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PHGDH介导的葡萄糖--αKG/Gly代谢异常通过表观遗传调控ADCYAP1/COL12A1基因转认领

作者：

李钰泉

学位授予单位：

中山大学

摘要：

背景：　　三阴乳腺癌(TNBC)是乳腺癌各种亚型中预后最差的一种，约占所有乳腺癌的15％左右。TNBC是一种分子多样的乳腺癌亚型，是根据其表达阴性的部分来定义的。TNBC的雌激素和孕激素受体免疫组织化学(IHC)染色低于1％，同时缺乏HER2蛋白过表达或HER2基因扩增（或两者同时存在），一般多发于年轻女性，并且通常预后很差。这种亚型的转移进展通常以早期复发和肝、肺和中枢神经系统转移为主要特征。转移性的三阴乳腺癌中位生存期低于12个月，其无进展生存期(PFS)也仅仅有1.7到3.7个月。然而，三阴乳腺癌暂未发现有效的靶向治疗手段，易于发生远处转移。目前，化疗仍是治疗三阴乳腺癌的重要手段之一，但是许多病人在治疗过程发生耐药。最近发表的临床研究表明，免疫治疗在TNBC的治疗模式中可能具有一定的价值。所以，发现更多的TNBC治疗靶点，是目前治疗这一棘手的乳腺癌类型的重要突破点之一。　　癌细胞中的代谢重编程有助于肿瘤微环境中的可持续细胞生长。代谢酶的调节及其相关效应被认为是用于协调细胞活动的重要营养传感机制，其直接影响代谢途径或参与非代谢活动。近年来，大量证据表明，代谢酶在特定营养状态下的细胞定位或活性改变，以及表达水平的变化，使代谢酶能够以精细而有效的方式控制细胞信号和肿瘤生物学进程，如基因表达，其中调节作用基本上归因于代谢产物的产生，这些代谢产物为蛋白质或染色质修饰反应提供原料。　　磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)负责丝氨酸生物合成途径的第一个限速步骤，将糖酵解中间产物3-磷酸甘油酯(3-PG)转化为3-磷酸羟基丙酮酸（3-PHP），最终进入一碳代谢。具体而言，第一步是将3-PG氧化为3-磷酸羟基丙酮酸盐(3-PPyr)，同时将NAD还原为NADH。该反应由PHGDH催化，PHGDH是调节3-PG进入SSP的关键酶。接下来，3-PPyr从谷氨酸中接受一个氨基，通过磷酸丝氨酸氨基转移酶1(PSAT1)的催化产生3-磷酸丝氨酸(3-PSer)和α-KG。最后，3-PSer在磷酸丝氨酸磷酸酶(PSPH)的作用下去磷酸化生成丝氨酸。在过去十年中，许多研究结果证实肿瘤细胞中丝氨酸摄取及其从头合成存在明显失调。此外，癌细胞使用PHGDH和NAD+将10％的由糖酵解产生的3-PG氧化成丝氨酸前体3-PPyr。同时，在多个癌种中都观察到PHGDH基因扩增，特别是在乳腺癌和黑色素瘤中，1p12染色体上的编码基因分别扩增了6％和40％。值得注意的是，在雌激素受体(ER)阴性的乳腺肿瘤中，PHGDH的蛋白水平增加了70％。越来越多的实验表明，PHGDH高表达已成为癌症中的常见现象。2011年，Locasale等人使用代谢组学方法发现PHGDH表达增加与增生性乳腺癌亚型相关。同年，Possemato等人开发了一种负选择RNAi筛选方法，使用小鼠原位的人类乳腺癌异种移植模型来识别新的癌症靶点，他们观察到ER阴性(ER-)乳腺癌中PHGDH蛋白水平升高70％。紧接着，2014年Songmi Noh及其同事评估了与丝氨酸代谢及临床结局密切相关的蛋白质，他们发现三阴性乳腺癌(TNBC)组织中表达最多的丝氨酸代谢相关蛋白是PHGDH，并且它与患者预后密切相关。最近，Murphy等人发现，ER-乳腺癌中高表达PHGDH的癌细胞对抑制NAD+挽救途径的反应极为敏感。对于ER阳性(ER+)乳腺癌，SSP代谢基因如PHGDH也存在异常激活的情况。Samanta等人发现，缺乏PHGDH的细胞致瘤性很弱;而在乳腺癌干细胞中抑制PHGDH的表达，能明显减弱其转移能力。