进行靶点预测和富集分析,并对苍术素、苍术酮、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和绿原酸6个活性成分进行体外抗炎活性验证。最后以抗炎活性为导向,构建苍术UPLC指纹图谱结合多组分定量的质量控制模式,为有效控制苍术内在质量及临床合理用药提供科学依据。 目的:对北苍术和茅苍术进行化学成分表征及差异分析,筛选抗炎活性成分并进行药效验证,以抗炎活性为导向,建立苍术UPLC指纹图谱并进行多组分含量测定。 方法:1.基于UPLC-QTOF-MS/MS分析苍术化学成分采用SCIEX X500R QTOF液质仪,色谱柱型号为ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1×100 mm,1.8μm),以0.1%甲酸水-乙腈为流动相梯度洗脱,流速为0.3 m L/min,柱温25℃,进样量3μL。离子源为电喷雾离子源,采用正、负离子模式采集,利用SCIEX OS 3.0软件进行数据处理,鉴定10批北苍术和10批茅苍术的化学成分。通过韦恩图、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)、t检验和聚类分析,对北苍术和茅苍术化学成分进行差异分析,筛选出二者特有成分和共有差异代谢物。2.苍术抗炎活性研究及关联成分的筛选与验证2.1北苍术和茅苍术抗炎活性研究通过体外清除自由基实验测定阳性对照药维生素C、北苍术和茅苍术清除DPPH和ABTS自由基的IC50值;采用细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8)法测定阳性对照药地塞米松(DEX)、北苍术和茅苍术作用后RAW264.7存活率,筛选最适给药剂量;建立LPS诱导的RAW264.7炎症模型,以NO为指标,采用Griess试剂法筛选造模浓度和造模时间;采用Griess试剂法测定细胞上清液NO水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞上清液IL-6和TNF-α水平,检测北苍术和茅苍术对LPS诱导RAW264.7炎症反应的抑制作用。2.2北苍术和茅苍术抗炎活性成分的筛选以DPPH、ABTS、NO、IL-6和TNF-α为抗炎活性指标,通过GRA将其分别与北苍术和茅苍术正负离子模式下各成分峰面积进行关联分析,分别筛选出5个活性指标对应的抗炎活性成分,将5个指标相关成分取交集,分别得到北苍术和茅苍术的抗炎活性成分,取交集得到北苍术和茅苍术的共有抗炎活性成分。2.3苍术抗炎活性成分的验证2.3.1基于网络药理学平台验证抗炎活性成分利用网络药理学分析平台获得筛选出的抗炎活性成分靶点及炎症相关靶点,将二者的交集靶点进行基因本体(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析,预测苍术发挥抗炎作用的靶点、通路、生物过程、细胞组分和分子功能。2.3.2基于细胞实验验证苍术素等6个成分的抗炎活性采用CCK-8法测定苍术素、苍术酮、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和绿原酸6个抗炎活性成分对RAW264.7的毒性作用,筛选出低、中、高剂量进行后续实验;建立LPS诱导RAW264.7炎症模型,以地塞米松(DEX)为阳性对照药,采用Griess试剂法测定苍术素等6个活性成分的低、中、高剂量组对LPS诱导RAW264.7上清液中NO水平的影响;采用ELISA法测定苍术素等6个活性成分的低、中、高剂量组对LPS诱导RAW264.7上清液中IL-6和TNF-α水平的影响,检测其对RAW264.7炎症反应的抑制作用。3.基于抗炎活性建立苍术UPLC指纹图谱及多组分含量测定以10批北苍术和10批茅苍术为研究对象,以抗炎活性为导向,在245 nm和310 nm下分别建立UPLC指纹图谱并进行相似度评价,确定共有峰并进行指认,在310 nm下测定苍术素和绿原酸的含量。 结果:1.基于UPLC-QTOF-MS/MS分析苍术化学成分采用UPLC-QTOF-MS/MS从北苍术中鉴定出103个成分,包括28个萜类、16个糖类、16个苯丙素类、14个脂肪酸、10个有机酸、9个氨基酸及含氮化合物、6个酯类和4个炔类等其他成分;从茅苍术中鉴定出113个成分,其中包括31个萜类、18个脂肪酸、17个苯丙素类、14个糖类、11个有机酸、9个氨基酸及含氮化合物、8个酯类和5个炔类等其他成分。