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生物催化合成手性3-对氟苯基戊二酸单酯和L-叔亮氨酸研究认领

作者：

刘维明

学位授予单位：

南京工业大学

摘要：

生物催化因其具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、环境友好等优势而被广泛应用在医药、化工、农药、材料、能源等领域，其中手性药物中间体的合成是生物催化应用研究领域的热点。手性3-对氟苯基戊二酸单酯(3-FGAM)和L-叔亮氨酸(L-Tle)是医药化合物合成中重要的手性砌块，前者可用于合成抗抑郁药帕罗西汀和P2X7受体拮抗剂;后者是一种非蛋白质氨基酸，在手性配体、抗癌药及抗艾滋药等的合成中具有广泛应用。目前针对生物催化法合成手性3-FGAM的研究仍然较少，而L-Tle的生物催化合成则存在底物耐受性差、反应效率低等不足，因此研究二者的生物催化合成具有重要的理论意义和应用价值。　　本论文一方面对脂肪酶分别催化3-对氟苯基戊二酸二甲酯(3-DFG)和3-对氟苯基戊二酸酐(3-FGA)去对称制备手性3-FGAM的反应进行了研究，另一方面研究了两条绿色高效的生物催化合成L-Tle反应工艺，包括固定化青霉素G酰化酶(PGA)催化的动力学拆分N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸(N-Phac-DL-Tle)反应工艺和亮氨酸脱氢酶(LeuDH)/甲酸脱氢酶(FDH)偶联催化三甲基丙酮酸(TMP)不对称还原氨化反应工艺。主要研究内容和结论如下:　　1.研究了水/有机溶剂两相体系中脂肪酶催化前手性3-DFG去对称水解制备手性3-对氟苯基戊二酸单甲酯(3-MFG)的反应。确定了较佳的生物催化剂为固定化脂肪酶Novozym435，考察了助溶剂种类和浓度、缓冲液pH和离子强度、反应温度等因素对Novozym435催化该去对称水解反应的影响。在优化的反应条件下:0.2M，pH8.0磷酸盐缓冲液/MTBE(80/20，v/v)的两相反应体系，反应温度30℃，反应64 h产物(R)-3-MFG收率和ee值分别可达92.6％和95.6％。最后对固定化脂肪酶的操作稳定性进行了考察，结果发现Novozym435表现出良好的操作稳定性，重复利用10次后活性和选择性仍为其初始活性和选择性的95％以上。　　2.研究了有机相中脂肪酶催化内消旋3-FGA的去对称醇解反应。确定了较佳的醇解反应体系，即固定化脂肪酶Novozym435为生物催化剂，MTBE为反应介质，甲醇为酰基受体。考察了反应温度、底物摩尔比、底物浓度等因素对该去对称醇解反应的影响，结果表明最适反应温度为25℃，3-FGA与甲醇摩尔比为1∶2，3-FGA浓度为100 mM。在优化后的反应条件下，反应放大至克级规模，底物可完全转化，产物(S)-MFG分离收率和ee值分别为97.3％和80.1％。进一步通过采用甲苯/正己烷(2/1，v/v)混合溶剂对粗产物进行处理以提高产物光学纯度，产物ee值可提高至95.8％。考察了固定化脂肪酶Novozym435在该有机相反应体系中的操作稳定性，发现重复利用3次后活性和选择性即出现明显下降。最后采用分子对接手段对该去对称醇解反应的分子机制进行了初步解析，对采用不同结构的醇作酰基受体时脂肪酶表现出的不同催化性能进行了合理解释。　　3.研究了固定化PGA催化N-Phac-DL-Tle动力学拆分制备L-Tle的反应工艺。考察了pH、反应温度、底物浓度、反应时间等因素对反应的影响以及固定化PGA的热稳定性和操作稳定性。实验结果表明该反应可以去离子水为反应介质，底物浓度0.4 M，pH8.0，30℃反应4h转化率和产物ee值分别可达45.8％和＞99％。固定化PGA具有良好的操作稳定性，在底物浓度为0.4 M和0.8 M时重复利用50批次（每批次反应时间4h）和20批次(每批次反应时间8h)，剩余活力都可维持在初始活力的85％以上。在填充床反应器(PBR)中成功进行了多批次L-Tle的半连续制备，固定化PGA在PBR中表现出良好的稳定性，连续使用51 d后酶活性和选择性未出现明显下降。最后研究了D构型底物对映体的消旋再利用，160℃加热15 min可以使N-Phac-D-Tle消旋，并进一步用作动力学拆分制备L-Tle的底物。　　4.构建了共表达LeuDH和FDH的重组大肠杆菌并对其发酵产酶条件进行了优化。首先设计了双质粒共表达系统，构建了共表达LeuDH和FDH的重组菌E.coli BL21-1eudh-fdh，实现了来源于Lysinibacillus sphaericus CGMCC1.1677的LeuDH和来源于Candida boidinii的FDH在重组E.coli中的共表达。在摇瓶中对重组菌发酵培养基的碳氮源种类和浓度、初始pH以及诱导条件进行了优化，确定了优化的培养条件为:甘油和酵母膏为较佳的碳氮源，用量均为10g/L，初始pH为8.0，菌体密度(OD600)为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mM开始诱导表达，诱导温度和诱导时间分别为25℃和20 h，发酵最终菌体密度(OD600)可达8.6，LeuDH和FDH酶活分别可达1543.3 U/L和2572.4 U/L，是优化前的2.0和3.1倍。　　5.研究了重组菌表达获得的LeuDH和FDH的酶学性质并将重组菌用于催化TMP不对称还原氨化合成L-Tle中。酶学性质实验结果表明LeuDH的最适pH和最适温度分别为8.5和40℃，FDH的最适pH和最适温度分别为7.5和50℃。考察了LeuDH催化还原氨化反应的底物特异性，发现其对脂肪族α-酮酸表现出催化活性，但不能催化芳香族α-酮酸还原氨化为相应的L-氨基酸。采用粗酶液催化TMP的不对称还原氨化反应合成L-Tle，考察了pH、反应温度、辅底物浓度、底物浓度、酶量和辅酶用量等因素对L-Tle合成反应的影响，在优化后的反应条件下:pH8.5、0.75 M TMP、1.5 M甲酸铵、30g/L湿细胞和0.25 g/L NAD+，30℃反应6h转化率和ee值均＞99％。为了消除底物抑制效应，提高底物浓度，考察了不同底物补加策略对反应效果的影响，发现底物连续流加策略可有效消除底物抑制，最终底物浓度和时空收率可提高至1.50 M和32.8 g/L/h，反应效果优于已报道文献。以去离子水为反应介质，反应体系放大至1L规模时，该工艺仍可稳定运行，显示出良好的工业化应用前景。

摘要译文

关键词：

手性药物中间体; 3-对氟苯基戊二酸单酯; L-叔亮氨酸; 生物催化工艺

学位年度：

2014

学位类型：

博士

学科专业：

化学工程与技术;化学工艺

导师：

黄和

中图分类号：

TQ460.6[制药工艺]

学科分类号：

081702[化学工艺];083611[医药生物工程];1007[药学]