总之，PHGDH的表达水平与各种乳腺癌的发生和恶性表型特征密切相关，并能最终影响患者的生存和预后。　　在过去的半个世纪里，对癌症的看法，从肿瘤的发生、生长到转移，都是由基因突变主导的。直到最近才认识到代谢和表观遗传学的重要性。广泛的细胞增殖是癌症的标志之一。为了支持肿瘤过度增殖的能量和合成代谢需求，肿瘤对营养物获取和代谢途径进行了重新编程。在这种背景下，在过去十年中，在癌细胞代谢领域进行的研究揭示了代谢改变与癌症进展之间的新联系。已知癌细胞在肿瘤发生和转移过程中改变其代谢特征，从而表现出严格调节的代谢可塑性程序。值得注意的是，已知某些代谢改变发生在表观遗传学水平，因此表观遗传学和代谢以相互作用的方式高度交织在一起。代谢途径中产生的代谢物，如糖酵解循环和氧化磷酸化，充当催化表观遗传修饰和转录调节的酶反应的辅因子或底物。一些研究还表明表观基因组对细胞代谢敏感。由于许多代谢改变以及随后发生的异常表观遗传调节在各种癌症类型中都很常见，因此它们是抗癌治疗的有希望的靶点。在本研究中，揭示了PHGDH扩增介导乳腺癌细胞代谢的最新发现，阐明了维持癌症生长所需的代谢需求，以及代谢改变对表观遗传学的影响。因此，与恶性肿瘤中的代谢组学分析和表观基因组相互作用有关的综合研究对于破译可用于开发强大抗癌疗法的潜在靶点至关重要。　　目的：　　获得PHGDH介导的葡萄糖-αKG/Gly代谢异常通过表观遗传调控ADCYAP1/COL12A1基因转录的可靠依据，阐明PHGDH过表达促进乳腺癌进展的作用及新机制，为将来以阻断该代谢通路作为防治三阴性乳腺癌的新靶标提供科学依据。　　方法：　　1、乳腺癌细胞系PHGDH表达水平检测及PHGDH过表达和下调稳转株构建。　　2、验证PHGDH的促癌作用。　　3、通过代谢组学分析PHGDH在乳腺癌细胞中的过表达主要介导的异常代谢途径。　　4、通过RNA-Seq和ATAC-Seq技术，取二者的交集筛选出PHGDH下游的目标基因。经过RT-qPCR验证，进一步筛选出与PHGDH表达水平同步变化的基因。　　5、针对前面筛选出的目标基因，在培养基中剥夺Ser和Gly之后，再回补相应的成份，然后进行RT-qPCR检测，来进一步明确PHGDH通过Gly/α-KG调控的目的基因。然后验证它们的促癌作用。　　6、在前面实验的基础上，在培养基中剥夺Ser和Gly之后，再回补相应的成份，来明确α-KG/Gly是否通过调控目的基因表达影响乳腺癌细胞增殖和侵袭。　　7、通过JASPAR预测目的基因的共转录因子，筛选出评分大于10分的转录因子及相应的结合位点序列。然后通过双荧光素酶报告基因(DLR)截短实验及ChIP-PCR等实验筛选并验证目的基因的转录因子及结合位点，并明确α-KG/Gly对转录的调控作用。　　8、通过ChIP-PCR、核浆分离等实验进一步探究α-KG/Gly调控转录的具体机制。　　结果：　　1、PHGDH介导葡萄糖-αKG/Gly代谢异常促进乳腺癌进展;2、PHGDH调控αKG/Gly代谢促进ADCYAP1/COL12A1表达;3、αKG/Gly通过影响SOX15/NRL转录活性促进靶基因表达。　　结论：　　我们的数据证明PHGDH介导的葡萄糖-αKG/Gly代谢异常通过表观遗传调控ADCYAP1/COL12A1基因转录，从而促进乳腺癌的进展。因此，我们的发现提示阻断该代谢通路可以作为防治三阴乳腺癌的新靶标。

摘要译文

关键词：

三阴性乳腺癌; ADCYAP1基因; COL12A1基因; 表观遗传调控; 代谢异常

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

免疫学

导师：

胡海

中图分类号：

R737.9[乳腺肿瘤⑨];R730.2[肿瘤病理学、病因学]

学科分类号：

100219[临床病理学]