通过韦恩图发现北苍术特有21个成分,茅苍术特有31个成分。以“VIP>1,P0.05),茅苍术对IL-6的抑制能力明显高于北苍术(P<0.05)。2.2北苍术和茅苍术抗炎活性成分的筛选通过GRA从北苍术和茅苍术中分别得到93个和107个DPPH相关成分,69个和98个与ABTS相关成分,90个和104个NO相关成分,92个和105个IL-6相关成分,87个和100个TNF-α相关成分。5个活性指标相关成分取交集后,从北苍术中筛选出55个抗炎活性成分,从茅苍术中筛选出70个抗炎活性成分,二者取交集得到32个抗炎活性成分,包括绿原酸、苍术素、苍术酮、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ等。2.3苍术抗炎活性成分的验证2.3.1基于网络药理学平台验证抗炎活性成分网络药理学分析结果表明,抗炎活性成分预测得到428个靶点,与9674个炎症相关靶点交集得到382个共同靶点,可能作用于PI3K-Akt和MAPK等142条通路,与MAPK级联调节和炎症反应的调节等290个生物过程密切相关,涉及到复合体和薄膜筏等96个细胞组分以及蛋白激酶活性和核受体活性等155个分子功能。2.3.2基于细胞实验验证苍术素等6个成分的抗炎活性CCK-8实验结果表明,与对照组相比,25μg/m L的苍术素、80μg/m L的苍术酮及400μg/m L的绿原酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ显著抑制了RAW264.7的存活率(P<0.05,P<0.01),选取3.125、6.25、12.5μg/m L作为苍术素低、中、高剂量,选取10、20、40μg/m L作为苍术酮低、中、高剂量,选取50、100、200μg/m L作为绿原酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的低、中、高剂量。NO实验结果表明,与对照组相比,模型组的NO水平明显升高(P<0.01);与模型组相比,绿原酸低剂量组的NO水平有所降低(P<0.05),地塞米松(DEX)组和其他各剂量给药组的NO水平明显降低(P<0.01)。ELISA结果表明,与对照组相比,模型组的IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,DEX组及各剂量给药组的IL-6水平显著降低(P<0.01),DEX组、苍术素各剂量组、白术内酯Ⅰ各剂量组、白术内酯Ⅱ各剂量组、绿原酸高剂量组、白术内酯Ⅲ高剂量组以及苍术酮中、高剂量组的TNF-α水平显著降低(P<0.01),绿原酸中剂量组的TNF-α水平有所降低(P<0.05)。3.基于抗炎活性建立苍术UPLC指纹图谱及多组分含量测定245 nm下指纹图谱相似度为0.717~0.971,确定了13个共有峰,并进行了指认,包括苍术素、绿原酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮等;310 nm下指纹图谱相似度为0.663~0.964,确定了10个共有峰,并进行了指认,包括苍术素、绿原酸、白术内酯Ⅰ等。指纹图谱指认出的成分中,绿原酸、苍术素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮、(-)-氧化石竹烯、12(13)-环氧-9Z-十八碳烯酸和麝香酮为筛选出的抗炎活性成分。苍术素和绿原酸的线性范围分别为3.13~200.50μg/m L(R=0.9999)和1.58~101.00μg/m L(R=1.0000);苍术素和绿原酸的加样回收率分别为97.35%99.52%和96.76%99.86%,平均加样回收率分别为97.97%和98.25%,RSD分别为0.81%和1.07%;苍术素和绿原酸的含量范围分别为0.46%4.17%和0.09%2.01%。 结论:本研究基于植物代谢组学,对北苍术和茅苍术的化学成分进行快速表征,发现北苍术特有21个成分,茅苍术特有31个成分,从二者的82个共有成分中筛选出32个共有差异代谢物。关联分析筛选得到苍术素等32个抗炎活性成分,并验证了苍术素等6个成分的抗炎活性。分别建立了245 nm和310 nm下的苍术UPLC指纹图谱,并在310 nm下测得苍术素和绿原酸的含量,为有效控制苍术内在质量及临床合理用药提供科学依据。 摘要译文