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生物酶法催化合成L-色氨酸研究认领

作者：

高亮

学位授予单位：

南京大学

摘要：

L-色氨酸是人体内8种必需氨基酸之一，在人和动物的生长发育及新陈代谢中起着重要作用，广泛用于医药、食品、化妆品和饲料等领域。随着基因工程技术和酶工程技术的发展，生物酶法合成L-色氨酸将具有更加广阔的应用前景。本文立足于生物酶法催化丙酮酸发酵液或L-丝氨酸合成L-色氨酸，具有重要的理论意义和应用潜力。　　将产气肠杆菌来源的色氨酸酶基因按照大肠杆菌偏爱密码子优化合成，克隆至质粒pET-30a上，将重组质粒转化到宿主细胞内，成功构建基因工程菌[pET-30a-TEN/BL21(DE3)]。酶学性质研究确定最优转化条件为:氨水调pH9.0，温度35℃，氯化铵浓度400 mmol/L，PLP浓度2 mmol/L。分别以质量浓度为10 g/L的丙酮酸发酵液，质量浓度为11.93 g/L的L-丝氨酸为底物酶法合成L-色氨酸，结果表明丙酮酸工艺酶活大约是丝氨酸工艺的1.4倍。　　建立了丝氨酸脱氨酶与色氨酸酶偶联反应体系酶法制备L-色氨酸，即采用丝氨酸脱氨酶催化L-丝氨酸生成丙酮酸，色氨酸酶催化丙酮酸和吲哚合成L-色氨酸。并对双酶偶联反应的酶学性质和工艺路线进行优化，双酶偶联体系最适反应条件为双酶质量配比0.7，氨水调pH9.0，温度40℃，氯化铵浓度350 mmol/L，2 mmol/L PLP。以3％L-丝氨酸为底物，双酶偶联催化制备L-色氨酸，反应24 h，L-色氨酸转化率达84.3％。　　构建丝氨酸脱氨酶和色氨酸酶共表达基因工程菌，即将色氨酸酶基因TEN克隆在重组质粒pETDuet-1-SdaA中，然后将重组质粒转化到宿主细胞，成功构建了共表达基因工程菌[pETDuet-1-TEN-SdaA/BL21(DE3)]。在100 mL2％L-丝氨酸反应体系中，通过流加方式添加吲哚乙醇溶液，利用色氨酸酶基因工程菌单菌单酶法反应24 h，L-色氨酸产量为2.02 g，底物转化率为52％;利用共表达基因工程菌单菌双酶法反应24 h，L-色氨酸产量为2.36 g，底物转化率达60.8％。结果表明，以L-丝氨酸为底物单菌双酶法产L-色氨酸的底物转化率约为单菌单酶法产L-色氨酸的1.17倍。　　本文在第五章部分，成功构建人来源的氨基酰化酶Ⅲ基因工程菌[pETDuet-1-hACY3/BL21(DE3)]，并且与本课题组已有的N-乙酰-鸟氨酸脱乙酰酶(NAO)进行酶学性质比较。酶学性质研究确定最优转化条件为:氨水调pH6.0，温度50℃，锌离子浓度为1mmol/L，PLP浓度2 mmol/L。hACY3对N-乙酰-L-芳香族氨基酸表现出较好的底物特异性。与NAO相比，hACY3对N-乙酰-L-苯丙氨酸和N-乙酰-L-色氨酸的酶活分别提至1.6倍和1.39倍。在0.2 mol/L的N-乙酰基-DL-苯丙氨酸100 mL反应体系中，加入hACY3全细胞2 g，终浓度为1 mmol/L锌离子，2 mmol/L PLP，反应5h后，底物中N-乙酰基-L-苯丙氨酸转化率可达到95％。

摘要译文

关键词：

生物酶法; 催化合成; L-色氨酸; 酶学性质; 基因工程; 发酵液

学位年度：

2015

学位类型：

硕士

学科专业：

制药工程

导师：

焦庆才

中图分类号：

Q814.9[酶的应用];TQ922[发酵法制氨基酸]

学科分类号：

0710[生物学];083602[酶（蛋白质）工程];083604[生物过程工程];081703[生物化工];082202[发酵工程];083606[微生物发酵工程]