- 首页
- 产品推荐个人精选服务科研辅助服务教育大数据服务行业精选服务学科系列服务产品服务
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
- 首页
- 产品服务
- 知识脉络
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
智能检索
肺炎链球菌phpP基因重组表达及其产物PP2C型磷酸酶活性的研究
作
者：
孙颜红
学
位
授
予
单
位：
摘
要：
背景:肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是人类细菌性肺炎主要病原体，也可引起中耳炎和致死性细菌性脑膜炎。肺炎链球菌不产生β-内酰胺酶，但近年来肺炎链球菌临床菌株对β-内酰胺类抗生素耐药率不断升高，青霉素结合蛋白(penicilin binding proteins，PBPs)突变被认为是主要的耐药机制。近年文献报道，肺炎链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶StkP与PBPs非依赖性耐药密切相关且与磷酸酶PhpP形成信号偶联(signaling couple)。信号传导本质是信号分子磷酸化或去磷酸化的过程。因此，证实肺炎链球菌PhpP磷酸酶活性并了解其酶动力学特性可为深入研究肺炎链球菌PBPs非依赖性耐药机制奠定基础。 目的:构建肺炎链球菌磷酸酶编码基因phpP原核表达系统，确定重组表达产物rPhpP磷酸酶活性与类型，了解亚致死量青霉素（青霉素类抗生素代表）和头孢噻肟（头孢菌素类抗生素代表）诱导肺炎链球菌phpP基因mRNA（phpP-mRNA）表达上调的作用。 方法:采用PCR扩增肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因，T-A克隆后测序。采用NCBI数据库中Conserved Domain Database(CDD)软件对上述肺炎链球菌PhpP序列中磷酸酶功能结构域进行预测及分析。以pET42a为表达载体、E.coliBL21 DE3为表达宿主菌，构建phpP基因原核表达系统。采用SDS-PAGE及凝胶图象分析系统检查目的重组表达产物rPhpP的表达情况及其可溶性。采用丝/苏氨酸磷酸酶试剂盒检测rPhpP水解PP2C型磷酸酶底物活性并测定其酶动力学参数Km和Kcat值。采用E-test测定青霉素和头孢噻肟对肺炎链球菌ATCC6306株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。采用实时荧光定量RT-PCR检测亚致死量青霉素和头孢噻肟（1/4和1/8 MIC）作用前后肺炎链球菌ATCC6306株php P-mRNA水平变化。 结果:所克隆的肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank中公布的肺炎链球菌P6株phpP基因序列完全相同。CDD分析结果显示，肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因序列中含有PP2Cc型磷酸酶的结构功能域。所构建的工程菌株E.coli BL21DE3pET42a-phpP能有效表达可溶性的rPhpP。rPhpP能水解PP2C型丝/苏氨酸磷酸酶底物磷酸肽(RRA(pT)VA)且其活性随rPhpP浓度增加而升高，其酶学动力学参数Km和Kcat值分别为277.35μmol/L和0.71S-1。青霉素和头孢噻肟对肺炎链球菌ATCC6306株的MIC分别为0.023和0.032μg/ml。亚致死量青霉素和头孢噻肟（1/4和1/8 MICs）作用后，肺炎链球菌ATCC6306株phpP-mRNA水平显著升高(p＜0.05)。 结论:本研究成功地构建了肺炎链球菌phpP基因原核表达系统并表达了可溶性有活性的产物rPhpP。肺炎链球菌phpP基因表达产物为高活性的PP2C型丝/苏氨酸磷酸酶。亚致死量青霉素和头孢噻肟可诱导phpP基因表达上调，提示在StkP/PhpP信号偶联中PhpP可去磷酸化影响StkP功能，从而在肺炎链球菌PBPs非依赖性耐药中发挥作用。本课题研究结果为后继深入研究StkP/PhpP信号偶联介导肺炎链球菌PBPs非依赖性耐药的分子机制奠定了基础。
关
键
词：
肺炎链球菌; phpP基因; 基因表达; PP2C型磷酸酶; 酶活性
学
位
年
度：
2015
学
位
类
型：
硕士
学
科
专
业：
临床检验诊断学
导
师：
孙爱华
中
图
分
类
号：
R378.12;R378.1[球菌]
学
科
分
类
号：
100103[病原生物学];100601[中西医结合基础医学]
D
O
I：
10.7666/d.Y2914134
相关文献
暂无数据
相关学者
暂无数据
二级参考文献
(--)
参考文献
(--)
共引文献
(0)
本文献
同被引文献
(0)
引证文献
(--)
二级引证文献
(--)